獸用疫苗研究進(jìn)展

張廣慶

（山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 泰安 271000）

從18世紀(jì)后期Edward Jenner發(fā)現(xiàn)接種牛痘可以保護(hù)人類免受天花感染開始，到 20世紀(jì)人類徹底消滅天花，疫苗在人類和動(dòng)物的生命健康和生活幸福中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[1-3]。隨著世界人口的不斷增長，人們對(duì)食物資源的需求量越來越大，這使得集約化養(yǎng)殖模式對(duì)維持食物資源的供應(yīng)愈發(fā)重要。隨著我國動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)向集約化規(guī)模發(fā)展，集約化養(yǎng)殖所存在的問題不斷顯現(xiàn)，其中由集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致的傳染性病原體傳播進(jìn)而引起疾病發(fā)生的問題尤為顯著。這不僅嚴(yán)重影響了我國畜牧業(yè)生產(chǎn)力，還在一定程度上影響國家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。此外，動(dòng)物源性病原也可以通過直接接觸感染動(dòng)物、其組織和體液等或是以節(jié)肢動(dòng)物作為媒介傳播給人類（人畜共患病），進(jìn)而對(duì)公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生巨大威脅。因此，防止傳染病在動(dòng)物-人類界面的傳播對(duì)于保護(hù)世界人們免受動(dòng)物流行病和大流行病的影響非常重要。通過疫苗接種對(duì)動(dòng)物疾病進(jìn)行預(yù)防是針對(duì)傳染病最具成本效益的干預(yù)策略之一，是防止各種疾病傳播的最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段。大多數(shù)疾病的治療和預(yù)防都有可用的疫苗。

獸用疫苗（Animal vaccines）是利用微生物及其代謝產(chǎn)物、結(jié)構(gòu)物質(zhì)或是受感染的動(dòng)物血液、體液、組織等，經(jīng)不同的工藝程序制備成，通過刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫物質(zhì)，從而預(yù)防和治療特定疾病的生物制品。

根據(jù)疫苗制備程序以及疫苗研發(fā)的進(jìn)度，本文將獸用疫苗分為常規(guī)疫苗、基因工程疫苗、尚在研究中的疫苗三大類。

1 常規(guī)疫苗

1.1 弱毒疫苗

弱毒疫苗是通過物理、化學(xué)或生物連續(xù)傳代的方法將天然強(qiáng)毒株轉(zhuǎn)化為弱毒株，從而降低其對(duì)宿主動(dòng)物的致病性，但仍保持良好的免疫原性，并將這類弱毒株制備而成得疫苗[4]。這類疫苗通過在宿主體內(nèi)復(fù)制，更準(zhǔn)確的模擬自然感染，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更長久的免疫力。但這類疫苗存在穩(wěn)定性差、毒力強(qiáng)、毒株變異等缺點(diǎn)。

1.2 滅活疫苗

滅活疫苗是將標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株或保有免疫原性的弱毒株經(jīng)大量培養(yǎng)后，將其經(jīng)特殊的滅活處理后制備而成的疫苗。滅活苗需要通過添加佐劑提高其免疫能力，根據(jù)所添加的佐劑不同，滅活疫苗可分為油佐劑疫苗，鋁膠佐劑疫苗，蜂膠佐劑疫苗[5]。滅活疫苗具有安全性好、易保存、無污染、無危險(xiǎn)、易于制備聯(lián)合疫苗或多價(jià)疫苗等優(yōu)點(diǎn)，但其生產(chǎn)成本高、免疫期較短、免疫途徑單一，需進(jìn)行多次免疫接種來誘導(dǎo)體液免疫。

1.3 類毒素疫苗

類毒素疫苗是用甲醛對(duì)病原體產(chǎn)生的外毒素進(jìn)行解毒，使其失去致病性，但仍保留其免疫原性而制成的生物制品。肌肉注射類毒素疫苗后，可誘導(dǎo)機(jī)體免疫器官產(chǎn)生免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗毒素，進(jìn)而獲得主動(dòng)免疫。

2 基因工程疫苗

2.1 亞單位疫苗

亞單位疫苗是對(duì)微生物進(jìn)行物理和化學(xué)處理，去除其無效物質(zhì)，提取其如細(xì)菌莢膜、鞭毛、病毒衣殼蛋白等有效抗原制備的疫苗。具有副作用小、免疫效果好、應(yīng)用潛力大等特點(diǎn)[6]。外源基因可以被插入到表達(dá)載體中，作為這些基因編碼的外源蛋白的生產(chǎn)工廠，這為疫苗接種研究提供了一種相對(duì)取之不盡、用之不竭的廉價(jià)蛋白質(zhì)來源，根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)可分為以下5種。

2.1.1 細(xì)菌表達(dá) 首次利用大腸桿菌建立了重組表達(dá)系統(tǒng)，這種表達(dá)系統(tǒng)可以提供相對(duì)大量的定義蛋白，因此許多亞單位疫苗選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。但是原核細(xì)胞具有不同的加工和運(yùn)輸機(jī)制，表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常被錯(cuò)誤地折疊。此外，許多候選疫苗蛋白中存在的信號(hào)序列、糖基化位點(diǎn)和二硫鍵可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)的毒性、不溶性或快速降解。

2.1.2 酵母表達(dá) 釀酒酵母作為一種工業(yè)微生物的廣泛使用，使其成為替代抗原蛋白表達(dá)系統(tǒng)的自然選擇。與原核系統(tǒng)相比，它還有一個(gè)額外的優(yōu)勢，即蛋白質(zhì)的翻譯后修飾以類似于高等真核細(xì)胞使用的方式進(jìn)行，因此，重組蛋白質(zhì)更有可能被正確折疊。酵母表達(dá)的蛋白質(zhì)會(huì)被糖基化，盡管這種糖基化將不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行的糖基化[7]。

2.1.3 昆蟲細(xì)胞表達(dá) 利用桿狀病毒載體—銀紋夜蛾核型多角體病毒感染果蠅的昆蟲卵巢細(xì)胞，開發(fā)了一種新穎的表達(dá)系統(tǒng)。這些病毒擁有一個(gè)強(qiáng)大的啟動(dòng)子，控制著一種 29 kDa多面體蛋白的產(chǎn)生，這種多面體蛋白最終積累到感染細(xì)胞總蛋白的50 %。用選定的外源基因替換可以產(chǎn)生高水平的重組蛋白，這些重組蛋白質(zhì)也將進(jìn)行翻譯后修飾，包括糖基化、磷酸化和信號(hào)肽切割[8]。

2.1.4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá) 由于許多病原體會(huì)在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中感染和復(fù)制，亞單位疫苗的抗原蛋白是哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的自然選擇。不過現(xiàn)階段存在的技術(shù)難題是哺乳動(dòng)物表達(dá)水平可能比使用上述替代表達(dá)系統(tǒng)獲得的表達(dá)水平要低一些。

2.1.5 植物細(xì)胞表達(dá) 植物細(xì)胞是新興的表達(dá)系統(tǒng)，雖然過去植物遺傳學(xué)家主要集中在作物改良上，但最近的一些研究表明，植物可能為哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)提供一個(gè)有用的表達(dá)系統(tǒng)。為了在植物中表達(dá)外源基因，必須將植物啟動(dòng)子、終止子和調(diào)控序列拼接到克隆的互補(bǔ) DNA上。還可以加入可選擇的標(biāo)記以便于重組體的鑒定，并且表達(dá)宿主可以是植物或者是細(xì)胞培養(yǎng)物。使用這種表達(dá)系統(tǒng)的第一種獲得許可的疫苗是針對(duì)家禽中的新城疫病毒（NDV）感染[9]。

2.2 活載體疫苗

活載體疫苗是經(jīng)過基因工程改造后的一種重組疫苗，使用活載體遞送亞單位或多肽疫苗的方法，免疫動(dòng)物后在體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)性抗原，進(jìn)而刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)作用。活載體疫苗的免疫誘導(dǎo)過程與自然過程相似，所以免疫效果更好。根據(jù)載體可分為以下3種。

2.2.1 病毒載體 這類疫苗是指以病毒為載體，表達(dá)保護(hù)性抗原基因的疫苗。腺病毒、痘病毒、皰疹病毒等都可用作病毒載體。病毒載體可通過多種途徑刺激免疫系統(tǒng)，可較好地誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，有利于產(chǎn)生免疫保護(hù)效果。這類疫苗的有效性和穩(wěn)定性較為重要，可通過提高抗原特異性、添加或優(yōu)化啟動(dòng)子等元件、共表達(dá)分子佐劑來提高免疫保護(hù)效果[10]。

2.2.2 細(xì)菌載體 細(xì)菌活載體疫苗是一種新型疫苗，在過去十多年間發(fā)展快速，免疫后在機(jī)體內(nèi)能大量表達(dá)外源基因，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫。細(xì)菌活載體疫苗的載體主要包括乳酸菌、卡介苗、沙門氏菌、大腸埃希菌等[11]。

2.2.3 原生動(dòng)物載體 一種非常新穎的載體技術(shù)是使用一種活的原生動(dòng)物寄生蟲（艾美耳球蟲），這種寄生蟲已經(jīng)經(jīng)過基因改造，可以將同源或異種抗原輸送到家禽。這種疫苗將使用目前獲得許可的商業(yè)減毒株且已經(jīng)被開發(fā)出來，外源基因?qū)⒗妹附閷?dǎo)的整合方式在減毒載體中表達(dá)。然后可以提供轉(zhuǎn)基因菌株，以提供對(duì)致病菌感染的更廣泛保護(hù)。

2.3 基因缺失疫苗

基因缺失疫苗是通過基因?qū)用娴牟僮鳎コ?xì)菌或病毒中與致病性相關(guān)的基因序列，使其成為無毒株或減毒株，但仍保持免疫原性。經(jīng)典減毒方法制備的疫苗雖然毒力下降，但免疫原性發(fā)生明顯變化，或者在應(yīng)用過程中容易發(fā)生逆轉(zhuǎn)，從而存在發(fā)生潛在傳播病原的風(fēng)險(xiǎn)。而基因缺失疫苗因基因缺失突變機(jī)率低，基因缺失疫苗在保護(hù)其免疫原性基因方面相對(duì)更安全，應(yīng)用前景更加廣泛[12]。

2.4 合成肽疫苗

合成肽疫苗又稱表位疫苗，通過識(shí)別和測序感染源上的重要免疫原部位，在許多情況下可以使用氨基酸（多肽）的短鏈來模擬這些部位。因合成肽疫苗不含病原微生物的基因組，故不會(huì)與宿主基因出現(xiàn)重組現(xiàn)象，相對(duì)安全[13]。

2.5 核酸疫苗

核酸疫苗又稱 DNA疫苗，將抗原編碼基因連接到空質(zhì)粒上，然后將構(gòu)建的重組質(zhì)粒直接注射到動(dòng)物體內(nèi)激活免疫系統(tǒng)，合成內(nèi)源性蛋白模擬自然感染。核酸疫苗免疫動(dòng)物后表達(dá)保護(hù)性抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生長久的保護(hù)作用。其合成的抗原蛋白類似于亞單位疫苗，不同的是核酸疫苗的抗原蛋白是在免疫主體中產(chǎn)生的，抗原以其天然形式存在，并將引發(fā)MHC I類和II類T細(xì)胞反應(yīng)以及抗體反應(yīng)，沒有感染的風(fēng)險(xiǎn)[14]。

3 展望

目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段的獸用疫苗有轉(zhuǎn)基因植物可食用疫苗和抗獨(dú)特型疫苗。轉(zhuǎn)基因植物食用疫苗是將編碼微生物抗原的基因?qū)胫参锛?xì)胞，當(dāng)生物攝入含有這種抗原的轉(zhuǎn)基因植物后，就會(huì)對(duì)相應(yīng)的微生物產(chǎn)生免疫力，進(jìn)而達(dá)到免疫預(yù)防目的一類疫苗；抗獨(dú)特型疫苗通過模擬抗原刺激機(jī)體，使機(jī)體產(chǎn)生與模擬抗原產(chǎn)生的相應(yīng)特異性抗體作用相同的抗體，從而抵抗病原體的感染[15]。

理想的疫苗應(yīng)該具有效果好、安全穩(wěn)定、易于接種、成本低、適用范圍廣、與其他疫苗聯(lián)合應(yīng)用等特點(diǎn)。滅活疫苗和減毒活疫苗在畜牧業(yè)上發(fā)揮了巨大的作用。隨著不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的獸用疫苗弊端不斷暴露，滅活疫苗對(duì)特定病原體達(dá)不到理想的作用，減毒活疫苗可能誘發(fā)毒力返強(qiáng)，從而引起病原大面積傳播。在當(dāng)前傳統(tǒng)疫苗發(fā)展明顯受限的情況下利用分子生物學(xué)手段研發(fā)新型疫苗顯得尤為重要[16]。