骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜組織差異表達(dá)基因生物學(xué)功能及與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系分析

馮重陽，姬振偉，王志學(xué)，張智翔，王銀歌，2，吳鵬 ，丁勇

1 空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，西安 710038；2 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第922醫(yī)院骨科

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，累及整個關(guān)節(jié)包括滑膜炎癥、軟骨下骨硬化、退變和骨贅形成，最終表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和功能障礙［1］。隨著全球人口老齡化加劇，OA 患病人數(shù)不斷增加，影響著約3.8%的人口，造成了巨大的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。目前OA 發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，滑膜炎癥是OA 的啟動環(huán)節(jié)，是導(dǎo)致患者出現(xiàn)疼痛和臨床癥狀的一個關(guān)鍵因素［3］。AYRAL 等［4］采取連續(xù)關(guān)節(jié)鏡檢查證實(shí)早期OA 存在滑膜炎癥，它是OA癥狀和疾病發(fā)展的一個重要病理環(huán)節(jié)?；ぱ装Y由先天免疫細(xì)胞參與調(diào)控。CD4+和CD8+T 細(xì)胞以及先天免疫系統(tǒng)的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的異常都可能導(dǎo)致OA 進(jìn)行性加重［5-7］，在疾病惡化中起重要作用。因此探究OA 與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，為揭示OA 發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

生物信息學(xué)作為一門新興學(xué)科，被用于快速、大規(guī)模地獲取生物信息，揭示疾病的分子機(jī)制。本研究從Gene Expression Omnibus 數(shù)據(jù)庫（GEO）選取與OA 相關(guān)的基因芯片GSE55235、GSE55457、GSE1919和GSE12021，采用Meta 分析的方法篩選OA 和正常樣本滑膜組織的差異表達(dá)基因（DEGs），對DEGs 進(jìn)行生物學(xué)功能分析，并構(gòu)建蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)篩選核心差異表達(dá)基因，通過CIBERSORT 算法分析正常和OA 關(guān)節(jié)滑膜組織之間22 種免疫細(xì)胞浸潤比例，以及核心差異表達(dá)基因與免疫細(xì)胞百分比的相關(guān)性，為探討OA 的免疫機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 OA 數(shù)據(jù)集及其來源 在 GEO（http：//www.ncbi. nlm. nih. gov/geo）公共數(shù)據(jù)庫中，檢索與OA相關(guān)的基因芯片，符合以下條件：基因芯片為基因組mRNA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)譜；包含OA 和正常對照患者滑膜組織的檢測數(shù)據(jù)；排除藥物干預(yù)或轉(zhuǎn)染的數(shù)據(jù)集。根據(jù)篩選條件獲得2 個平臺的4個 mRNA 數(shù)據(jù)集，分別為 GSE55235、GSE55457、GSE1919 和 GSE12021，共有 69 個樣本，其中包含35 個 OA 和 34 個 健 康 對 照 樣 本 。GSE55235、GSE55457 和 GSE12021 所用平臺為 GPL96（Affymetrix Human Genome U133A Array），GSE1919 所 用平 臺 為 GPL91（Affymetrix Human Genome U95A Array）。GSE55235 數(shù)據(jù)集中OA 關(guān)節(jié)滑膜組織樣本 10 個、正常關(guān)節(jié)滑膜組織 10 個；GSE55457 數(shù)據(jù)集中OA 關(guān)節(jié)滑膜組織樣本10 個、正常關(guān)節(jié)滑膜組織10 個；GSE12021 數(shù)據(jù)集中OA 關(guān)節(jié)滑膜組織樣本 10 個、正常關(guān)節(jié)滑膜組織 9 個；GSE1919 數(shù)據(jù)集中OA 關(guān)節(jié)滑膜組織樣本5 個、正常關(guān)節(jié)滑膜組織5 個。

1.2 OA 與正常關(guān)節(jié)滑膜組織DEGs 篩選 應(yīng)用在線分析平臺 NetworkAnalyst（https：//www. networkanalyst.ca/）對四個數(shù)據(jù)集原始數(shù)據(jù)整合分析［8］。首先將每個數(shù)據(jù)集上傳、注釋和處理，而后將四個數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合歸一化處理，采用Fisher's分析方法篩選DEGs（Combined P＜0.05，|logFC|＞2）。對上調(diào)和下調(diào)前50的DEGs進(jìn)行層次聚類，使用R軟件的pheatmap軟件包繪制每個數(shù)據(jù)集的熱圖。

1.3 OA 與正?；そM織DEGs 的生物學(xué)功能分析 GO 分析［9］包括細(xì)胞成分（CC）、生物學(xué)過程（BP）和分子功能（MF）。KEGG 是一個關(guān)于基因組、酶途徑和生物化學(xué)物質(zhì)的在線數(shù)據(jù)庫［10］。 應(yīng)用DAVID 在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf. gov/，版本6.8）進(jìn)行基因本體功能及信號通道富集分析，以每個條目里基因數(shù)＞10，P＜0.05作為篩選條件。

1.4 OA與正常關(guān)節(jié)滑膜組織核心差異表達(dá)基因篩選 將DEGs 上傳至STRING 在線分析平臺（https：//string-db. org/，版本 11.5［11］）構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape3.6.8 軟件可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用 MCODE 插 件 以 Degree Cut-off =2，Node Score Cutoff =0.2，K-Core =2，Max. Depth = 100 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到網(wǎng)絡(luò)中聯(lián)系最緊密的模塊，展示排名前3的模塊，選取每個模塊中得分最高的基因?yàn)楹诵牟町惐磉_(dá)基因［12］。

1.5 核心差異表達(dá)基因與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析 通過CIBERSORT算法對NetworkAnalyst分析平臺矯正、整合得到的四個數(shù)據(jù)集的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，得到22 種免疫細(xì)胞在每個樣本中所占比例。使用vioplot 軟件包繪制小提琴圖。使用ggstatsplot軟件包對篩選的核心差異表達(dá)基因水平與22 種免疫細(xì)胞百分比進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 OA 與正常關(guān)節(jié)滑膜組織的DEGs 及其生物學(xué)功能 共篩選得到1 418 個OA 與正常滑膜組織的DEGs，其中上調(diào) 692 個，下調(diào) 726 個。GO 功能分析結(jié)果顯示，DEGs 主要富集在酰胺結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合、整合素結(jié)合、核受體結(jié)合等。KEGG 分析結(jié)果顯示，DEGs 主要參與人類T細(xì)胞白血病病毒感染、TNF信號通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥中的蛋白聚糖、愛潑斯坦-巴爾病毒感染等。

2.2 OA 與正常關(guān)節(jié)滑膜組織核心差異表達(dá)基因通過Cytoscape 軟件構(gòu)建了一個包含820 個節(jié)點(diǎn)、2 212 條邊的 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。RPL37A、MYC 和細(xì)胞分裂周期蛋白20（CDC20）可能是OA 的核心差異表達(dá)基因。

2.3 OA和正常關(guān)節(jié)滑膜組織核心差異表達(dá)基因與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性 與正常關(guān)節(jié)滑膜組織相比，OA 患者關(guān)節(jié)滑膜組織中記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞、輔助性T 細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞所占比例較多，而靜息記憶性CD4+T 細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和活化肥大細(xì)胞所占比例較少（P 均＜0.05）。核心差異表達(dá)基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析顯示，RPL37A 與γδT 細(xì)胞、M2 巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞百分比呈正相關(guān)（r 分別為0.36、0.29、0.25，P 均＜0.05），與初始 B 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、記憶 B 細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞百分比呈負(fù)相關(guān)（r 分別為-0.38、-0.40、-0.37、-0.32、-0.35、-0.25，P 均＜0.05）。MYC 與靜息記憶性T 細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞百分比呈正相關(guān)（r分別為0.52、0.37、0.35、0.34、0.29，P均＜0.05），與記憶 B 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞、輔助性T 細(xì)胞百分比呈負(fù)相關(guān)（r 分別為-0.49、-0.48、-0.4、-0.27、-0.27，P 均＜0.05）。CDC20 與 M2 巨噬細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、輔助性T 細(xì)胞百分比呈正相關(guān)（r 分別為0.59、0.30、0.25，P 均＜0.05），與活化肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、初始B 細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、靜息記憶性T 細(xì)胞百分比呈負(fù)相關(guān)（r 分別為-0.40、-0.35、-0.34、-0.26、-0.25，P均＜0.05）。

3 討論

OA 是常見的關(guān)節(jié)疾病，主要累及全身大關(guān)節(jié)，其中膝關(guān)節(jié)是最常見的累及部位，影響患者的日常生活，導(dǎo)致殘疾［13］。但目前還沒有可以有效預(yù)防或逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)損傷的治療手段，終末期患者只能行關(guān)節(jié)置換。近年，越來越多的證據(jù)表明，OA 的早期到晚期始終伴隨著滑膜炎癥［14］，且滑膜炎癥會對鄰近的骨和軟骨造成損害，加重疾病進(jìn)展［4，14］。此外，滑膜炎癥中免疫細(xì)胞浸潤在OA 的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用［15］。因此，探討OA 與機(jī)體免疫之間的關(guān)系，有助于進(jìn)一步明確OA發(fā)病機(jī)制。

本研究通過篩選得到四個基因芯片，使用NetworkAnalyst 分析平臺整理、合并四個OA 關(guān)節(jié)滑膜組織基因表達(dá)芯片，隨后得到1 418個DEGs，其中上調(diào)692個、下調(diào)726個。GO富集分析結(jié)果顯示DEGs主要涉及酰胺結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合、整合素結(jié)合、核受體結(jié)合等。KEGG 富集通路顯示主要涉及人類T 細(xì)胞白血病病毒感染、TNF 信號通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥中的蛋白聚糖、愛潑斯坦-巴爾病毒感染等相關(guān)通路。GO 富集分析表明，差異基因的功能與OA 的調(diào)控密切相關(guān)，糖胺聚糖的減低會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的減少以及組織的降解，致使關(guān)節(jié)功能喪失［16］，整合素作為軟骨細(xì)胞表面受體，介導(dǎo)軟骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，多種整合素及其配體是OA 疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物［17］。KEGG 富集分析表明，差異基因的相關(guān)通路除了與病毒感染性免疫反應(yīng)相關(guān)外，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、TNF 信號通路中基因富集較多，這些通路參與OA滑膜炎癥因子滲出、免疫細(xì)胞浸潤的過程［18］。TNF信號通路在OA 的發(fā)生機(jī)制中已被廣泛研究，它可通過調(diào)控NF-κB 和MAPK 兩條關(guān)鍵信號通路減少炎癥因子的分泌，從而延緩OA的進(jìn)展［19］。

本研究通過構(gòu)建DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)，利用MCODE 插件對PPI 進(jìn)行分析，根據(jù)得分篩選出RPL37A、MYC、CDC20 為 OA 發(fā)展過程中的核心差異表達(dá)基因。RPL37A 是編碼核糖體蛋白的基因［20］。本研究顯示RPL37A 在正常人中高表達(dá)，與MI等［21］的分析結(jié)果一致。女性一直被認(rèn)為是OA 發(fā)生的危險因素，YANG 等［22］的研究發(fā)現(xiàn)在女OA患者中 RPL37A 表達(dá)降低，確定了 RPL37A 是女性 OA 的核心基因。在斑馬雀中，雌性表達(dá)RPL37A 的細(xì)胞總數(shù)低于雄性，并且隨著年齡的增長，雌性體內(nèi)RPL37A 反而下降，這一結(jié)果有可能解釋為什么OA經(jīng)常發(fā)生在老年女性［23］。MYC（也稱為c-Myc）屬于MYC 原癌基因家族，是一種轉(zhuǎn)錄因子，定位于8q24，用來調(diào)控細(xì)胞周期、生長、凋亡、分化、代謝等核心過程［24］。FISCH 等［25］研究確定了 MYC 可能是 OA 發(fā)病的核心基因。MYC 通過消除人體內(nèi)和體外腎器官中的炎癥和纖維化，從而降低炎癥反應(yīng)［26］。MAPK信號通路參與了人類OA 軟骨細(xì)胞的凋亡和促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)［27］，其與MYC 密切相關(guān)。WU 等［28］研究證明，MYC 可以通過抑制MAPK 信號通路，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，來阻止OA 的進(jìn)展，本研究與文獻(xiàn)中結(jié)果一致，證實(shí)了MYC在OA 患者滑膜組織樣本中表達(dá)降低，致使炎癥發(fā)生。CDC20 通常被認(rèn)為是致癌因子，主要通過活化APC 形成一種E3 泛素連接酶復(fù)合物APCCDC20，參與其下游底物的降解過程，來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等，與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，CDC20 在OA 關(guān)節(jié)滑膜組織中高表達(dá)，提示CDC20可能在OA 發(fā)生中起重要作用，這在以往研究中未見報道。其原因可能是CDC20 與細(xì)胞周期密切相關(guān)，而細(xì)胞周期的異常調(diào)節(jié)與OA 的發(fā)展密切相關(guān)［29］。

慢性滑膜炎的免疫細(xì)胞浸潤以巨噬細(xì)胞為標(biāo)志。OA 患者滑膜中T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的含量高于健康患者［3］。ROSSHIRT 等［15］研究表明，OA 出現(xiàn)免疫細(xì)胞浸潤，包括CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞。為了進(jìn)一步了解OA 滑膜炎癥中免疫細(xì)胞浸潤情況，我們使用CIBERSORT 算法進(jìn)行了全面評估，CIBERSORT 是一個利用RNA-seq 數(shù)據(jù)評估免疫細(xì)胞表達(dá)的分析工具，可以用于深入了解正常和OA 關(guān)節(jié)滑膜組織中的免疫微環(huán)境。通過對比發(fā)現(xiàn)與正常關(guān)節(jié)滑膜組織相比，OA 患者關(guān)節(jié)滑膜組織中記憶B 細(xì)胞、漿細(xì)胞、輔助性T 細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞比例較高，而靜息記憶性CD4+T 細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和活化肥大細(xì)胞比例較少，與GE 等［30］部分結(jié)果一致。當(dāng)滑膜組織中靜息肥大細(xì)胞的浸潤比例增高時，可導(dǎo)致OA 患者的軟骨結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷［31］。輔助性T 細(xì)胞會產(chǎn)生分解代謝細(xì)胞因子包括IL-2、IFN-γ、TNF-α，隨著滑膜組織中浸潤過多的輔助性T 細(xì)胞，其分泌的分解代謝細(xì)胞因子也會隨之增加，導(dǎo)致OA的進(jìn)展［32］。DE LANGE-BROKAAR 等［3］發(fā)現(xiàn)，漿細(xì)胞也可能影響著OA的進(jìn)展。

我們進(jìn)一步分析了核心差異表達(dá)基因與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RPL37A與γδT細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞呈正相關(guān)，與初始B 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。MYC 與靜息記憶性CD4+T 細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞所占比例呈正相關(guān)，與記憶B 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞、濾泡輔助性T 細(xì)胞所占比例呈負(fù)相關(guān)。CDC20 與M2 巨噬細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、濾泡輔助性T 細(xì)胞呈正相關(guān)，活化肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、初始B 細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、靜息記憶性CD4+T 細(xì)胞所占比例呈負(fù)相關(guān)。說明核心差異表達(dá)基因與免疫細(xì)胞的浸潤關(guān)系密切。

綜上所述，OA 關(guān)節(jié)滑膜組織DEGs 共1 418個，其中692 個上調(diào)、726 個下調(diào)，基因本體功能主要有酰胺結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，參與人類T 細(xì)胞白血病病毒感染、TNF 信號通路等；OA 的核心差異表達(dá)基因是RPL37A、MYC、CDC20；記憶B 細(xì)胞、漿細(xì)胞等可能參與OA 關(guān)節(jié)滑膜炎癥的調(diào)控，RPL37A、MYC、CDC20 與免疫細(xì)胞浸潤關(guān)系密切。本研究加深了對OA 關(guān)節(jié)滑膜炎癥免疫分子機(jī)制的認(rèn)識，可能為OA 早期診斷及治療提供潛在標(biāo)志物，然而，這些還需要臨床以及進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。