EB病毒誘發(fā)淋巴增殖性疾病的原因及機制研究進展

肖夢瑤，辛小娟

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科，重慶 400016

EBV 相關淋巴增殖性疾病（EBV-LPD）不是特指一種疾病，而是一類疾病的總稱，近年相關疾病譜已經(jīng)從傳染性單核細胞增多癥（IM）擴展到淋巴瘤、白血病等惡性腫瘤［1］。根據(jù)其惡性程度與感染后增殖細胞類型分為反應性增生、B 細胞相關LPD、T/NK 細胞相關LPD。除IM 表現(xiàn)為自限性，嚴重EBV-LPD 臨床進展迅速，患者常死于LPD 的進展、免疫下降繼發(fā)的機會性感染、多器官功能衰竭，現(xiàn)在的治療方案多采取多藥聯(lián)合化療，但效果十分有限，迫切地需要研究新的治療手段［2］。多項研究報道高EBV 定量對于EBV-LPD 的預后有著不良影響，降低病毒定量可提高EBV-LPD 患者生存率，但到目前還沒有研究出被批準用于人類的抗EBV 藥物。EBV是一種以人類為惟一宿主的皰疹病毒，自1964 年，EBV 被Epstein 和Barr 從伯基特淋巴瘤中分離出來，而后的50 年里其致癌性得到了充分的認識，但到目前為止其在EBV-LPD 疾病中所扮演的角色仍不完全清楚。研究［1］發(fā)現(xiàn)，EBV 通過下調抗原的表達逃避免疫監(jiān)視，從而在宿主體內建立難以清除的終身潛伏感染，其潛伏期病毒蛋白可擾亂免疫功能，激活多條腫瘤信號通路誘發(fā)宿主細胞異常增殖轉化。明確EBV-LPD 的原因及機制，或可為預防和治療EBV-LPD 提供新的治療方向和靶點。 現(xiàn)將EBV-LPD 發(fā)生的原因及發(fā)病機制的研究進展綜述如下。

1 EBV誘發(fā)LPD的原因

EBV 在人體內有裂解感染和潛伏感染兩種狀態(tài)。裂解感染狀態(tài)下，病毒可進行完整的基因復制和病毒蛋白的表達，產(chǎn)生大量子代病毒，誘發(fā)免疫反應使受染細胞裂解。潛伏感染時，病毒不能復制產(chǎn)生具有傳染性的子代病毒顆粒，但可逃避免疫清除，從而在宿主淋巴組織內建立起終身潛伏感染。當機體免疫功能下降時，潛伏期EBV 可重新激活進入裂解期。特殊的雙相生命周期使得病毒無法被徹底清除從而誘發(fā)LPD。

1.1 EBV 裂解感染 EBV 主要通過唾液傳播，進入人體后先感染口咽黏膜上皮細胞，此期感染在大多數(shù)個體中是無癥狀的，這種在口咽黏膜上皮的溶解復制是為了有效地將病毒釋放到唾液中，從而將EBV 傳遞給新的宿主實現(xiàn)體外傳播［3］。上皮細胞裂解后，釋放入血的EBV 通過gp350/220 抗原附著于B 細胞表面CD21 受體上，在病毒糖蛋白gH-gL-gp42與B細胞表面人類白細胞抗原（HLA）-II類受體作用下通過胞吞或包膜融合作用進入胞內［4］。入胞后病毒誘導產(chǎn)生兩種蛋白質（Rta 和Zta）作為轉錄激活劑，促進病毒DNA 轉錄、翻譯形成新的結構蛋白，與EBV 基因一起裝配成具有傳染性的子代病毒。細胞內病毒大量擴增，誘導受染B 細胞形成淋巴細胞識別膜抗原，刺激NK 細胞及EBV 特異性細胞毒性T 細胞（CTL）擴增，攻擊受染細胞使之裂解，細胞內病毒釋放入血后再感染新的細胞從而實現(xiàn)體內傳播［5］。

1.2 EBV 潛伏感染 免疫活性人群中，原發(fā)感染的裂解期大部分受染細胞及病毒可被順利清除，僅部分EBV 在宿主淋巴組織中建立起終身潛伏感染。潛伏期被認為與腫瘤性疾病的關系更密切，這種裂解期向潛伏期的轉變過程尚未完全明確，目前比較認可的是根據(jù)B 細胞建立的潛伏期模型。

EBV 感染幼稚B 細胞后先表現(xiàn)為潛伏Ⅲ型，此期病毒表達 6 種核蛋白（EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBN3B、EBNA3C、EBNALP），3 種潛伏膜蛋白（LMP1、LMP2A、LMP2B），2 種非編碼小 RNA（EBER1、EBER2）和 BamHI-A 片段右向轉錄產(chǎn)物（BARTs）。此期受染細胞免疫原性強，易被CTL免疫反應消除，故這種病毒基因表達模式更常見于免疫系統(tǒng)受到嚴重抑制的患者［1］。感染的B 細胞進入生發(fā)中心，EBV 為逃避免疫下調抗原表達，表現(xiàn)為潛伏Ⅱ型，此期EBV 蛋白表達僅限于EBNA1、LMP1、LMP2 和 EBER。在病毒蛋白的作用下，這些細胞中的一部分分化為記憶B 細胞，線性病毒DNA 環(huán)化，作為細胞核附加體游離在胞質中，此時多表現(xiàn)為潛伏0/Ⅰ型（0 型只能檢測到EBER，1 型還表達EBNA1），易逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，靜息記憶B 細胞釋放到循環(huán)中，成為病毒長期潛伏儲存庫［6］。此期EBV 雖不能產(chǎn)生感染性子代病毒顆粒，但可在S 期隨著細胞DNA 復制擴增從而傳遞至分裂分化的子代細胞，從而避免因為機體細胞的正常凋亡機制導致體內的病毒隨之死亡。

1.3 EBV 潛伏期重激活 裂解期的EBV 基因表達有助于病毒感染新的細胞和宿主，而潛伏期的建立對于病毒逃避免疫監(jiān)視從而在宿主體內的終生存活至關重要。正常免疫環(huán)境下，潛伏期EBV 和免疫系統(tǒng)維持在平衡狀態(tài)，當機體免疫功能下降時潛伏期EBV 可重激活進入裂解期，再次引起急性感染癥狀。潛伏期時BZLF1 編碼的Zta 與BRFL1 編碼的Rta 受到高度抑制，潛伏期的重新激活取決于相關區(qū)域的啟動［7］。環(huán)狀EBV 通過修飾病毒基因組中特定DNA 序列的去甲基化，使這兩種基因過度表達，調節(jié)潛伏狀態(tài)的EBV 進入裂解周期［8］。免疫功能恢復后機體與病毒可再次達到平衡狀態(tài)，但部分患者會出現(xiàn)難以控制的反復重激活，引起持續(xù)的病毒血癥，引起這種現(xiàn)象的原因尚不明確，考慮與患者自身存在的原發(fā)免疫缺陷有關。EBV 在潛伏狀態(tài)下的復制不依賴于DNA 聚合酶，而是通過核抗原調控DNA 的復制，使其對于現(xiàn)在常用的無環(huán)核苷類似物（如更昔洛韋）及焦磷酸鹽類似物（如磷鉀酸鈉）的治療無效。針對EBV 可重激活這一特點，當前有學者提出的誘導EBV 進入裂解感染，從而使抗病毒治療有效將成為一個新的思路。PIERLUIGI 等［9］使用組蛋白乙?；敢种苿┞?lián)合纈更昔洛韋治療EBV 陽性的復發(fā)難治淋巴瘤取得了一定療效，且無嚴重不良反應發(fā)生。

2 EBV誘發(fā)LPD的機制

EBV 感染人體后誘發(fā)LPD 的機制可分為兩個方面。一方面是病毒引起機體免疫紊亂，主要表現(xiàn)為NK 細胞和CTL 功能不全和淋巴細胞活性過高。EBV 通過病毒蛋白干擾抗原遞呈細胞，活化的T 淋巴細胞刺激巨噬細胞分泌超量的細胞因子，導致全身炎癥反應及淋巴細胞持續(xù)的異?；罨Ａ硪环矫娌《就ㄟ^潛伏期蛋白激活多條腫瘤信號通路，抑制宿主細胞凋亡，誘導淋巴細胞異常增殖轉化，從而導致LPD的發(fā)生。

2.1 EBV 引發(fā)機體免疫紊亂 EBV 感染人體后，細胞免疫對清除病毒感染至關重要。NK 細胞在原發(fā)感染后4～6 周大量擴增，在病程早期CTL 特異性免疫還未建立時起重要作用。在抗原呈遞細胞的作用下CD4+T細胞、CD8+T細胞、γδT細胞、遲發(fā)型超敏反應T細胞等激活，CTL大量擴增［10］。CTL作為控制病毒擴增及淋巴細胞增殖的主力，與受染細胞接觸可形成免疫突觸，通過淋巴毒素、穿孔素、顆粒酶等誘導靶細胞裂解，也可通過腫瘤壞死因子途徑誘導受染細胞凋亡［5］。CTL 擴增可導致大量炎癥因子釋放，引起發(fā)熱、肝脾腫大、淋巴結腫大、咽扁桃體炎等癥狀，即傳染性單核細胞增多癥。

2.1.1 EBV 引起NK 細胞和CTL 功能異常 在正常情況下，NK 細胞和CTL 擴增，清除病毒感染細胞的同時去除抗原刺激從而調節(jié)炎癥反應，原發(fā)感染的癥狀會逐漸消退。但當NK 細胞和CTL 病毒清除功能受損時，靶細胞死亡機制受損，細胞毒性細胞持續(xù)受到刺激，引起Th1、Th2細胞因子分泌比例失調，產(chǎn)生大量如 IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α 等 Th1 類細胞因子，激活巨噬細胞，CTL與抗原提呈細胞之間負反饋機制失調，級聯(lián)放大引起全身細胞因子風暴，嚴重時出現(xiàn)噬血細胞綜合征［11］。在病毒的誘導下，增殖轉化的受染靶細胞也失去有效的免疫監(jiān)控，最終導致癌變。EBV 感染后通過何種途徑影響NK 細胞和 CTL 的功能尚在研究中，有研究［12-13］報道，CAEBV、EBV-HLH、EBV 相關淋巴瘤患者的 CTL、NK 細胞數(shù)量減少且有功能障礙。

2.1.2 EBV 感染 T/NK 細胞 EBV 是嗜淋巴細胞的病毒，它不僅感染B 細胞，也會感染T/NK 細胞。部分學者認為，嚴重的EBV-LPD 可能和EBV 感染T、NK 細胞有關［14］。但當前沒有研究證明，EBV 是引起患者T/NK 細胞等數(shù)量下降的直接原因，且目前EBV 感染T/NK 細胞的機制尚不完全明了，T/NK細胞上CD21 受體和人白細胞抗原（HLA）都檢測不到。一種假設是帶有病毒株的T/NK 細胞是由淋巴祖細胞和原始T 淋巴細胞分化而來的，后兩者表達CD21受體從而可感染EBV。有研究［15］對CAEBV 患者的受染細胞類型進行檢測，發(fā)現(xiàn)存在T/NK 細胞的雙重感染。另一種假設是EBV 通過受染上皮細胞或B 細胞傳播給T/NK 細胞，T/NK 細胞在接觸受染細胞時通過突觸轉移獲得CD21 分子從而感染EBV［16］。感染 EBV 的 T/NK 細胞通常表達細胞毒性分子，在機體免疫反應中起清除病原體的作用，支持它們是由EBV 感染的B 細胞激活的毒性T/NK細胞。

2.1.3 EBV 病毒蛋白抑制NK 細胞和CTL 功能有研究［17］報道，EBNA-1 中有 1 個甘氨酸—丙氨酸重復區(qū)域，此區(qū)域能影響泛素化底物和蛋白酶體的相互作用，且該區(qū)域可以抑制缺陷核糖體產(chǎn)物，使得人主要組織相容性復合體MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ合成受限，從而干擾EBNA-1 抗原加工和呈遞，影響CTL對EBNA-1 抗原的免疫應答。LMP1 被發(fā)現(xiàn)有兩個與p15E（一種含有免疫抑制肽鏈序列的膜蛋白）高度同源的多肽，可強烈抑制CTL 和NK 細胞的活性，減少干擾素的合成，從而影響T 細胞識別EBV 抗原［18］。EBV 編碼的小RNA（EBER）在各類細胞中豐富表達，主要用于病毒的臨床檢測。有研究報道，EBERs 可誘導IL-10 的產(chǎn)生，從而抑制CTL 功能。HLA-A 和HLA-B 通過與活化型殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIR）結合使NK細胞活化，而HLA-C則與抑制型KIR 結合抑制NK 細胞殺傷效應，EBV 的BCRF1編碼的蛋白可下調HLA-A和HLA-B的表達，但不能下調HLA-C 的表達，從而抑制NK 細胞的活化。EBV 早期蛋白BFRF1 被證實能通過抑制IRF3的激活抑制IFN-β 的活性，在破壞宿主固有免疫中發(fā)揮關鍵作用［19］。

進一步研究EBV 感染T/NK 細胞的方式及病毒影響免疫細胞功能的方式，有助于重建機體自身免疫。當前使用CTL 治療EBV-LPD 的作用及安全性已經(jīng)得到了肯定［20］，但制備耗時較長，還需探究如何精簡其制備工藝，如果能證明輸注供體來源的CTL的有效性及安全性，將大大提前治療時間［21］。

2.2 EBV 潛伏期蛋白誘導淋巴細胞增殖轉化 EBV 為逃避免疫監(jiān)視通過減少編碼抗原的免疫原性進入潛伏期，然而病毒想要永久存在宿主體內，除了必須避免被機體免疫系統(tǒng)清除，同時需要避免因為正常的宿主細胞凋亡更替機制而隨之死亡。除了適時進入裂解期產(chǎn)生有傳染性的子代病毒顆粒，潛伏期病毒蛋白可驅動多條腫瘤相關信號通路，從而誘導細胞增殖、抑制細胞的凋亡、誘導細胞永生化和轉化。研究EBV 激活的腫瘤信號途徑可為新的治療方案提供候選靶點。

2.2.1 EBV 潛伏期核蛋白誘導宿主淋巴細胞增殖轉化 EBV 編碼的核抗原EBNA-1 在病毒基因組的維持和復制中起著關鍵作用，它將潛伏期EBV DNA 附加體束縛在宿主細胞染色質上，以確保病毒DNA 在宿主細胞有絲分裂期間復制。EBNA1 也是EBV 誘導宿主細胞增殖和永生化的重要因素，它可以上調凋亡抑制蛋白Survivin 的表達，促 BCL-6、CD10 的增加，使 B 細胞異常轉錄，導致伯基特淋巴瘤的發(fā)生［22］。正常細胞會通過DNA損傷應答來維持基因組完整性和正確性，以減少惡性的表位突變，是極其關鍵的免疫監(jiān)控途徑。EBNA1 被證明可通過結合P53 調節(jié)因子來穩(wěn)定P53 從而對抗正常的 DNA 損傷應答機制［23］。EBNA2 可誘導 LMP1 和 LMP2 表達，也可模仿 Notch 通路，與 RBP-JK/CBF1 結合，激活 MYC 癌基因，上調抗凋亡促生存BCL-2 家族BFL-1/A1 蛋白，下調誘導死亡的凋亡效應蛋白 BIK［24］。EBNA3A 和 3C 常協(xié)同作用，通過使轉錄起始位點TSS 沉默從而下調促凋亡的細胞基因，如BCL2L11（編碼促凋亡的僅含BH3 的蛋白BIM）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（P16ink 4a、P15ink 4b）［25］。也有研究［26］證明，EBNA3A 也可單獨抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶39 基因（STK39），導致富含脯氨酸—丙氨酸的激酶（SPAK）的表達喪失，抑制細胞凋亡。EBNA3B是EBV 編碼的腫瘤抑制因子，其失活可促進免疫逃避和病毒驅動的淋巴瘤的發(fā)生［27］。EBNA-LP 是EBNA2 的轉錄輔激活因子，對B 細胞的轉化必不可少［28］。

2.2.2 EBV 潛伏期膜蛋白誘導宿主淋巴細胞增殖轉化 EBV 編碼的膜蛋白LMP1 被認為是EBV 最主要的癌蛋白，它可以模擬CD40 誘導的信號通路，通過其兩個細胞質信號結構域（CTAR1 和CTAR2）組成性模擬細胞腫瘤壞死因子信號，主要激活NF-κB、JNK、P38 MAPK、JAK-STAT、PI3K-AKT 等信號通路，上調BCL-2 促生存蛋白和其他靶基因的表達［29］。有研究［30］報道，LMP1 可通過激活轉錄因子AP1 促進程序性死亡受體配體1（PD-L1）的超表達來塑造腫瘤微環(huán)境。LMP1 還可上調活化誘導胞苷脫氨酶使MYC 過度表達，誘導腫瘤發(fā)生。LMP2A可模仿BCR 受體并提供關鍵的持續(xù)細胞存活信號，主要激活PI3K-AKT-mTOR 和MAPK 信號轉導通路，促進 B 細胞存活［1］。LMP2B 可增強 LMP1 的表達，減弱LMP2A 功能，防止EBV 從潛伏到裂解復制的轉換。

2.2.3 EBV 非編碼小RNA（EBER）誘導淋巴細胞增殖轉化 既往認為，EBER 對EBV 誘導的B 淋巴細胞轉化不是必需的，但現(xiàn)在有研究［10］發(fā)現(xiàn)EBER可通過激活PI3K-AKT 通路和抑制細胞周期抑制劑P21、P27 來促進淋巴細胞的增殖。也有研究［31］報道，EBER 可誘導體外鼻咽癌細胞株產(chǎn)生胰島素樣生長因子1，從而促進癌細胞的生長。

2.2.4 BamHI-A 片段右向轉錄產(chǎn)物誘導淋巴細胞增殖轉化 EBV 編碼數(shù)十種BART miRNA，在裂解周期中高水平表達，可能是為了保持宿主細胞的存活以確保病毒的有效復制。在EBV 相關的腫瘤患者癌細胞中及在以伯基特淋巴瘤衍生的細胞系為模型進行的體外研究中均檢測到EBV miRNA 的過度表達，miRNA 通過與細胞促凋亡蛋白（如僅含BH3的 BIM、PUMA 和 BID 以及 BAK）的結合從而抗凋亡、促淋巴細胞增殖和轉化［32］。EBV-miR-BART11和 EBV-miR-BART17-3p 分 別 抑 制 FOXP1 和PBRM1，增強 PD-L1 的轉錄，從而促進 EBV 相關淋巴瘤的發(fā)生［33］。

綜上所述，EBV 感染人體淋巴細胞后，其特殊的雙相生命周期使得病毒可逃避免疫清除，在宿主淋巴組織內建立起終身潛伏感染，從而誘發(fā)EBV-LPD 的發(fā)生。EBV 可通過下調抗原表達逃避免疫監(jiān)視、影響CTL 及NK 細胞免疫功能、抑制細胞凋亡及誘導細胞增殖轉化，在LPD 的發(fā)生中起重要作用。深入研究EBV 在LPD 發(fā)病中的作用及機制，可為有效抗病毒藥物的研發(fā)提供新的靶點，對改善EBV-LPD患者的預后具有重要意義。