高遷移率族蛋白B-1對結(jié)直腸癌放療敏感性的調(diào)控作用機(jī)制研究進(jìn)展

陳安祺，原娜，趙威威，郝曉慧，王聰，宋曉，張志林

1 河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北張家口075000；2 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院放射治療科

新輔助同步放化療與局部晚期結(jié)直腸癌（CRC）的治療密切相關(guān)，然而不同患者治療后的反應(yīng)存在顯著差異。同步放化療對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用與腫瘤免疫微環(huán)境（TME）密切相關(guān)，這造成了同期別不同患者的手術(shù)切除率及預(yù)后相差甚大［1］。放射治療可以引起腫瘤細(xì)胞的免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）［2］。高遷移率族蛋白B-1（HMGB-1）是一種組蛋白色素結(jié)合蛋白，它的釋放是ICD 的主要特征之一。隨著HMGB-1釋放位置的不同而呈現(xiàn)不同的功能，因此其在放射治療中扮演中極其復(fù)雜的角色［3］。在細(xì)胞內(nèi)，HMGB-1 具有穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)，利于DNA 轉(zhuǎn)錄和修復(fù)，并且促進(jìn)溶酶體降解和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)來驅(qū)使細(xì)胞發(fā)生自噬［4］。在細(xì)胞外，一方面HMGB-1促進(jìn)T細(xì)胞的募集及其促炎因子的產(chǎn)生加強(qiáng)放療的敏感性；另一方面，通過誘導(dǎo)抑制性免疫細(xì)胞導(dǎo)致抵抗放療的作用［5］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HMGB-1的升高與腫瘤的放射敏感性密切相關(guān)［6］?，F(xiàn)就HMGB-1 對CRC 放療敏感性的調(diào)控作用機(jī)制研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 HMGB-1 通過介導(dǎo)細(xì)胞損傷調(diào)控CRC 放療敏感性

1.1 HMGB-1 參與CRC 放療相關(guān)的DNA 損傷 根據(jù)傳統(tǒng)的放射生物學(xué)所述，電離輻射誘導(dǎo)的DNA 損傷包括堿基和脫氧核糖的損傷以及DNA 鏈的單鏈（SSB）或雙鏈斷裂（DSBs）［7］。此外，輻射通過對人體組織特別是腫瘤細(xì)胞的有機(jī)分子進(jìn)行電離，產(chǎn)生自由基而使靶細(xì)胞受損。然而輻射誘導(dǎo)的DNA 損傷水平低于其修復(fù)能力，就會降低細(xì)胞死亡的概率［8］。因此，在細(xì)胞膜保持完整性的情況下，細(xì)胞的DNA 修復(fù)能力是決定細(xì)胞在亞致死輻射下存活的關(guān)鍵因素，也是評定腫瘤放療敏感性的依據(jù)。

據(jù)報道，HMGB-1參與DNA損傷修復(fù)途徑包括：核苷酸切除修復(fù)（NER）、錯配修復(fù)（MMR）、堿基切除修復(fù)（BER）和雙鏈斷裂修復(fù)（DSBR）［9］。DNA 修復(fù)切除途徑中是最常用的是NER，當(dāng)DNA 被輻射受損后，HMGB-1 與DNA 損傷部位特異性結(jié)合并誘導(dǎo)螺旋進(jìn)一步彎曲，這種扭曲可以幫助NER 裝置更快的識別損傷，然后招募著色性干皮病（XPA）、復(fù)制蛋白（RPA）、DNA 修復(fù)的關(guān)鍵因子XPC-RAD23B 以及染色質(zhì)重塑因子，去除核小體并促進(jìn)受損DNA 進(jìn)入修復(fù)裝置，來開啟染色質(zhì)重塑的DNA 修復(fù)。在染色體背景下的DNA 修復(fù)包括三個步驟：“接近損傷—修復(fù)損傷—恢復(fù)原始染色質(zhì)結(jié)構(gòu)”。有研究［9］發(fā)現(xiàn)，在用DNA 損傷劑處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中敲除HMGB-1 后細(xì)胞存活率降低，重要的是DNA 受損后可誘導(dǎo)HMGB-1 的表達(dá)升高。為了進(jìn)一步支持HMGB-1 在識別NER 蛋白方面的作用，LANGE 等［10］發(fā) 現(xiàn)HMGB-1 促進(jìn)了XPC-RAD23B 和XPA-RPA 在受損DNA底物上的相互作用，同時，HMGB-1也能夠與XPC-RAD23B 和XPA 結(jié)合。然而相反的報道［11］認(rèn)為，HMGB-1可抑制順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)，被稱為“修復(fù)屏障”。盡管目前關(guān)于HMGB-1在NER相關(guān)的修復(fù)作用是矛盾的，但研究數(shù)據(jù)更加偏向HMGB-1是NER的輔助因子。

HMGB-1 還與MMR 和BER 的修復(fù)作用有關(guān)，YUAN 等證實HMGB-1 在識別異源雙鏈修復(fù)的初始損傷的基礎(chǔ)上，與MSH2 和MLH1 基因結(jié)合并發(fā)揮修復(fù)作用［12］。PRASAD 等［13］發(fā)現(xiàn)，HMGB-1 不僅可與BER 途徑中的中間體—脫氧核糖磷酸（dRP）裂解酶底物結(jié)合，而且可與APE、FEN-1 和polβ 結(jié)合，參與修復(fù)作用；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HMGB-1對這種BER 中間體具有弱的5'dRP裂解酶活性，HMGB-1的dRP裂解酶活性比polβ低約600倍。

DSBR 的有兩個子途徑：包括非同源末端連接（NHEJ）和V（D）J 重組。HMGB-1 在V（D）J 重組和NHEJ 中也起著重要作用，即增強(qiáng)DNA 內(nèi)外間的連接，并向DNA 斷裂末端募集DNA 依賴性蛋白激酶催化亞基（PKCs），甚至在缺乏互補(bǔ)性的情況下，HMGB-1 可以縮短DNA 雙鏈體到斷裂末端的距離，利于DNA修復(fù)［14］。HMGB-1還可以通過彎曲和環(huán)化線性DNA 鏈來提高DNA 的穩(wěn)定性。然而，HMGB-1參與DSBR 修復(fù)還可能有助于癌細(xì)胞的放射抗性。SHRIVASTAVA 等發(fā)現(xiàn)，在各種尿路上皮腫瘤細(xì)胞中，HMGB-1 水平的增加與放射抗性有關(guān)［15］。此結(jié)果表明，HMGB-1可能通過其促進(jìn)DSBR修復(fù)而發(fā)揮腫瘤耐受輻射的作用。

HMGB-1 不僅參與了四種主要的DNA 修復(fù)途徑，還參與了細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。HMGB-1 結(jié)合晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGEs）或T樣受體群（TLRs）通路導(dǎo)致細(xì)胞活化，激活了細(xì)胞內(nèi)信號通路磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）和絲裂原活化蛋白激酶如MAPK、ERK1/2來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的活化和增殖。PI3K/Akt 可以激活細(xì)胞周期蛋白D，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制劑p21 活性的下降，促進(jìn)G1/S 期轉(zhuǎn)變，因此HMGB-1 在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。另外抑制HMGB-1的表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期而使癌細(xì)胞對放射線敏感，從而增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡［16］。

因此，HMGB-1 有效地介導(dǎo)了癌細(xì)胞的DNA 損傷修復(fù)并影響其放射治療療效。

1.2 HMGB-1 參與CRC 放療相關(guān)的自噬 自噬是一種分解代謝途徑，通過回收受損細(xì)胞器和關(guān)鍵蛋白質(zhì)的溶酶體降解產(chǎn)物而維持自身能量水平，即自噬有助于細(xì)胞免于死亡。有研究表明自噬可能影響CRC 中的放射介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞經(jīng)輻射損傷后，其可通過自噬來抵抗這些損傷，以維持自身的穩(wěn)定性。研究人員發(fā)現(xiàn)通過干擾自噬可以克服腫瘤細(xì)胞耐藥性并且增強(qiáng)腫瘤的放射敏感性。然而一旦出現(xiàn)過度自噬，細(xì)胞器和關(guān)鍵蛋白的降解將超過機(jī)體的代償量，就會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這個過程被稱為自噬性細(xì)胞死亡或II型程序性細(xì)胞死亡。實驗研究發(fā)現(xiàn)通過利用藥物或基因來增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)的自噬會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，從而提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性［17］?？偟膩碚f，自噬顯著影響放射治療療效，并有助于放射敏感性的增加。

HMGB-1 是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有保護(hù)細(xì)胞免受輻射毒性的作用，其原因一方面可能是細(xì)胞質(zhì)中的HMGB-1 通過分子內(nèi)二硫鍵（C23/45）與Beclin1 結(jié)合從而將Beclin1 從其與Bcl2 的復(fù)合物中釋放出來并誘導(dǎo)自噬。另一方面由于暴露于輻射的癌細(xì)胞顯示自噬體的積累，以及Beclin-1 和微管相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ水平的顯著增加，從而導(dǎo)致自噬反應(yīng)增強(qiáng)，其原因可能與LC3 Ⅱ點有關(guān)［18］。在一項乳腺癌研究中認(rèn)為HMGB-1的下調(diào)可顯著抑制放射治療誘導(dǎo)的自噬，從而抑制乳腺癌放療敏感性［19］?？傊?，輻射暴露誘導(dǎo)HMGB-1的升高增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的自噬，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞放射敏感性增強(qiáng)。

2 HMGB-1 通過介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境調(diào)控CRC 放療敏感性

2.1 HMGB-1 參與CRC 放療的免疫識別 免疫系統(tǒng)和惡性腫瘤細(xì)胞的相互作用是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要過程，一方面免疫系統(tǒng)可以通過多種免疫效應(yīng)機(jī)制殺死和清除腫瘤細(xì)胞，另一方面，腫瘤細(xì)胞也可以通過各種免疫逃逸機(jī)制抵抗和逃避免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷或清除以利于自身的生長。輻射誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫是由免疫激活信號和免疫抑制因子的相互作用產(chǎn)生的。腫瘤細(xì)胞被輻射損傷后，腫瘤抗原的釋放和損傷相關(guān)的分子模式（DAMPs）可將TME塑造成免疫刺激模式，從而誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。其中，放射治療誘導(dǎo)的DAMPs 包括鈣網(wǎng)蛋白，熱休克蛋白，5'-三磷酸腺苷和HMGB-1［20］。在免疫系統(tǒng)識別、活化和清除腫瘤細(xì)胞時，HMGB-1 的釋放可增加免疫細(xì)胞的識別和清除。然而在正常細(xì)胞的程序性死亡時，HMGB-1 與細(xì)胞殘余物緊密結(jié)合，因此組織中細(xì)胞外HMGB-1的升高可作為壞死的求救信號或壞死標(biāo)志物。

輻射可誘導(dǎo)免疫抑制細(xì)胞的產(chǎn)生或數(shù)量的增加，包括腫瘤浸潤性T 細(xì)胞、骨髓源性免疫抑制細(xì)胞，M2 型巨噬細(xì)胞及轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和各種免疫檢查點分子如程序性死亡受體1（PD-1）、細(xì)胞程序性死亡-配體1、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4 等，可能會削弱放射治療誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。HMGB-1 的升高可通過誘導(dǎo)免疫耐受影響放射治療療效。

2.1.1 HMGB-1 通過促進(jìn)樹突狀細(xì)胞（DC）的成熟影響放療的療效 DC是一種有效的抗原呈遞細(xì)胞，可識別腫瘤抗原并將其呈遞至特定的T細(xì)胞來介導(dǎo)輻射誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。未成熟的DC 在抗原刺激下分化為成熟細(xì)胞，同時上調(diào)其表面的CD40、CD80/CD86 和主要組織相容性復(fù)合體，從而協(xié)同T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤的作用。然而，TME 中的免疫抑制因子可抑制DC 成熟。據(jù)報道，HMGB-1 介導(dǎo)DC 的激活，并以劑量依賴的方式上調(diào)CD80/CD86 的表達(dá)［21］。此外，DC 成熟后會誘導(dǎo)HMGB-1 的分泌，從而上調(diào)趨化因子受體CXCR4 和CCR7，募集腫瘤細(xì)胞。同時，HMGB-1 的升高可通過HMGB-1-RAGE途徑誘發(fā)DC 的募集。除了上述作用，HMGB-1 也可促進(jìn)DC 產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，如白介素-6（IL-6）、IL-12p70和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）參與免疫反應(yīng)。KANEGASAKI 等研究［22］表明，輻射誘導(dǎo)的HMGB-1通過靶向CCL3，募集并活化DC 協(xié)助T 細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。研究表明，HMGB-1 可通過刺激DC 成熟來增強(qiáng)放射治療介導(dǎo)的癌癥免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)之一。

2.1.2 HMGB-1 通過促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞的募集影響放療的療效 放射治療的療效與腫瘤浸潤的效應(yīng)性免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能有關(guān)。HMGB-1 可直接介導(dǎo)效應(yīng)性免疫T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)，這可能與T 細(xì)胞的α1β2 直接活化有關(guān)。在小鼠試驗中，HMGB-1 的阻斷可影響T 細(xì)胞的活化。HMGB-1 也可通過調(diào)控T 細(xì)胞表面的CXCL11 促進(jìn)T 細(xì)胞的募集。重要的是，腫瘤細(xì)胞死亡前釋放的HMGB-1 不僅促進(jìn)腫瘤抗原特異性T 細(xì)胞的活化，而且增加干擾素（IFN）-γ的表達(dá)，而IFN-γ 是驅(qū)動抗腫瘤免疫的關(guān)鍵因素［23］。這些研究均表明HMGB-1可能是通過誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)來增加放療的抗腫瘤作用。

2.1.3 HMGB-1 通過介導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞影響放療的療效 放射治療通過調(diào)控T 細(xì)胞免疫反應(yīng)重塑TME，在此過程中，HMGB-1 有可能協(xié)助促進(jìn)腫瘤免疫抑制細(xì)胞的形成，誘發(fā)免疫耐受和腫瘤免疫逃逸，進(jìn)而影響放療介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。其中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的形成及分泌產(chǎn)物如IL-10，是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抗輻射及免疫逃避的原因。HMGB-1 可以上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 以增強(qiáng)Tregs 的分化，其也可通過介導(dǎo)胸腺基質(zhì)淋巴生成素來激活Tregs［24］。另外，HMGB-1 結(jié)合Tregs 表面的RAGE 不僅直接增強(qiáng)Tregs 的促腫瘤作用，而且促進(jìn)Tregs 細(xì)胞分泌IL-10，抑制CD8+T 細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)［25］。因此，HMGB-1 與Tregs 的相互作用有可能增加腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，導(dǎo)致放療療效的下降。

2.1.4 HMGB-1 通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞影響放療的療效 巨噬細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中起著十分重要的作用。研究［26］表明，HMGB-1 的表達(dá)與腫瘤巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)。腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞（TAMs）是M2型巨噬細(xì)胞，其可通過IL-10 和TGF-β 參與T 細(xì)胞的抑制。有趣的是，在膀胱癌模型中，與單獨的放射治療相比，放療聯(lián)合HMGB-1 抑制劑甘草甜素顯著增加了抗腫瘤M1 型巨噬細(xì)胞的數(shù)量［27］。這表明HMGB-1抑制M1 型巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的控制。另外，腫瘤來源的HMGB-1 可有效的觸發(fā)單核細(xì)胞分化為PD-1+的TAMs，顯著增強(qiáng)IL-10 的表達(dá)，從而抑制CD8+T細(xì)胞增殖并促進(jìn)食管癌的發(fā)展［28］。這些發(fā)現(xiàn)證實HMGB-1可以通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞的極化來抑制放射治療介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

2.1.5 HMGB-1 通過MDSCs 介導(dǎo)的免疫抑制影響放療的療效 髓系來源的抑制細(xì)胞（MDSCs）代表不成熟髓系細(xì)胞的異質(zhì)性群體，包括腫瘤進(jìn)展和慢性炎癥過程中的粒細(xì)胞、DC 和巨噬細(xì)胞的前體［29］。MDSC 的彌漫性分布可能是驅(qū)動腫瘤轉(zhuǎn)移和抗輻射的一個因素。機(jī)制可能是HMGB-1 提高了MDSC 在缺氧和營養(yǎng)缺乏的腫瘤微環(huán)境中的生存能力。曾有研究發(fā)現(xiàn)，HMGB-1不是直接抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖，而是誘導(dǎo)MDSC 的增殖來介導(dǎo)促腫瘤效應(yīng)，HMGB-1 的阻斷，可顯著抑制MDSC 的增殖［30］。機(jī)制可能一方面與激活NF-κB 信號通路有關(guān)，另一方面與骨髓祖細(xì)胞的刺激及分化有關(guān)［7］。因此，HMGB-1 的分泌可通過MDSC 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)而達(dá)到抑制放射治療的作用。

2.2 HMGB-1 參與CRC 放療過程中炎癥因子的產(chǎn)生和釋放 腫瘤細(xì)胞具有免疫抑制作用，能抵抗炎癥細(xì)胞的浸潤。機(jī)體受到輻射后，多表現(xiàn)為慢性炎癥反應(yīng)，以上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的浸潤為主。例如，經(jīng)放射治療后，腫瘤細(xì)胞周圍可見多種促炎細(xì)胞因子如TNF、IL-1α 和IL-1β 等的產(chǎn)生，此時，HMGB-1 與免疫細(xì)胞表面的RAGEs 結(jié)合觸發(fā)RAGE/JNK/NF-κB 炎癥信號通路，促進(jìn)和維持炎癥反應(yīng)［31］。此外，其不僅可通過自分泌方式誘導(dǎo)單核細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1α 等，而且可與DNA、脂多糖、IL-1β 和核小體形成復(fù)合物，促進(jìn)炎癥的形成。HMGB-1 也可直接激活內(nèi)皮細(xì)胞并上調(diào)粘附分子Mac-1，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的募集、粘附和遷移。此外，HMGB-1 與自然殺傷細(xì)胞表面的Toll 樣受體2結(jié)合，進(jìn)而啟動NF-κB、STAT3 和Smad3 信號通路而誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)［32］。HMGB-1 通過激活細(xì)胞因子加速了放射治療介導(dǎo)的腫瘤向“急性炎癥”組織的轉(zhuǎn)化，這對于適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動至關(guān)重要。

2.3 HMGB-1 參與CRC 放射治療的腫瘤氧耗的形成 據(jù)文獻(xiàn)報道，高達(dá)60%的晚期實體瘤由于氧的供應(yīng)和消耗之間的失衡而表現(xiàn)出缺氧區(qū)域。腫瘤缺氧是造成腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及其對治療的抵抗的不良因素。缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）是缺氧條件下的產(chǎn)物，是細(xì)胞缺氧的表現(xiàn)，放射治療聯(lián)合HIF-1 抑制劑可顯著控制小鼠腫瘤細(xì)胞的生長［33］。還有研究［34］發(fā)現(xiàn)在CRC 細(xì)胞中，缺氧通過下調(diào)BTG3 來誘導(dǎo)放療抗性。腫瘤中心的低氧環(huán)境可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，釋放HMGB-1 和線粒體DNA（mtDNA）等。研究證實，腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下，HMGB-1 的表達(dá)升高促進(jìn)巨噬細(xì)胞的浸潤，并使其向M2 型極化，釋放IL-6 以增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。同時HMGB-1 和mtDNA 的相互作用通過激活TLR9 來誘導(dǎo)腫瘤的生長，TLR-9 的激活觸發(fā)炎癥和腫瘤信號通路，進(jìn)一步加速腫瘤的生長。因此，缺氧通過上調(diào)HMGB-1 來促進(jìn)癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移，降低了CRC的放療敏感性。

綜上所述，HMGB-1 在CRC 放療中的作用及其機(jī)制比較復(fù)雜，在細(xì)胞內(nèi)參與DNA 的修復(fù)途徑和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，甚至干擾細(xì)胞自噬直接作用于腫瘤細(xì)胞。在細(xì)胞外通過干擾免疫反應(yīng)、炎癥因子的釋放以及腫瘤細(xì)胞的氧耗間接作用于TME，進(jìn)而影響CRC 輻射敏感性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞放射治療效果的差異。所以，HMGB-1 的升高與腫瘤的放療敏感性密切相關(guān)，可能是降低CRC 放療的療效一種存在機(jī)制。隨著研究內(nèi)容的不斷深入，新的理論的創(chuàng)新，HMGB-1 與放療敏感性機(jī)制的研究將會得以完善，也會有助于開發(fā)有效且靶向的腫瘤放射增敏的作用，為改善腫瘤放射療效開辟新的途徑。