抗菌肽抗菌活性評價及應用研究進展

李洪宇，劉揚科，何 濤，郭柑彤，吳玉臣，陳華麗

（1.中農穎泰林州生物科園有限公司，河南 林州 456550；2.農業(yè)農村部飼用抗生素替代技術重點實驗室，河南 林州 456550；3.河南牧業(yè)經濟學院，鄭州 450046；4.西南科技大學，四川 綿陽 621000）

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一種具有抗菌活性的小分子多肽，是維護宿主細胞防御外來病原菌感染的第一防御屏障?？咕囊话阌?0～50 個氨基酸組成，存在于各種動物、植物、細菌、病毒和人體當中，來源非常廣泛，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分。目前在APD 數(shù)據(jù)庫（http://aps.unmc.edu/AP/main.php）中共收錄3 250 種抗菌肽[1]，按照來源不同，可分為動物源抗菌肽（如天蠶素和蛙皮素）、植物源抗菌肽（如硫堇和植物防御素）、微生物源抗菌肽（如腸桿菌肽和枯草菌肽）及人工抗菌肽等。

抗菌肽最廣泛和重要的應用是作為抗菌物質使用，但不同于抗生素，抗菌肽具有廣泛的抗菌活性，其抗菌機制主要為：帶正電荷的抗菌肽通過靜電作用直接與帶負電荷的細菌細胞膜結合，通過膜穿孔作用造成細菌死亡。另外，部分抗菌肽還具有抑制細胞壁、DNA、RNA 和蛋白質合成的胞內損傷作用機制。總之，多作用機制和多作用靶點的抗菌特性使抗菌肽在應用過程中產生耐藥性的概率較低。所以，在抗生素耐藥和食品安全的背景下，抗菌肽抗菌效果受到了從業(yè)人員的熱切關注。另外，由于抗菌肽存在一些特殊的二、三級結構，使部分抗菌肽對高溫、酸、堿及胃蛋白酶和胰蛋白酶具有良好的抵抗力[2]，因此在飼料加工過程和動物應用中幾乎不受影響。隨著對抗菌肽的深入探索與開發(fā)，人們對抗菌肽分子結構及功能機理的認知也越來越豐富。作為新型的抗生素替代品，抗菌肽結構明確，機理清晰，作用確實[3-5]，本文重點概述了抗菌肽的抗菌活性的評價及其在養(yǎng)殖業(yè)中的應用，以期為抗菌肽在替代抗生素推廣應用方面提供參考依據(jù)。

1 抗菌肽抗菌活性評價

作為抗菌能力最接近抗生素的小分子活性多肽，抗菌肽抗菌譜廣，可高效防控臨床中常見致病菌如金黃色葡萄球菌、產氣莢膜梭菌等革蘭氏陽性菌和大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性菌引起的細菌性疾病[6]，且由于其獨特的物理性抗菌機制降低了細菌耐藥性的產生概率，在替代傳統(tǒng)抗生素方面具有較大優(yōu)勢。

在評價抗菌肽抗菌活性時，通過觀察計算抑菌圈、抑菌率和最小抑菌濃度（MIC）能夠客觀地反映抗菌肽的體外抗菌效果，從而為進一步的體內試驗提供理論依據(jù)。汪以真等[7]采用微量肉湯稀釋法研究發(fā)現(xiàn)，天蠶素對大腸桿菌K88 和ATCC25922 的MIC 分別為0.25 mg·L-1和0.5 mg·L-1，較鹽酸金霉素（MIC分別為8 mg·L-1和4 mg·L-1）、土霉素（MIC同為2 mg·L-1）、林可霉素（MIC 分別為1 mg·L-1和2 mg·L-1）等常用抗生素低，并且對豬源、禽源沙門氏菌也具有更好的抗菌效果，說明總體上天蠶素的抗菌活性高于抗生素。周芳等[8]采用牛津杯法測定天蠶素對金黃色葡萄球菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌等4種水產動物病原菌的MIC分別為0.8、0.8、1.6、3.2 mg·L-1，其抗菌效果優(yōu)于大黃、黃連、艾葉、烏梅、石榴皮等中草藥提取液，并且隨著天蠶素質量濃度的增加，抑菌圈直徑在增加，說明其抗菌作用在不斷增強。卜艷玲[9]試驗表明，針對大腸桿菌野毒株Z1，在相同濃度下，硫酸黏桿菌素、天蠶素、腸桿菌肽的MIC分別為256 mg·L-1、128 mg·L-1和小于64 mg·L-1，腸桿菌肽抑菌圈直徑最大，說明腸桿菌肽抗菌效果優(yōu)于硫酸黏桿菌素，而且腸桿菌肽在高溫（85～110 ℃下作用5 min）、酸（pH值=2時作用15～60 min）及膽鹽（0.3%膽鹽下作用15～60 min）條件下，其抑菌圈直徑保持21 mm，表明腸桿菌肽抗逆性強，在胃腸道中穩(wěn)定性高。于海濤[10]采用微量肉湯稀釋法和打孔法研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌肽MccJ25 對標準和臨床來源大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌及臨床分離的耐藥性大腸桿菌和沙門氏菌（耐林可霉素和替米考星）的 MIC 值為 0.03 μg·mL-1；用不同梯度溫度（37～121 ℃）、pH 值2～9 的胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶處理腸桿菌肽MccJ25 不同時間后，其對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑分別大于22 mm和19 mm，仍保持有強抗菌活性。王慶偉[11]發(fā)現(xiàn)枯草菌肽Sublancin 對金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)良好的抗菌效果，采用微量肉湯稀釋法測定Sublancin 對金黃色葡萄球菌甲氧西林敏感菌株CVCC1882和耐甲氧西林菌株ATCC43300 的MIC 分別為3.75 mg·L-1和60 mg·L-1。王帥[12]采用抑菌圈法發(fā)現(xiàn)枯草菌肽Sublancin對產氣莢膜梭菌CVCC2027具有較好的體外抑菌活性，但MIC 遠高于林可霉素。而在體內試驗中，枯草菌肽Sublancin 顯著降低了愛拔益加肉雞盲腸中產氣莢膜梭菌的數(shù)量，且其治療劑量遠低于林可霉素（5.76 mg·L-1對比 75 mg·L-1），與Wang Q. W. 等[13]對枯草菌肽Sublancin 的研究結果類似。

2 抗菌肽在養(yǎng)殖業(yè)中的應用

目前，飼料端已全面禁止添加抗生素類添加劑，因抗菌肽抗菌譜廣，抗菌作用機理獨特，主要作用于腸道，特別是能到達后腸，殺菌徹底，無殘留，不易產生耐藥性等諸多優(yōu)點，作為綠色安全的飼料替抗物質，可高效防控養(yǎng)殖當中的細菌性疾病，調節(jié)動物的腸道菌群平衡，提高飼料轉化效率和動物生長性能。

2.1 抗菌肽在豬養(yǎng)殖中的應用

抗菌肽對臨床中引起仔豬腹瀉的大腸桿菌、沙門氏菌等常見致病菌有較好的抗菌效果[14]，可促進有益菌增殖，抑制有害菌生長，降低糞便中大腸桿菌等病原菌數(shù)量，增強仔豬抗病能力[15-16]?；潞Ａ盏萚17]試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加300 mg·kg-1的天蠶素，仔豬腹瀉率由9.09%降低至6.16%，平均日增重提高4%。卜艷玲等[18]試驗表明，日糧中添加300 g·t-1天蠶素、500 g·t-1腸桿菌肽，斷奶仔豬腹瀉率分別降低78.3%和100%，仔豬平均日增重分別提高4.7%和10.5%，兩種抗菌肽效果都優(yōu)于30 g·t-1的硫酸黏桿菌素。熊海濤等[19]研究發(fā)現(xiàn)，無抗日糧中添加300 mg·kg-1腸桿菌肽可有效抑制仔豬腸道中致病性大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，使哺乳階段和保育階段仔豬腹瀉率顯著降低。

2.2 抗菌肽在禽養(yǎng)殖中的應用

大量研究證實飼料中添加抗菌肽可以提高家禽抵抗病原菌感染的能力[20-21]。張琳等[22]研究表明，天蠶素在預防肉雞壞死性腸炎方面效果良好，與恩拉霉素相比，肉雞糞便中產氣莢膜梭菌數(shù)量下降比例提升7.5%。丁修良等[23]對感染大腸桿菌的愛拔益加肉雞進行試驗，發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加300 mg·kg-1枯草菌肽Sublancin 顯著降低了肉雞盲腸中的大腸桿菌數(shù)量，治療效果與金霉素相當。王帥[12]驗證了枯草菌肽Sublancin對引起肉雞壞死性腸炎的產氣莢膜梭菌具有良好抑制效果，保護腸道免受有害菌的破壞，維持腸道微生態(tài)平衡，綜合改善了腸道健康。田麗娜等[24]試驗表明，飼糧中添加適量的枯草菌肽Sublancin 可提高蛋雞脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)，對蛋雞的免疫功能和抗病力具有促進作用。

2.3 抗菌肽在反芻動物養(yǎng)殖中的應用

宋麗華[25]試驗表明，在治療奶牛乳房炎時，抗菌肽組治愈率為57.9%～58.8%，有效率為31.6%～35.3%，療效等同或略優(yōu)于恩諾沙星（治愈率為60%，有效率為20%）。王慶偉等[26]報道，與青霉素相比，相同濃度的枯草菌肽Sublancin 對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43300 具有更好的抗菌活性。單玉雪等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與萬古霉素相比，抗菌肽對導致奶牛乳房炎的無乳鏈球菌和乳房炎臨床分離株的抗菌活性分別提高2.91倍和6.09倍。王靜[28]試驗證明重組牛LAP-CATHL2 抗菌肽對致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 為31.25 μg·mL-1，對致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎治療效果明顯。

2.4 抗菌肽在水產養(yǎng)殖中的應用

M.G.Kwon 等[29]報道，在飼料中添加抗菌肽顯著提高了遲緩愛德華氏菌和伊氏鏈球菌攻毒后的牙鲆和黑石魚的存活率。閆春梅等[30]發(fā)現(xiàn)使用抗菌肽浸泡可顯著抑制虹鱒體表細菌滋生，苗種成活率由30%提高到95%。林鑫等[31]發(fā)現(xiàn)飼糧中添加天蠶素可顯著提高錦鯉的總抗氧化能力和抗病性能。王自蕊等[32]選取初均重為（46.14±0.13）g 的湘云鯽1 242 尾，分成6 組，分別在基礎飼料中添加4 mg·kg-1金霉素及0、100、150、200、250 mg·kg-1天蠶素抗菌肽，結果表明在飼料中添加天蠶素抗菌肽對湘云鯽有促生長效果，且150、200 mg·kg-1添加組效果較佳，同時提高了魚體的非特異性免疫功能和抗病力，并具有促生長效果。董曉慶[33]發(fā)現(xiàn)通過促進促炎和抗炎因子的調整，天蠶素可提高建鯉抗氧化能力和免疫功能。

3 小結與展望

基于抗生素耐藥性的共識，國內外對抗菌肽的生物活性、作用機制和改造表達等方面進行了大量研究，但受限于種種因素，能夠應用于飼料中的替抗抗菌肽產品卻少之又少。主要影響因素包括：（1）天然抗菌肽表達量低，重組抗菌肽分離純化困難，因此需要選擇合適的宿主菌，提高抗菌肽的表達量，提高產業(yè)化水平，降低生產和使用成本；（2）抗菌肽分子量小，存在部分結構不穩(wěn)定問題，而且一級結構中含有的一些堿性氨基酸在動物體內易被胰蛋白酶消化水解，導致在應用時抗菌作用減弱或消失；（3）與抗生素相比，大部分抗菌肽抗菌活性還不夠理想，需要復配其他替抗產品，且關于藥效學及藥代動力學方面的研究較少，一定程度上限制了其應用。當然，隨著進一步探索研究，相信抗菌肽的功能優(yōu)化與市場產業(yè)化一定能夠完成，從而真正實現(xiàn)完全取代抗生素，做到無抗養(yǎng)殖。