單細(xì)胞組學(xué)相關(guān)技術(shù)的研究進(jìn)展*

董媛媛, 孫桂江, 李遇伯， 李曉萌 △

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 1腔鏡檢查科, 2腎臟病血液凈化治療科 (天津 300211)； 3天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(天津 301600)

細(xì)胞是生物的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，多個(gè)功能相同或不同的細(xì)胞結(jié)合形成不同的細(xì)胞群，從而進(jìn)行生命活動(dòng)的傳遞。如果這些細(xì)胞發(fā)生功能紊亂將會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，從微觀角度可以體現(xiàn)在基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，蛋白質(zhì)合成代謝，細(xì)胞分泌以及細(xì)胞或細(xì)胞群之間的物質(zhì)代謝，信號(hào)傳導(dǎo)等的功能紊亂。相比于許多疾病的個(gè)體或組織的分析介紹，單細(xì)胞分析技術(shù)從單個(gè)細(xì)胞層面對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析從而得到更加全面的信息[1]，這有效地彌補(bǔ)由細(xì)胞異質(zhì)性導(dǎo)致個(gè)體或組織平均數(shù)值引起的誤差[2-3]，為更加充分地了解疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制以及個(gè)體差異化的研究提供了補(bǔ)充。了解單細(xì)胞層面的研究方法有很多，如質(zhì)譜、單細(xì)胞測(cè)序、微流控芯片、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)[4]。利用這些技術(shù)從“組學(xué)”角度探討單個(gè)細(xì)胞內(nèi)基因、蛋白等分子的分布、動(dòng)態(tài)變化并揭示其中的關(guān)聯(lián)以發(fā)現(xiàn)未知基因或新的細(xì)胞類型等信息[5]。依據(jù)遺傳中心發(fā)展的過程中包含的基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)以及代謝物等物質(zhì)，在單細(xì)胞組學(xué)中這些物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的的組學(xué)研究依次為單細(xì)胞基因組學(xué)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)以及單細(xì)胞代謝組學(xué)[6]。然而對(duì)這些方向的單一研究無法對(duì)疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的變化進(jìn)行全面解釋，于是對(duì)基因、蛋白質(zhì)等分子提出整合分析，進(jìn)而從多組學(xué)角度對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能等方面的改變進(jìn)行分析研究以闡明機(jī)體在疾病發(fā)展或藥物治療的過程中的轉(zhuǎn)變，為在人類發(fā)病機(jī)制的探索道路上提供新的指向。該綜述將從單細(xì)胞基因組學(xué)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)、單細(xì)胞代謝組學(xué)等方面對(duì)近年來的單細(xì)胞組學(xué)的研究進(jìn)行簡(jiǎn)略的介紹。

1 單細(xì)胞基因組學(xué)

基因組學(xué)是對(duì)基因組核酸堿基序列等分子的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析研究的學(xué)科[7-8]。通過基因組學(xué)的研究可尋找疾病相關(guān)的基因、疾病發(fā)生發(fā)展或藥物作用于機(jī)體后基因表達(dá)變化，為疾病的確診、干預(yù)以及預(yù)后保養(yǎng)等方面的研究提供理論依據(jù)[8-10]。

單細(xì)胞基因組學(xué)不僅可以詳細(xì)準(zhǔn)確地描述細(xì)胞類型和狀態(tài)，還可以尋找到未知的基因[11]。其基本的步驟如下：(1)樣品前處理;(2)分離細(xì)胞;(3)提取脫氧核糖核酸(DNA);(4)基因組擴(kuò)增;(5)構(gòu)建文庫;(6)基因組測(cè)序;(7)數(shù)據(jù)分析[12-13]。

許多研究采用單細(xì)胞基因組學(xué)的技術(shù)為研究提供可靠的數(shù)據(jù)支持，如Velmeshev等[14]對(duì)自閉癥譜系障礙和正?；颊叩纳蠈悠油渡渖窠?jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)特定基因集與自閉癥譜系障礙的患病程度之間存在關(guān)聯(lián)，對(duì)尋找治療疾病的有效靶點(diǎn)具有深遠(yuǎn)的意義。 Ludwig等[15]通過對(duì)線粒體突變進(jìn)行克隆追蹤，測(cè)定線粒體中不同水平的DNA突變，提高推斷克隆譜系的準(zhǔn)確性。提示通過單細(xì)胞基因組學(xué)研究不僅能了解基因狀況，還可對(duì)疾病治療有重要意義。

2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是指通過對(duì)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以及調(diào)控規(guī)律的研究以獲得細(xì)胞表型和功能信息的一門學(xué)科[16-17]。通過對(duì)一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的核糖核酸(RNA)分析獲取細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的具體情況，在基因表達(dá)水平上分析疾病發(fā)生、發(fā)展、藥物干預(yù)疾病的關(guān)鍵基因以及為進(jìn)一步的治療或機(jī)制研究提供依據(jù)[18-21]。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)可對(duì)單個(gè)細(xì)胞中數(shù)千種基因的信使RNA濃度進(jìn)行同時(shí)測(cè)量。單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重要手段之一，該技術(shù)不僅避免因樣本量過大忽略單個(gè)樣品的不足，還可擴(kuò)大識(shí)別的轉(zhuǎn)錄本范圍[22-23]。利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的基本操作如下：(1)樣品前處理;(2)分離和捕獲單細(xì)胞;(3)對(duì)細(xì)胞裂解或其他處理;(4)提取核糖核酸;(5)制備互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA);(6)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增;(7)測(cè)序;(8)數(shù)據(jù)處理[23-26]。

單細(xì)胞測(cè)序與其他技術(shù)結(jié)合可突破傳統(tǒng)測(cè)序高噪音、可靠性低、數(shù)據(jù)丟失等的局限，進(jìn)而獲得更加全面的基因表達(dá)譜[24,27-29]。例如，Hanchate 等[25]采用逆行病毒追蹤和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合的方法探討上游神經(jīng)元的分子特性以及調(diào)節(jié)特定神經(jīng)肽的調(diào)控因子。Aynaud等[30]采用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)將獨(dú)立成分分析與EWSR1-FLI1基因結(jié)合位點(diǎn)和開放染色質(zhì)區(qū)域的時(shí)間分辨映射結(jié)合，以闡明Ewing肉瘤內(nèi)部異質(zhì)性的來源。由此可見，單細(xì)胞測(cè)序與其他技術(shù)的結(jié)合分析可以為細(xì)胞或疾病的研究提供新的視角。

3 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)是指對(duì)在不同條件下的細(xì)胞、組織或生物體的蛋白質(zhì)組的表達(dá)、加工以及相互作用等過程研究的學(xué)科[31-33]。有文獻(xiàn)介紹稱世界上大部分疾病與蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)的生物學(xué)過程密切相關(guān)，與基因序列有關(guān)的疾病僅有約2%[34]。這是因?yàn)橄啾扔诨蚪M和轉(zhuǎn)錄組幾乎恒定的數(shù)據(jù)的情況，蛋白質(zhì)組因基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)后的修飾等過程變得更加復(fù)雜化[35-36]。從蛋白質(zhì)組出發(fā)更加詳細(xì)地了解疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制、臨床確診依據(jù)以及藥物作用位置等信息[37-39]。

單細(xì)胞蛋白組學(xué)旨在分析研究單個(gè)細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的變化情況。其基本程序如下：(1)樣品分離；(2)去除干擾；(3)提取蛋白質(zhì)；(4)處理消化；(5)質(zhì)譜分析；(6)數(shù)據(jù)處理等[40-41]。

近年來已有質(zhì)譜、流式細(xì)胞術(shù)、微流控芯片等單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)[42-43]。如 Fuchs等[44]采用流式細(xì)胞術(shù)的高維單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)正常和潰瘍性結(jié)腸炎患者的外周血自然殺傷細(xì)胞進(jìn)行研究，通過比較自然殺傷細(xì)胞、卵子頻率以及部分蛋白質(zhì)表達(dá)等變化，揭示疾病相對(duì)應(yīng)免疫細(xì)胞亞群的變化。Palii 等[45]介紹一種使用單細(xì)胞質(zhì)譜儀、細(xì)胞進(jìn)行條形碼、流式細(xì)胞術(shù)飛行時(shí)間、靶向質(zhì)譜法[穩(wěn)定同位素稀釋(SID)-選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)]相結(jié)合的可隨時(shí)間變化來量化蛋白質(zhì)的絕對(duì)濃度的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法，探究LS-TFs蛋白水平豐度在紅細(xì)胞系分化過程中的變化、雙潛能祖細(xì)胞中單細(xì)胞水平上是否存在共同表達(dá)，得到該蛋白豐度的改變是逐漸發(fā)生且其在細(xì)胞命運(yùn)中具有積極促進(jìn)作用的結(jié)論。然而流式細(xì)胞術(shù)具有因標(biāo)記蛋白的影響以及質(zhì)譜局限性的缺點(diǎn)，據(jù)此,班琳[42]采用具有能夠精確操控優(yōu)勢(shì)的微流控芯片技術(shù)，利用探針、芯片電泳以及實(shí)時(shí)成像平臺(tái)相結(jié)合的方法，探索單細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)以及蛋白質(zhì)通量狀況。通過利用不同技術(shù)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究，得到體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

4 單細(xì)胞代謝組學(xué)研究

代謝組學(xué)是對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究的一門學(xué)科。通過代謝組學(xué)研究不僅可以獲得機(jī)體代謝物及其產(chǎn)物變化情況，還可以獲取其涉及到的代謝通路相關(guān)的生物學(xué)信息，為進(jìn)一步探究疾病發(fā)生、發(fā)展的原因以及臨床確診、藥物干預(yù)、新材料的應(yīng)用等方面提供有力的理論依據(jù)[46-48]。

單細(xì)胞代謝組學(xué)是對(duì)生物體內(nèi)相對(duì)分子質(zhì)量<1 000且與細(xì)胞表型相關(guān)的小分子即包括中間產(chǎn)物在內(nèi)的某些代謝物變化情況的研究[2]。相比于多細(xì)胞或組織由于細(xì)胞異質(zhì)性引起的誤差，單細(xì)胞代謝組學(xué)分析不僅有效地避免這一缺陷并且可映射單一細(xì)胞功能以及揭示細(xì)胞異質(zhì)性與代謝間的關(guān)系[49]。其處理過程基本包括以下幾個(gè)步驟：(1)細(xì)胞分離；(2)樣本處理；(3)單細(xì)胞質(zhì)譜等技術(shù)的耦合分析；(4)數(shù)據(jù)篩選，如消除背景噪音、標(biāo)準(zhǔn)化處、峰對(duì)照等；(5)使用代謝分析工具進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如主成分分析；(6)代謝組數(shù)據(jù)根據(jù)m/z值初步鑒定代謝物;(7)根據(jù)豐度高的離子信號(hào)進(jìn)行MS/MS分析或與數(shù)據(jù)庫配對(duì)，獲得細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞物種或得到差異代謝物或主要代謝途[49-53]。單細(xì)胞代謝組分析的步驟并不是完全一樣的，可根據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷模员銤M足自身?xiàng)l件要求。

目前基于質(zhì)譜的單細(xì)胞代謝分析已廣泛應(yīng)用，例如具有較高特異性及重現(xiàn)性、敏感度好等優(yōu)勢(shì)的基質(zhì)輔助激光解吸電離、激光燒蝕電噴霧電離、激光捕獲顯微切割-液體渦流捕獲質(zhì)譜法等[2,54-56]。但單細(xì)胞質(zhì)譜分析也面臨檢測(cè)量低、內(nèi)容物易缺失、基質(zhì)干擾、鑒定代謝分子困難、活細(xì)胞內(nèi)代謝物變化快等巨大挑戰(zhàn)[57]。與其他技術(shù)相結(jié)合可以解決這些問題，如Zhu等[52]采用重新設(shè)計(jì)的T探針與串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合技術(shù)，可對(duì)懸浮液中活結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)在線的細(xì)胞內(nèi)容物分子結(jié)構(gòu)鑒定，從而獲得細(xì)胞的代謝變化，這可解決單細(xì)胞質(zhì)譜法在制備和取樣過程中內(nèi)容物丟失以及不能檢測(cè)懸浮細(xì)胞的障礙。Zhang等[58]應(yīng)用毛細(xì)管微取樣電噴霧離子質(zhì)譜結(jié)合離子遷移率分離方法，對(duì)單貼壁哺乳動(dòng)物的黏附細(xì)胞分析以及離子的數(shù)據(jù)庫配對(duì)分析，得到不同等壓離子的串聯(lián)質(zhì)譜圖從而鑒定單細(xì)胞產(chǎn)生的離子，避免了基質(zhì)對(duì)于離子信號(hào)的干擾。Wei等[59]介紹一種基于脈沖直流電噴霧電離源方法的Pico-ESI策略，不僅能從單細(xì)胞等極小型樣品中獲得大量與代謝物相關(guān)的數(shù)據(jù)，還可通過降低樣品流速避免數(shù)據(jù)的大量丟失。此外，也能減少基質(zhì)干擾。這些技術(shù)的結(jié)合對(duì)單細(xì)胞代謝組學(xué)研究發(fā)展具有里程碑的意義。

近年來，已有許多在單個(gè)細(xì)胞的代謝物上的研究。通過單細(xì)胞代謝組的研究，可以更好地了解細(xì)胞內(nèi)分子生物化學(xué)過程改變以及細(xì)胞表型異常等相關(guān)的生物信息，從而能有效地進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)，臨床診斷等。但單細(xì)胞代謝組學(xué)依然存在許多挑戰(zhàn)[49,60]，如許多分析工具不能覆蓋更多的代謝物；代謝物及其產(chǎn)物鑒定的困難；如何擁有較高的敏感度將單細(xì)胞內(nèi)的代謝物進(jìn)行定量分析；如何對(duì)活的單細(xì)胞內(nèi)代謝物隨時(shí)間變化的速率進(jìn)行量化等問題，雖然已有相關(guān)研究，但存在巨大困難亟需解決。

5 單細(xì)胞多組學(xué)研究

由于單水平的單細(xì)胞組學(xué)研究只能給出該層面的具體信息而不能詳細(xì)介紹關(guān)于該細(xì)胞的全面信息，對(duì)單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析研究應(yīng)運(yùn)而生[61]。已有許多單細(xì)胞水平的多組學(xué)研究，如Xhangolli等[62]從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)層面上對(duì)抗原刺激下嵌合抗原受體T(CAR-T)細(xì)胞進(jìn)行分析，從而探究單個(gè)嵌合抗原受體T細(xì)胞與天然T細(xì)胞間的差異控制以及具有抗腫瘤毒性的CAR-T細(xì)胞、細(xì)胞因子狀態(tài)和細(xì)胞分化表型間的關(guān)聯(lián)性，為藥物治療前后的變化評(píng)估以及質(zhì)量保證提供新的思路。而Ooi 等[63]介紹一種微流控的工作流程可對(duì)具有96個(gè)靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)和RNA進(jìn)行定量分析，從而將RNA與蛋白質(zhì)表達(dá)聯(lián)系起來呈現(xiàn)出更加全面的動(dòng)態(tài)生物學(xué)過程。Maurer-Alcalá等[64]通過探討美洲大瞼球菌、幾種雙合細(xì)菌、大型截形囊和貪婪的捕食性纖毛蟲鼻二式體在單細(xì)胞基因和轉(zhuǎn)錄進(jìn)化模式的復(fù)雜性，為研究不同微生物的生物學(xué)特征提供數(shù)據(jù)。多組學(xué)研究不僅可以獲取遺傳中心法則中相關(guān)物質(zhì)的關(guān)聯(lián)性以及全面的動(dòng)態(tài)生物學(xué)信息，還能得到微生物相關(guān)的生物譜信息。當(dāng)然多組學(xué)的大規(guī)模數(shù)據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的要求較高，需要進(jìn)一步研發(fā)[6]。

6 小結(jié)

綜上所述，單細(xì)胞的組學(xué)研究不僅消除細(xì)胞異質(zhì)性引起的數(shù)據(jù)損失，還可對(duì)從基因結(jié)構(gòu)到轉(zhuǎn)錄過程再到功能執(zhí)行的整個(gè)過程進(jìn)行系統(tǒng)地介紹。這為發(fā)現(xiàn)疾病以及診斷、治療和預(yù)后等提供有力的依據(jù)。目前，單細(xì)胞組學(xué)相關(guān)的研究雖然已有進(jìn)展，但挑戰(zhàn)依然存在，如多組學(xué)整合分析對(duì)相關(guān)組學(xué)數(shù)據(jù)并不能全面地分析、檢測(cè)小樣本量時(shí)所需高敏感度的缺少、樣本處理時(shí)的損失、其他物質(zhì)干擾等問題需要進(jìn)一步的研究解決。而在未來，單細(xì)胞水平的整合組學(xué)研究會(huì)逐漸剖開生命奧義，推動(dòng)醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)展。

利益相關(guān)聲明：所有作者共同認(rèn)可本文無相關(guān)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：綜述撰寫為董媛媛， 綜述設(shè)計(jì)為李曉萌，綜述指導(dǎo)為孫桂江，綜述修改為李遇伯。