高原低氧條件下紅景天苷對(duì)小鼠記憶損傷的保護(hù)作用

秦寧寧，申亦可，程俊飛，張曉靜，李文斌，王 榮

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050)

高海拔地區(qū)低壓低氧的環(huán)境會(huì)造成記憶障礙、睡眠障礙、情緒障礙等與腦功能相關(guān)的影響[1-3]。低壓低氧引起的記憶損傷通常與活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生、神經(jīng)遞質(zhì)及調(diào)節(jié)劑水平的變化、海馬神經(jīng)變性等有關(guān)。目前，雖然已經(jīng)充分證明不同海拔高度和持續(xù)時(shí)間對(duì)記憶功能有不同程度的損害，但卻尚未開發(fā)出廣泛有效的藥物來改善這種損傷。目前常用的治療高原低氧損傷的藥物主要有乙酰唑胺、地塞米松等，但由于其存在副作用，不建議用于預(yù)防[4]。因此，在高原低氧條件下評(píng)估以尋找對(duì)記憶損傷有效的預(yù)防藥物具有重要意義。

紅景天苷是紅景天屬藥用植物的主要活性成分，已被證實(shí)具有抗癌、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)作用[5-7]。但是對(duì)于紅景天苷神經(jīng)保護(hù)作用過程中所涉及的作用機(jī)制還有太多的不明確關(guān)系，其研究尚停留在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)階段。在本研究中，我們旨在評(píng)估紅景天苷是否能夠改善高原低氧造成的小鼠記憶障礙，并進(jìn)一步探討了紅景天苷是否通過減輕氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平及減少神經(jīng)元凋亡來改善高原低氧造成的記憶損傷。

1 儀器與材料

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，♂，體質(zhì)量(20±2) g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010]。

紅景天苷(寶雞晨光生物，批號(hào)：HS181211S1，純度≥98%)；SOD試劑盒(批號(hào)：20210819)、MDA測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20210628)、GSH測(cè)試盒(批號(hào)：20210819)、H2O2測(cè)試盒(批號(hào)：20210625)、谷氨酸測(cè)試盒(批號(hào)：20210926)、A-CHE測(cè)試盒(批號(hào)：20210712)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Bax、caspase-3、Grin1抗體，辣根過氧化物酶(horse reddish peroxidase，HRP)標(biāo)記二抗均購(gòu)自proteintech公司。

Panlab水迷宮(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；MDF-U2086S超低溫冰箱(SANYO)；3K15型4 ℃高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(sigma)；Tissuelyser-24多樣品組織研磨機(jī)(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；SpectraMax i3型全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀(Molecular)等。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立及分組將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成平原對(duì)照組(Con組)、高原模型組(Hyp組)、紅景天苷組(Sal組)，每組16只。Con組和Hyp組的小鼠給予等量的滅菌注射用水，Sal組給予10 mg·kg-1的紅景天苷。

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，各組小鼠按劑量預(yù)防灌胃給藥3 d后急進(jìn)青海玉樹巴塘全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(海拔4 010 m)，運(yùn)送途中果凍補(bǔ)水。抵達(dá)高原后，缺氧暴露1 d，期間繼續(xù)每日按劑量給藥，自由獲取食水，于末次給藥1 h后開始實(shí)驗(yàn)。平原組的小鼠與高原組同時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。

2.2 Morris 水迷宮行為實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮由一個(gè)直徑120 cm的灰色圓形水池組成，水池壁標(biāo)有4個(gè)明顯標(biāo)記，并以此將水池分為4個(gè)象限，即第1、2、3和4象限。平臺(tái)位于第1象限中間位置，水深為高出平臺(tái)1 cm，水溫控制在(19～21) ℃，如Fig 1所示。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)6 d，前5 d學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練，每天將小鼠面向池壁分別從不同象限的入水點(diǎn)放入水中，記錄其找到平臺(tái)所需的時(shí)間，即為潛伏期。如果在60 s內(nèi)找不到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)并停留10 s，潛伏期記為60 s，每日進(jìn)行兩次測(cè)試，計(jì)算每個(gè)訓(xùn)練日的平均值。d 6為正式實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠在沒有平臺(tái)的情況下游泳60 s內(nèi)的潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)。

Fig 1 Schematic diagram of Morris water maze experiment

2.3 小鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定按照試劑盒說明書檢測(cè)小鼠腦組織MDA含量、H2O2含量、GSH含量和SOD活力。

2.4 小鼠腦組織及血清神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)定通過摘眼球采血留取小鼠血液標(biāo)本0.5 mL，室溫下靜置2 h后4 500 r·min-1離心10 min獲取血清。小鼠頸椎脫臼處死，獲取腦組織。按照試劑盒說明書檢測(cè)小鼠腦組織及血清中的谷氨酸含量及AChE活力。

2.5 小鼠腦組織HE染色及尼氏染色用多聚甲醛固定液固定小鼠腦組織，組織固定好后切片，脫蠟至水，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色或尼氏染色、脫水封片。

2.6 蛋白印跡法取小鼠海馬體組織加入預(yù)冷的RIPA裂解液(含1% PMSF)，置于冰上進(jìn)行勻漿，充分研磨后繼續(xù)置于冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液。用10% SDS-PAGE凝膠在恒壓條件下電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在室溫下與5%脫脂牛奶孵育2 h。在4 ℃下條帶與一抗孵育過夜(Bax 1 ∶1 000；caspase-3 1 ∶500；Grin1 1 ∶1 000；β-actin 1 ∶3 000)。1× TBST洗滌3次，每次10 min，并在室溫下孵育二抗1 h。1× TBST洗3次，每次10 min，顯影。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

3 結(jié)果

3.1 紅景天苷對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)廣泛用于研究學(xué)習(xí)記憶的方法，本文首先通過測(cè)試小鼠潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)研究小鼠學(xué)習(xí)記憶情況。結(jié)果如Fig 2所示，與Con組相比，Hyp組小鼠潛伏期從d 3開始明顯增加，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯下降；與Hyp組相比，Sal苷組小鼠潛伏期在d 3開始明顯降低，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(均P<0.05)，說明紅景天苷可以改善高原低氧條件下小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

3.2 紅景天苷對(duì)小鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響高原低氧環(huán)境造成的氧化應(yīng)激會(huì)對(duì)小鼠腦組織神經(jīng)元造成損傷，研究結(jié)果顯示，與Con組比較，Hyp組小鼠腦組織MDA和H2O2含量明顯升高，GSH含量明顯降低。與Hyp組比較，紅景天苷能降低小鼠腦組織中MDA和H2O2含量，提高GSH含量及SOD活力，表明紅景天苷可以減輕氧化應(yīng)激損傷(P<0.01)，見Tab 1。

Fig 2 The protective effect of salidroside on memory deficits in mice induced by high altitude hypoxia(n=16)

Tab 1 Effects of salidroside on oxidative stress indicators in

3.3 紅景天苷對(duì)小鼠腦組織及血清神經(jīng)遞質(zhì)的影響乙酰膽堿(ACh)及谷氨酸在學(xué)習(xí)記憶過程中起重要的作用，而AChE活力會(huì)直接影響乙酰膽堿的含量。本部分主要通過測(cè)定組織及血清中AChE活力及谷氨酸含量等方面來進(jìn)一步評(píng)價(jià)紅景天苷對(duì)低氧記憶損傷的改善作用。如Tab 2所示，與Con組比較，Hyp組小鼠腦組織和血清中乙酰膽堿酯酶活力明顯升高，給予紅景天苷后明顯下降(P<0.05或P<0.01)。在Hyp組中谷氨酸含量及谷氨酸受體(Grin1)表達(dá)明顯增高，紅景天苷預(yù)防給藥可明顯降低其含量及受體的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，如Fig 3所示，表明紅景天苷可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平改善小鼠的記憶能力。

Tab 2 Effects of salidroside on neurotransmitters in

Fig 3 Effect of salidroside on expression of Grin1 in mouse hippocampus

3.4 紅景天苷對(duì)小鼠腦組織病理變化的影響海馬體是大腦中學(xué)習(xí)記憶的重要區(qū)域，尼氏小體分布于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)尼氏小體染色變淡甚至溶解消失時(shí)，表明神經(jīng)細(xì)胞受到損傷情況。在高原低氧條件下，小鼠腦組織神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)完整性會(huì)受到影響，通過HE染色觀察海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性，尼氏染色進(jìn)一步反映神經(jīng)元功能活性。由Fig 4可以看出,Con組小鼠的海馬體神經(jīng)元排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，核結(jié)構(gòu)清晰，未出現(xiàn)明顯病理變化(Fig 4A-a)，海馬體尼氏小體含量豐富(Fig 4B-a)；Hyp組小鼠的海馬體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)受到損害，核固縮明顯(Fig 4A-b)，尼氏小體數(shù)量減少(Fig 4B-b)；預(yù)防給予紅景天苷可以緩解這些損傷(Fig 4A-c)，增加尼氏小體數(shù)量(Fig 4B-c)，表明紅景天苷可以緩解高原低氧對(duì)小鼠腦組織神經(jīng)元的損傷。

Fig 4 The pathological changes in mouse brain tissues

3.5 紅景天苷對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元Bax和caspase-3表達(dá)的影響學(xué)習(xí)記憶功能障礙是由神經(jīng)元受損或凋亡引起，而凋亡過程主要與Bcl-2和caspase家族相關(guān)。如Fig 5所示，與Con組比較，Hyp組小鼠海馬中Bax和caspase-3含量明顯升高，給予紅景天苷后明顯下降(P<0.05或P<0.01)，結(jié)果表明中，在高原低氧條件下紅景天苷可以抑制小鼠腦組織神經(jīng)元的凋亡。

Fig 5 Effects of salidroside on expression of Bax and caspase3 in mouse hippocampus

4 討論

高原低氧會(huì)導(dǎo)致組織氧氣供應(yīng)失衡，缺氧會(huì)嚴(yán)重?fù)p害人類的認(rèn)知和學(xué)習(xí)[8]。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)公認(rèn)通過動(dòng)物行為學(xué)來研究學(xué)習(xí)記憶的方法，可以減少氣味痕跡的干擾，被廣泛用于空間學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)研究。Xu等[9]用小鼠在Morris水迷宮中潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)等指標(biāo)研究藥物對(duì)認(rèn)知功能的改善作用。本研究在高原低氧下進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，結(jié)果顯示，與Hyp組相比，Sal組潛伏期明顯減少，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，這些數(shù)據(jù)表明小鼠花費(fèi)了更少的時(shí)間來尋找平臺(tái)，并且在平臺(tái)處多次探索，說明在高原低氧下紅景天苷提高了小鼠的記憶能力。

低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是許多神經(jīng)退行性疾病的病因。低氧環(huán)境下相關(guān)ROS生成和抗氧化保護(hù)之間的不平衡會(huì)導(dǎo)致生物分子的氧化損傷，其中包括H2O2等自由基。ROS會(huì)誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化產(chǎn)生MDA，造成腦組織神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡，導(dǎo)致學(xué)習(xí)與記憶功能障礙[10]。SOD和GSH作為抗氧化劑系統(tǒng)可以消除體內(nèi)ROS，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用[11]。研究結(jié)果顯示，紅景天苷可以減少高原低氧條件下小鼠腦組織中MDA、H2O2含量，提高GSH含量及SOD活力，表明紅景天苷可以通過減輕氧化應(yīng)激損傷改善小鼠記憶能力。

乙酰膽堿和谷氨酸與神經(jīng)元信息傳遞、營(yíng)養(yǎng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶等過程有著緊密的聯(lián)系。神經(jīng)遞質(zhì)的水平會(huì)影響神經(jīng)元的功能，包括神經(jīng)遞質(zhì)的含量及參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程的分子和靶標(biāo)。乙酰膽堿是與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)的重要中樞膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)，海馬中ACh水平的降低能夠引起學(xué)習(xí)記憶障礙[12]，含量水平與AChE活性相關(guān)。正常生理狀態(tài)下，AChE能夠維持ACh含量的穩(wěn)定，避免其對(duì)于突觸后膜受體的過度刺激；病理?xiàng)l件下，AChE活性的異常升高，使ACh降解速度加快，從而造成含量顯著降低，生物信號(hào)不能得到正常傳導(dǎo)。另外，谷氨酸是人體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與維系腦部的血液循環(huán)，調(diào)控人腦的功能；其在人體內(nèi)屬低水平游離氨基酸，含量過高(細(xì)胞毒性)引起認(rèn)知功能障礙[13]。在本研究中，紅景天苷可以降低小鼠腦組織和血清中的乙酰膽堿酯酶活力及谷氨酸含量，同時(shí)降低Grin1的表達(dá)，表明紅景天苷可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平改善小鼠記憶能力。

海馬體是大腦中學(xué)習(xí)和記憶的重要區(qū)域，因此海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能備受關(guān)注[14]。有研究表明，急性高原缺氧下大鼠海馬體嚴(yán)重受損，錐體細(xì)胞數(shù)量減少，色酸性凝結(jié)和神經(jīng)變性[15-16]。病理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高原低氧條件下小鼠海馬體的神經(jīng)元紊亂變性甚至凋亡，給予紅景天苷可以緩解神經(jīng)元的損傷。缺氧環(huán)境會(huì)增加海馬體中caspase-3表達(dá)的增加并誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡[17-18]。本研究結(jié)果顯示，紅景天苷可以減少促凋亡因子Bax及caspase-3的表達(dá)，表明紅景天苷可以抑制神經(jīng)元凋亡，保護(hù)海馬神經(jīng)元免受急性高原缺氧損傷。

綜上所述，高原低氧條件下紅景天苷可以通過減少氧化應(yīng)激損傷/調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平以及抑制神經(jīng)元凋亡來減輕急性缺氧誘導(dǎo)的記憶障礙。因此，本研究為將紅景天苷作為改善急性高原低氧下認(rèn)知障礙的潛在治療藥物提供了理論基礎(chǔ)。