CCM3基因與血管相關(guān)疾病的研究進(jìn)展

李晨薇，黃 坤，周興業(yè)，張小康，高艷芳

（贛南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與健康管理學(xué)院，江西 贛州 341000）

CCM3（Cerebral caverrnous malformation 3，CCM3）是腦海綿狀血管瘤（Cerebral cavernous malformation，CCMs）的第3 個(gè)致病基因，對(duì)血管生成發(fā)育和維持血管完整性有重要作用。另外，CCM3也被稱為程序性細(xì)胞死亡分子10（Programmed cell death 10，PDCD10），最初發(fā)現(xiàn)是由撤除粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)凋亡的人紅白血病細(xì)胞系TF-1 中克隆得到的1 個(gè)凋亡相關(guān)基因［1］，對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡發(fā)揮調(diào)控作用，可影響多種血管相關(guān)疾病的形成與發(fā)展。

1 CCM3基因與血管生成發(fā)育相關(guān)

1.1 CCM3 的結(jié)構(gòu)和功能約40%的CCMs 家族系致病基因位于CCM3，CCM3基因定位于D3S1763與D3S1614 之間970 kb 大小的區(qū)域內(nèi)；含有7 個(gè)編碼外顯子和3 個(gè)5'非編碼外顯子，起始密碼子ATG定位于第4個(gè)外顯子［2］，編碼含有212個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)［3］，CCM3 蛋白有N 端二聚結(jié)構(gòu)域和C 端局部黏附組成的蛋白邏輯域（FAT-H）［4］，可通過(guò)其2個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域與各種信號(hào)蛋白質(zhì)相互作用，發(fā)揮不同生物學(xué)功能。

1.2 CCM3 對(duì)血管生成發(fā)育進(jìn)行調(diào)控血管發(fā)生始于祖細(xì)胞增殖分化形成的原始血管網(wǎng)絡(luò)，而血管生成則是預(yù)先存在的血管結(jié)構(gòu)延伸的過(guò)程［5］。二者均存在內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附并組裝成新的血管結(jié)構(gòu)這一過(guò)程。多潛能間充質(zhì)細(xì)胞的分化、前內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移以及細(xì)胞間的連接是血管生成重要的后續(xù)步驟［6-7］。隨后，由細(xì)胞索和假定的血管腔組成的血管結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)血管生成重構(gòu)轉(zhuǎn)化為血管，進(jìn)而形成血管系統(tǒng)［8-9］。

CCM3編碼一種錨蛋白，可以結(jié)合不同的靶蛋白參與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，如與CCM2 組成CCM 信號(hào)復(fù)合物［10］，與細(xì)胞黏附分子［11］、生發(fā)中心激酶Ⅲ（Germinal center kinase Ⅲ，GCKⅢ）家族蛋白激酶［12］和血管表皮生長(zhǎng)因子受體2［13］相互作用，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡、緊密連接和炎癥反應(yīng)［14］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素及其受體等多種因素參與了血管發(fā)育不同步驟的分子調(diào)控。CCM3在血管發(fā)育過(guò)程中促進(jìn)VEGFR2 信號(hào)通路，且CCM3的羧基端結(jié)構(gòu)域是穩(wěn)定VEGFR2 的必要因素。VEGF 刺激促進(jìn)了CCM3與VEGFR2 的相互作用，這種相互作用阻止了VEGF 誘導(dǎo)的VEGFR2 內(nèi)化和降解［15］。此外，不同研究驗(yàn)證了CCM3基因參與血管內(nèi)皮細(xì)胞從生長(zhǎng)發(fā)育到凋亡各階段不同的調(diào)控機(jī)制。

1.3 CCM3 引起血管相關(guān)疾病腦海綿狀血管瘤（CCMs）又稱海綿狀血管瘤或血管瘤，是大腦或脊髓內(nèi)的一組薄壁、正弦血管通道，由內(nèi)皮細(xì)胞排列的滲漏毛細(xì)血管群組成，表現(xiàn)為異常的血管結(jié)構(gòu)［16］。CCM3作為腦海綿狀血管瘤的第3 個(gè)致病基因，與CCM1和CCM2相比，CCM3突變攜帶者通常表現(xiàn)出更早的發(fā)病年齡和更高的出血風(fēng)險(xiǎn)［17］。在心肌細(xì)胞中，CCM3的表達(dá)是發(fā)生缺血再灌注損傷誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的必要因素［18］。提示CCM3基因?qū)ρ苌砂l(fā)育、維持管狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)以及血管壁通透性方面有重要的研究?jī)r(jià)值，通過(guò)該基因治療血管相關(guān)疾病存在挖掘潛力。此外，CCM3首先在人類凋亡髓細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)了其與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的功能［19］，對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、大腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定作用［20-21］。

2 CCM3基因引起血管相關(guān)疾病的機(jī)制

2.1 CCM3 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移的影響對(duì)CCM3調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移研究發(fā)現(xiàn)，野生型和突變型CCM3基因都可促進(jìn)細(xì)胞增殖與遷移。CCM3 與GCKⅢ激酶形成異源二聚體對(duì)誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移有重要意義［12］。GCKⅢ激酶主要包括MST3/STK24、MST4/MASK 和STK25/SOK1/YSK1。通過(guò)將野生型CCM3和MST4 轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞，并進(jìn)行ATP 細(xì)胞活力測(cè)定和MTT 分析，發(fā)現(xiàn)CCM3和MST4 轉(zhuǎn)染后，在ATP 細(xì)胞活力測(cè)定中增殖率增加了4倍［22］。研究發(fā)現(xiàn)，CCM3基因短期敲除小鼠細(xì)胞以增殖為特征，這有助于大腦脊髓的發(fā)育和神經(jīng)元的分化［23］。有研究觀察到CCM3基因缺失的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase-3的活性顯著降低，衰老相關(guān)的β 牛乳糖活性減少；而野生型人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)后表現(xiàn)出復(fù)制性衰老和生長(zhǎng)停滯的跡象［17］。另外，通過(guò)測(cè)定基因序列發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期促進(jìn)基因在突變CCM3基因中上調(diào)［24］。推測(cè)CCM3基因可限定細(xì)胞有絲分裂頻次，促進(jìn)細(xì)胞在穩(wěn)定的分裂次數(shù)后凋亡，因此，CCM3基因可調(diào)節(jié)細(xì)胞正常的增殖與凋亡進(jìn)程，抑制細(xì)胞癌變。

CCM3沉默的CCMs，其病變手術(shù)分離的內(nèi)皮細(xì)胞（CCM-ECS）通過(guò)Transwell 遷移試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移率顯著增加［24］，提示CCM3基因可抑制細(xì)胞遷移。野生型CCM3和MST4 共轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的遷移作用比單獨(dú)轉(zhuǎn)染MST4的促遷移作用增強(qiáng)了3倍，提示CCM3和MST4相互作用，協(xié)同促進(jìn)了細(xì)胞增殖與遷移［25］。在正常CCM3基因與CCM3基因敲除細(xì)胞模型中，均出現(xiàn)細(xì)胞增殖與遷移增強(qiáng)的現(xiàn)象［17，23-25］，而CCM3缺失促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移更加明顯，進(jìn)而促進(jìn)形成血管瘤。

2.2 CCM3 對(duì)細(xì)胞力學(xué)變化的作用CCM3基因敲除的血管內(nèi)皮細(xì)胞形狀、細(xì)胞力學(xué)和細(xì)胞骨架組織發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞形成圓形和界限清楚的橢球體的能力明顯受損，細(xì)胞面積和彈性模量增加，細(xì)胞剛度更高。造成這種變化的主要原因是CCM3基因敲除的內(nèi)皮細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維束增加，加固內(nèi)皮細(xì)胞骨架，導(dǎo)致細(xì)胞形狀的改變和細(xì)胞硬度的增加［17］。CCM3短期敲除和長(zhǎng)期失活模型的對(duì)比結(jié)果表明，肌動(dòng)蛋白骨架的重組和細(xì)胞力學(xué)的變化是CCM3失活的急性反應(yīng)，而內(nèi)皮細(xì)胞形狀變化是長(zhǎng)期的影響，可提高血管通透性引起血管相關(guān)疾病。

2.3 CCM3影響內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接腦內(nèi)皮屏障完整性損傷是顱內(nèi)海綿樣畸形（CCMs）病情發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，CCM3基因?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞緊密連接存在影響。研究發(fā)現(xiàn)，CCM3 參與合成一種高度保守的信號(hào)復(fù)合物——STRIPAK 復(fù)合物，可通過(guò)Hippo途徑整合多種細(xì)胞信號(hào)以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活［26］，也可與CDC42 結(jié)合形成CSC 復(fù)合物［27］。CCM3 參與形成的復(fù)合物可與PP2A磷酸酶和GCKⅢ家族20樣絲氨酸/蘇氨酸激酶（MST4、STK24和STK25）相互作用［28］，從而激活RhoA 抑制劑Moesin，抑制RhoA-Rho激酶活性，進(jìn)一步促進(jìn)貼壁連接和緊密連接［29］。STAMATOVIC S M 等［30］利用CCM3敲除模型研究該基因?qū)o密連接的影響機(jī)制，發(fā)現(xiàn)大腦內(nèi)皮細(xì)胞中CCM3基因表達(dá)減少后，改變了跨膜蛋白-支架蛋白和支架蛋白-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用，從而影響緊密連接的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，其中對(duì)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（Cortactin）的影響最為深遠(yuǎn)。CCM3突變后激活ERK1/2，導(dǎo)致Cortactin 磷酸化，進(jìn)而損害皮層肌動(dòng)蛋白環(huán)的組織與緊密連接的穩(wěn)定性，影響了血管屏障的完整性，并使支架蛋白和肌動(dòng)蛋白解離，重新分配到胞質(zhì)中并降解。在細(xì)胞層面CCM3的缺失導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維束增加，短期增加細(xì)胞硬度，最終導(dǎo)致長(zhǎng)期的細(xì)胞形態(tài)改變，從而影響緊密連接的穩(wěn)定性。以上研究表明，CCM3有穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的作用。

2.4 CCM3 參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)KOSKIM?KI J等［22］發(fā)現(xiàn)在CCM3基因敲除小鼠模型中AP-1 轉(zhuǎn)錄因子的亞單位Jun、Fos 和Jund 高表達(dá)，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、免疫和應(yīng)激具有重要作用。另外，CCM3 蛋白功能的喪失增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和氧化應(yīng)激［31］，從而導(dǎo)致炎性轉(zhuǎn)錄因子包括NF-κB、AP-1 和PPAR-1 上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生和釋放。在腫瘤細(xì)胞中，炎癥因子也會(huì)影響CCM3的表達(dá)，致癌信號(hào)通路（Jak3、Notch1 和NF-κB）受抑制后，對(duì)組成型CCM3 的表達(dá)產(chǎn)生部分抑制效果，而Jak3 和NF-κB 的激活因子——白細(xì)胞介素-2 則增強(qiáng)了CCM3的表達(dá)［32］。

MAPK 通路與炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)［33］，研究發(fā)現(xiàn)，CCM3可調(diào)控MAPK 通路中的信號(hào)分子。CCM3敲除后Mapk1 表達(dá)下調(diào)，而應(yīng)激性Mapk12 表達(dá)上調(diào)，另外編碼核糖體S6 激酶p90rsk 表達(dá)上調(diào)［34］，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、c-Fos 和CREB 表達(dá)調(diào)控局部炎癥反應(yīng)［22］。提示CCM3基因缺失可增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，而正常CCM3基因可抑制細(xì)胞因子的釋放，從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的功能，CCM3在炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用也影響著細(xì)胞癌變的發(fā)生。

2.5 CCM3 調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡CCM3在癌癥中表達(dá)模式和作用機(jī)制十分復(fù)雜，并且嚴(yán)格依賴于環(huán)境。一方面表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增生。CCM3缺失的內(nèi)皮細(xì)胞與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，能夠增強(qiáng)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵染［32］。CCM3 過(guò)表達(dá)激活胱天蛋白酶3（Caspase-3），從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［35］，抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和遷徙過(guò)程［25］，而CCM3表達(dá)下調(diào)則可加速腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［36］。

另一方面，CCM3還是重要的凋亡應(yīng)答抑制基因。CCM3在乳腺癌和皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤的惡性T細(xì)胞中也被證明可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡［37］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺腺癌［38-39］、喉鱗狀細(xì)胞癌［40］、膀胱癌［41］和非小細(xì)胞肺癌［42］中CCM3 表達(dá)水平明顯上調(diào)。CCM3抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，可通過(guò)激活磷酸酶和張力蛋白同源物等基因（Phosphatase and tensin homolog，PTEN）后，負(fù)調(diào)控三磷酸磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3）的表達(dá)［35］。CCM3的多方面作用暗示了不同癌癥類型通過(guò)micro（mi）RNAs發(fā)揮特有的調(diào)節(jié)機(jī)制。這些miRNAs 是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的小的非編碼RNA，因此可以在許多生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞代謝和增殖、應(yīng)激反應(yīng)和凋亡［43］。

綜上所述，CCM3在血管發(fā)育和形態(tài)穩(wěn)定的功能與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展有重要作用，具體的致病機(jī)制主要表現(xiàn)在CCM3可通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞力學(xué)變化、緊密連接等影響血管的生成發(fā)育，還通過(guò)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖凋亡來(lái)調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。