FKBP38可調(diào)控多巴胺能神經(jīng)元的凋亡

劉 靜，謝彩婷，封文斌，趙文卓，李芳紅，吳曉麗，趙子建

(廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

帕金森病(Parkinson’s disease PD)又稱為震顫麻痹，是一種影響患者活動(dòng)能力的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，起病隱襲，進(jìn)展緩慢[1]。其主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元損傷，神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)以α-突觸核蛋白(α-synuclein)為關(guān)鍵成分的路易小體(Lewy body)，進(jìn)而引起神經(jīng)元變性、凋亡，導(dǎo)致腦部多巴胺水平降低[2]。文獻(xiàn)研究表明，減少多巴胺神經(jīng)元凋亡可一定程度改善PD的癥狀。目前臨床上用于治療PD的藥物(司來吉蘭和美多巴)均是通過提高多巴胺水平，從而減少神經(jīng)元凋亡。然而，這些藥物只能改善PD癥狀，并不能阻止病情的進(jìn)展，也無法治愈疾病[1-3]。因此，尋找新的靶點(diǎn)，在PD發(fā)病早期進(jìn)行基因修飾，抑制神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而改善PD癥狀，是極為迫切的事情。

FK506結(jié)合蛋白38 (FKBP38)是FKBP家族蛋白之一，特征在于其相應(yīng)的 mRNA 在人腦組織中顯著表達(dá)[4]，包含F(xiàn)K506結(jié)合域并表現(xiàn)出肽基脯氨酰異構(gòu)酶活性[5-6]。在小鼠胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)KBP38可通過拮抗Shh通路延緩神經(jīng)管的關(guān)閉[7-8]。并且FKBP38的丟失還會(huì)導(dǎo)致后神經(jīng)管細(xì)胞凋亡增加和發(fā)育異常[9]。此外，還有研究表明FKBP38通過其C端跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在線粒體外膜上，招募并幫助抗凋亡蛋白Bcl-2來抑制細(xì)胞凋亡[10-11]。這提示FKBP38可能是一種重要的細(xì)胞凋亡抑制劑[12]。但是，尚未有研究報(bào)道FKBP38在帕金森病中對多巴胺能神經(jīng)元的作用。

因此，本文旨在探討在PD體內(nèi)外模型中FKBP38蛋白表達(dá)情況，并選用神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的PD體外模型，研究過表達(dá)和敲減FKBP38后，對多巴胺能神經(jīng)元凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡♂的C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量(20～25) g，購買于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(廣東佛山，編號(hào)：44007200085200)。小鼠每籠5只，飼養(yǎng)溫度(21～25) ℃，12 h晝夜交替，自由飲水?dāng)z食，每周更換3～4次墊料，動(dòng)物在開展實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2細(xì)胞和慢病毒 MN9D(小鼠中腦多巴胺神經(jīng)元)細(xì)胞購自廣州吉尼歐公司。FKBP38慢病毒載體購自廣州賽業(yè)公司，慢病毒載體為LV-EFS>mFKbP8-PGK>Puro 和LV-CMV>eGFP/T2A/Puro(以下分別簡寫為OV-FKBP38及OV-NC)，LV-U6>mFKbP8[shRNA#2]-PGK>Puro和LV-U6 >Scramble-shRNA-PGK>EGFP/T2A/Puro(以下分別簡寫為sh-NC及sh-FKBP38)，該慢病毒中含有FKBP38全長cDNA，所有結(jié)構(gòu)都經(jīng)DNA測序驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染效果經(jīng)免疫印跡(Western blot)驗(yàn)證。

1.1.3試劑 RPMI1640(Lot：PM150110A)購自武漢普諾賽公司；胎牛血清購自于美國Gibco公司；胰酶(Lot：2120649)購買于美國Gibco公司；CCK-8(cell counting kit-8，批號(hào)：G909FA003)購自上海生物工程有限公司；DMSO購自于美國sigma aldrich公司；FKBP38抗體購自R&D 公司；α-synuclein、Tom20和Bax抗體購自美國CST公司；Bcl-2抗體購自英國Abcam公司；TH抗體購買于美國Gibco公司；魚藤酮和MPTP購自中國阿拉丁公司；MPP+購買于美國Sigma公司。

1.1.4儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱CLM-170B-8-NF型(ESCO，新加坡)；二級(jí)生物安全柜AC2-4S1型(ESCO，新加坡)；EPED-2TF純水儀(中國)；DYY-6C電泳儀(中國)；多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)TDZ5-WS型(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；流式細(xì)胞儀(DXP AthenaTM，美國)；Leica倒置顯微鏡(Leica，德國)；酶標(biāo)儀CMAXPLUS+ (美國)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc+XRS(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1小鼠分組及給藥 小鼠隨機(jī)分為2組，每組 15 只：對照組、模型組。以腹腔注射的方式給予模型組小鼠 10 mg·kg-1的MPTP，給予對照組小鼠相同體積的PBS。3 d注射1次，連續(xù)注射7次，在末次注射后的d 2進(jìn)行脫頸椎處死小鼠，立即取腦，冰上操作，剝離紋狀體和黑質(zhì)，液氮速凍，后轉(zhuǎn)至-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)R型因子分析及R型聚類分析結(jié)果，結(jié)合全區(qū)地質(zhì)、地球化學(xué)特征以及研究區(qū)現(xiàn)有礦化線索，將分析的20種元素進(jìn)行劃分，確定組合異常5個(gè)分別為Cr，Ni，Co組合，La，Nb，Th，U，Y組合，Ag，Cd，Cu，Pb，Zn組合，W，Sn，Mo，Bi組合及Au，As，Sb組合。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 MN9D細(xì)胞用添加10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每隔1天進(jìn)行換液，2～3 d進(jìn)行傳代，待細(xì)胞密度為85%左右，根據(jù)不同條件進(jìn)行刺激。魚藤酮及MPP+采用完全培養(yǎng)基溶解，刺激細(xì)胞時(shí)采取全換液的方式進(jìn)行。

1.2.3細(xì)胞分組及感染 將MN9D細(xì)胞分為FKBP38過表達(dá)組(OV-FKBP38)及對照組(OV-NC)、敲減FKBP38組(sh-FKBP38)及對照組(sh-NC)，將細(xì)胞鋪板接種于6孔板，每孔接種細(xì)胞數(shù)2×105個(gè)，放置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長于30%～50%時(shí)進(jìn)行感染慢病毒實(shí)驗(yàn)，收集細(xì)胞提蛋白進(jìn)行Western blot檢驗(yàn)慢病毒感染效率。

1.2.4CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性 將生長狀態(tài)良好的MN9D細(xì)胞及轉(zhuǎn)染慢病毒成功后的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液并鋪板接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，每孔接種細(xì)胞數(shù)2×104個(gè)，放置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組為不同濃度(8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0)μmol·L-1的魚藤酮處理MN9D組，及同濃度魚藤酮分別處理OV-NC、OV-FKBP38、sh-NC、sh-FKBP38組。過夜培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后，吸出原培養(yǎng)基，更換為提前配好不同濃度魚藤酮藥物的培養(yǎng)基；繼續(xù)放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)不同時(shí)間后，向每孔添加10 μL CCK-8溶液，貼壁加入以免產(chǎn)生氣泡，避光孵育，1～2 h后取出，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(A值)。

1.2.5Western blot檢測蛋白水平 在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入200 μL RIPA裂解液，裂解液含(RIPA、PMSF、蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑)，用無菌細(xì)胞刮緩慢刮下，置于冰上裂解10 min，超聲破碎1～2次，每次30 s，4 ℃離心機(jī)12 000 r·min-1離心20 min后,取上清于另一干凈Ep管中，蛋白定量 BCA 法檢測待測樣品濃度。待測樣品與5×上樣緩沖液稀釋混合，金屬浴10 min。取同等質(zhì)量蛋白樣品在質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%或12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，恒壓轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h或4 ℃過夜封閉。分別加一抗α-syn(1 ∶1 000)、FKBP38(1 ∶500)、Bax(1 ∶1 000)、TH(1 ∶1 000)、Tom20(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶2000) 、 β-actin(1 ∶5 000),4 ℃孵育過夜。過夜孵育后TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，再次TBST洗膜3次，ECL發(fā)光成像儀曝光。并應(yīng)用ImageJ軟件對目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值進(jìn)行分析，相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

2 結(jié)果

2.1 PD體內(nèi)模型中FKBP38表達(dá)情況如Fig 1所示，通過Western blot檢測MPTP誘導(dǎo)的PD體內(nèi)模型。結(jié)果顯示，在小鼠腦紋狀體和黑質(zhì)區(qū)域，α-synuclein蛋白的表達(dá)量水平明顯升高(P<0.01)，TH表達(dá)量水平明顯下降(P<0.01)(Fig 1A)。而在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠腦紋狀體區(qū)域中FKBP38表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，在黑質(zhì)區(qū)域中FKBP38表達(dá)量無明顯變化(Fig 1B)，說明在MPTP誘導(dǎo)的PD體內(nèi)模型中FKBP38在紋狀體中特異性下調(diào)，提示FKBP38與PD模型中的特異性蛋白(α-synuclein和TH)存在相關(guān)性。

Fig 1 Expression of FKBP38 protein in striatum and substantia nigra of PD model

Fig 2 Expression of FKBP38 in PD cell model A：α-synuclein/TH expression in PD cells; B：Tom20/FKBP38 expression in PD cells. *P<0.05,**P<0.01 vs control

2.3 穩(wěn)定過表達(dá)FKBP38的MN9D細(xì)胞株的建立如Fig 3所示，利用攜帶FKBP38的慢病毒感染MN9D細(xì)胞。隨后，我們利用Western blot檢測FKBP38 的表達(dá)水平。與MN9D組相比，OV-NC組和sh-NC組的FKBP38表達(dá)量均沒有明顯變化，說明選擇的載體合適。與OV-NC組相比，OV-FKBP38組的FKBP38表達(dá)量明顯上升(P<0.05)，說明FKBP38過表達(dá)細(xì)胞構(gòu)建成功。與sh-NC組相比，sh-FKBP38組的FKBP38表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，說明FKBP38敲減細(xì)胞構(gòu)建成功。

Fig 3 FKBP38 lentiviral transfection of MN9D cells

2.4 魚藤酮抑制MN9D細(xì)胞活力如Fig 4所示，CCK-8檢測不同濃度 (8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0)μmol·L-1的魚藤酮處理MN9D細(xì)胞8 h后，結(jié)果顯示，顯著抑制細(xì)胞增殖(Fig 4A)(P<0.01)，4 μmol·L-1濃度時(shí)，細(xì)胞活力下降到對照組的49.52%，且用魚藤酮(4 μmol·L-1)處理MN9D細(xì)胞不同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的增加，細(xì)胞活力降低加劇(Fig 4B)(P<0.01)處理8 h時(shí)，細(xì)胞活力為對照組50.08%。因此，選用魚藤酮(4 μmol·L-1)處理MN9D細(xì)胞8 h進(jìn)行后續(xù)研究。

Fig 4 Effect of rotenone on viability of MN9D cells

2.5 FKBP38對PD細(xì)胞活力下降的影響如Fig 5所示，魚藤酮處理MN9D細(xì)胞8 h后，與sh-NC組模型組相比，sh-FKBP38組模型組的細(xì)胞活力明顯下降(Fig 5A)(P<0.01)，表明FKBP38敲減后加劇PD細(xì)胞活力下降。而與OV-NC組模型組相比，OV- FKBP38組模型組的細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)(Fig 5B)(P<0.01)，表明過表達(dá)FKBP38可以明顯改善PD細(xì)胞活力下降。

Fig 5 Effect of FKBP38 on decreased viability

2.6 FKBP38對PD細(xì)胞凋亡的影響如Fig 6所示，Western blot 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組經(jīng)魚藤酮處理MN9D細(xì)胞8 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，凋亡蛋白Bax的表達(dá)沒有差異，但Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)，表明魚藤酮引起了多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。與OV-NC組模型組相比，OV-FKBP38組模型組的Bcl-2蛋白表達(dá)上升(P<0.01)，Bax的表達(dá)量沒有差異，Bcl-2/Bax比值上升(P<0.01)，說明過表達(dá)FKBP38可以明顯改善魚藤酮引起的多巴胺能神經(jīng)元凋亡。與sh-NC組模型組相比，sh-FKBP38組模型組的Bcl-2和Bax的表達(dá)量均無明顯差異，表明敲減FKBP38無明顯加劇魚藤酮引起的多巴胺能神經(jīng)元凋亡。

Fig 6 Effect of FKBP38 over expression on expression of Bcl-2，Bax protein in PD

3 討論

帕金森病是一種進(jìn)展非常緩慢的疾病，發(fā)病因素復(fù)雜，且不同患者病情輕重也存在很大的差異[13]。多巴胺是一種神經(jīng)遞質(zhì)，將信息從一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞傳至另一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，保證神經(jīng)的傳導(dǎo)性，由多巴胺能神經(jīng)元合成并儲(chǔ)存在囊泡中，而后通過胞裂外排的方式由神經(jīng)元釋放，多巴胺能神經(jīng)元的病變會(huì)導(dǎo)致帕金森病。這也是臨床上導(dǎo)致PD的主要病理特征，減少神經(jīng)元凋亡對緩解PD進(jìn)程有重要作用[14]。目前，關(guān)于帕金森病治療手段只能延緩但無法阻止疾病的進(jìn)展[15]?；蛑委熓桥两鹕≈委煹男屡d領(lǐng)域，由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中線粒體功能障礙在帕金森病發(fā)生中具有重要作用[16-17]。因此以線粒體相關(guān)基因?yàn)榘悬c(diǎn)尋找新的治療方法具有重要意義。同時(shí)，應(yīng)深入研究線粒體功能障礙分子機(jī)制，明確線粒體相關(guān)基因?qū)ε两鹕〉挠绊憽?/p>

為研究FKBP38對神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的帕金森病的影響，本課題組檢測在PD體內(nèi)外模型中FKBP38表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PD體內(nèi)模型中，與正常組相比模型組小鼠腦紋狀體區(qū)域中FKBP38表達(dá)水平明顯降低。同樣，在PD細(xì)胞模型中，與正常組相比FKBP38表達(dá)水平明顯特異性降低。猜測高表達(dá)FKBP38可能會(huì)延緩多巴胺神經(jīng)元凋亡從而緩解PD進(jìn)程。為進(jìn)一步探究FKBP38對帕金森病的影響，我們在體外實(shí)驗(yàn)中通過使用FKBP38慢病毒轉(zhuǎn)染MN9D細(xì)胞來檢測其表型變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，魚藤酮可明顯降低MN9D細(xì)胞活力，并通過降低Bcl-2的表達(dá)量引起MN9D細(xì)胞凋亡。而過表達(dá)FKBP38后能明顯改善魚藤酮引起的細(xì)胞活力下降，表明過表達(dá)FKBP38可明顯提高PD細(xì)胞活力。過表達(dá)FKBP38后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯升高，Bcl-2/Bax比值明顯升高，表明過表達(dá)FKBP38改善魚藤酮引起的多巴胺能神經(jīng)元凋亡可能是通過線粒體內(nèi)源途徑 Bcl-2/Bax 通路誘導(dǎo)的。說明過表達(dá)FKBP38在帕金森病的發(fā)展過程中發(fā)揮著抑制多巴胺能神經(jīng)元凋亡的作用。這與先前研究中FKBP38錨定在線粒體外膜招募Bcl-2從而抑制凋亡作用相一致[11]。

綜上所述，F(xiàn)KBP38表達(dá)在魚藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型被特異性下調(diào)，敲減FKBP38加劇魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，通過過表達(dá)FKBP38能夠明顯恢復(fù)魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降，并抑制魚藤酮引起的細(xì)胞凋亡。提示FKBP38與多巴胺神經(jīng)元凋亡相關(guān)，有望成為治療或者減緩帕金森病進(jìn)程的重要靶點(diǎn)。