愛帕琳肽13/血管緊張素受體AT1相關(guān)受體蛋白同源二聚體對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞行為的影響

王德秀，李建設(shè)，宋 超，王太千，殷 月，肖長昊，王學(xué)健，魯 洪，蔡 欣

(濰坊醫(yī)學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、2.臨床醫(yī)學(xué)院、3.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、4.藥學(xué)院，山東 濰坊 261053)

近年來，隨著生活水平的不斷提高，動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、心衰等心血管疾病的發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重威脅著人類的健康，探究這類疾病發(fā)病的病理生理機(jī)制以及尋找有效的藥物成為當(dāng)今的一項(xiàng)重大任務(wù)。血管重構(gòu)(vascular remodeling，VR)是動(dòng)脈血管內(nèi)皮受損后，為適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境變化而發(fā)生的結(jié)構(gòu)和功能的改變，包括血管壁細(xì)胞的增生、肥大、凋亡、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生及降解等細(xì)胞生物學(xué)變化[1]。研究發(fā)現(xiàn)VR既是心血管疾病惡化的重要病理基礎(chǔ)，也是心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的病因，因此，探究VR過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞的行為學(xué)已成為治療心血管疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

血管緊張素受體AT1相關(guān)受體蛋白(putative receptor protein related to AT1，APJ)是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)A類家族的成員之一，在心血管系統(tǒng)具有較高表達(dá)水平，愛帕琳肽(Apelin)是APJ的內(nèi)源性配體，Apelin/APJ系統(tǒng)能促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移，還可促進(jìn)血管生成，參與心血管功能，在心血管調(diào)節(jié)中具有降低血壓、增強(qiáng)心臟收縮的作用，是心血管穩(wěn)態(tài)中重要的調(diào)節(jié)因子[2]。近幾年，APJ作為心血管相關(guān)疾病治療靶點(diǎn)的潛力引起了越來越多的關(guān)注。事實(shí)上，臨床前和最近的臨床證據(jù)都表明，APJ是治療肺動(dòng)脈高壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心衰等心血管疾病的重要靶點(diǎn)[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，APJ除了能以單體的形式存在，還可以形成同源二聚體，在受體密度小于0.3顆粒/平方微米(particles/μm2)的情況下(靜息狀態(tài))，APJ同源二聚體占APJ總量的36%，Apelin-13能上調(diào)APJ表達(dá)，且同源二聚體的表達(dá)也隨之升高[5]，另外，APJ同源二聚體具有不同于單體的信號(hào)通路，能激活Gαi3和Gαq信號(hào)通路[6]。因此，本課題探討APJ同源二聚體對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞( human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)增殖、遷移和管腔形成能力的影響，該研究將有助于為臨床的血管修復(fù)重建以及心血管疾病的治療提供新靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞HUVECs和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell, CHO)(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)。

1.2 藥品與試劑Apelin -13(美國Phoenix Pharmaceuticals Inc，批號(hào)：427374)，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國Cytiva公司，批號(hào)：SH30243.01)，胰酶EDTA消化液和青鏈霉素溶液(100×)(北京索萊寶公司，批號(hào)：T1300、P1400)，Biocoat 356234 Matrigel基質(zhì)膠(美國康寧公司，批號(hào)：356234)，兔抗APJ抗體和小鼠抗β- actin抗體(美國Proteintech公司，批號(hào)：20341-1-AP、66009-1-Ig)，Laser BioLab MALDI Calibration kit和MonoTip C18(日本Shimadzu公司，批號(hào)：TO-724R00、5010-21002 )。

1.3 儀器Herocell 180型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，multiskan go酶標(biāo)儀和FluorChem Q化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) (美國Protein Simple公司)，AXIMA Assurance基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(日本Shimadzu公司)，xCELLigence實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀(美國ACEA Biosciences公司)

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs和CHO細(xì)胞置于10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.4.2Western blot實(shí)驗(yàn) 棄掉培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加入含有PMSF的RIPA裂解液，槍頭吹打，收集細(xì)胞到EP管中，4 ℃離心，取上清，一部分樣品用于BCA法測(cè)定蛋白濃度，剩余樣品加入4×上樣緩沖液，煮沸10 min，分裝進(jìn)行Western blot。樣品經(jīng)電泳和轉(zhuǎn)膜后，用脫脂奶粉封閉1 h，兔抗APJ(1 ∶1 000)于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜后，洗膜，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體( 1 ∶2 000)于室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL化學(xué)發(fā)光工作液，采用超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀成像，隨后用超純水和再生液處理膜，進(jìn)行內(nèi)參β-actin的表達(dá)，抗體分別是鼠抗β-actin(1 ∶1 000)和山羊抗鼠單克隆抗體( 1 ∶10 000)。根據(jù)得到的條帶對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.4.3基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Fligh Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)分析 HUVECs長到90%左右將蛋白提出，分別加入5 μL兔抗APJ抗體和50 μL protein A/G beads 4 ℃孵育過夜，3 000×g離心去除上清，TBS 溶液清洗3次，0.1 mol·L-1glycine-HCl 洗脫抗原后，3 000×g離心，取上清為待分析蛋白樣品。所得待分析蛋白樣品經(jīng) MonoTip C18脫鹽后上樣。樣品檢測(cè)結(jié)果用 Laser BioLab MALDI Calibration kit 進(jìn)行校正。

1.4.4Apelin-13引起50%最大效應(yīng)的濃度 (EC50)的檢測(cè) 在E-Plate16的孔中加入100 μL培養(yǎng)基后，進(jìn)行基線檢測(cè)(cell index<0.063)，隨后向孔中再加入100 μL HUVECs懸液，10 000個(gè)細(xì)胞/孔，在培養(yǎng)箱中放置 30 min 后，放在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀(Real-Time Cell Analyzers，RTCA)上，24 h后，分別用0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5和 10 μmol·L-1的 Apelin-13 處理HUVECs，結(jié)果用 RTCA Software 2.0進(jìn)行分析。

1.4.5細(xì)胞分組 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，APJ同源二聚體在Apelin-13的刺激下表達(dá)增多，且APJ 的跨膜區(qū)1(transmembrane domain 1，TM1)能阻斷APJ同源二聚體的形成[5]，基于此，本研究通過添加Apelin-13作為APJ同源二聚體組，添加 TM1作為APJ單體組。將HUVECs分為空白對(duì)照組、APJ同源二聚體組和APJ單體組，分別用 PBS、Apelin-13(100 nmol·L-1)+PBS和Apelin-13(100 nmol·L-1)+TM1(4 μmol·L-1)處理，APJ單體組中TM1在37 ℃，孵育1 h后再加入Apelin-13。

1.4.6CCK-8實(shí)驗(yàn) HUVECs消化后按1×105個(gè)/孔接種于96孔板中。待細(xì)胞長至貼壁后，加入10 μL/孔的CCK-8溶液，根據(jù)分組條件對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行不同刺激，37 ℃，1 h，用酶標(biāo)儀(450 nm)測(cè)定各孔的吸光度(OD) 。

1.4.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，待長到80%左右，去除培養(yǎng)基，用10 μL槍頭在孔中間劃一道豎線，PBS洗兩遍去除劃下來的細(xì)胞，然后根據(jù)分組條件對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行不同刺激，并放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別于2、4、8、16和24 h后拍照觀察細(xì)胞遷移的狀態(tài)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.8細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前24 h將高壓好的100 μL槍頭放入 -20 ℃冰箱預(yù)冷，基質(zhì)膠放入4 ℃ 冰箱液化備用。用預(yù)冷槍頭向置于冰上的96孔板中加入80 μL/孔的基質(zhì)膠，隨后放入培養(yǎng)箱中固化基質(zhì)膠1 h。各組細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，按照2×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度種在基質(zhì)膠上，并將96孔板放于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，顯微鏡下觀察HUVECs的成管情況并拍照計(jì)算形成管腔數(shù)，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 APJ在HUVECs中的表達(dá)將HUVECs和CHO細(xì)胞提取蛋白后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，根據(jù)APJ 的蛋白分子量發(fā)現(xiàn)(Fig 1)，HUVECs中蛋白在43 kD處存在表達(dá)，與理論值相符，CHO無表達(dá)，表明HUVECs中存在APJ的表達(dá)。

Fig 1 Expression of APJ in HUVECs and CHO

2.2 APJ同源二聚體在HUVECs中的表達(dá)根據(jù)MALDI-TOF MS質(zhì)譜掃描結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，如Fig 2所示，APJ不僅能以單體的形式存在，還能以同源二聚體形式在HUVECs中表達(dá)，且同源二聚體表達(dá)量是單體的0.22倍(P<0.01)。

Fig 2 Expression of APJ homodimer in

2.3 不同濃度的 Apelin-13 對(duì)HUVECs活力的影響為了探究APJ同源二聚體對(duì)HUVECs行為的影響，我們首先用RTCA檢測(cè)引起 50%最大效應(yīng)的濃度(EC50)，如Fig 3A所示，分別用不同濃度的Apelin-13(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5和10 μmol·L-1)處理HUVECs ，并用 RTCA Software 2.0 對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，如Fig 3B所示，EC50為 2.26×10-8mol·L-1，且引起最大效應(yīng)的濃度為1×10-6mol·L-1。

Fig 3 Effects of different concentrations of Apelin-13

2.4 APJ同源二聚體促進(jìn)HUVECs增殖本實(shí)驗(yàn)利用CCK-8法檢測(cè)對(duì)照組、APJ同源二聚體組和單體組的HUVECs增殖情況，如Fig 4所示，與PBS組相比，Apelin-13+PBS和Apelin-13+TM1組的HUVECs的增殖顯著增加，16 h的增殖最快，同時(shí)，Apelin-13+PBS組HUVECs的增殖效果明顯快于Apelin-13+TM1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明APJ同源二聚體的促增殖能力強(qiáng)于APJ單體。

Fig 4 Effect of APJ homodimer on proliferation

2.5 APJ同源二聚體促進(jìn)HUVECs遷移HUVECs劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 5A所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的不斷延長，各組細(xì)胞向劃痕裸區(qū)遷移，劃痕距離逐漸減小。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如Fig 5B所示，與PBS組相比，各時(shí)間點(diǎn)的Apelin-13+PBS組和Apelin-13+TM1組的遷移速度明顯加快，其中Apelin-13+PBS組的遷移速度明顯快于Apelin-13+TM1組，且16 h的遷移速度最快(P<0.01)，表明APJ同源二聚體的促遷移能力高于APJ單體。

Fig 5 Effect of APJ homodimer on migration

2.6 APJ同源二聚體促進(jìn)HUVECs成管鏡下觀察 HUVECs 成管情況，如Fig 6A所示，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞在基質(zhì)膠上培養(yǎng)4 h后均出現(xiàn)成管，激動(dòng)劑處理時(shí)間越長，小管的密度越多，總管腔面積也越大。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如Fig 6B所示，與PBS組相比，各時(shí)間點(diǎn)的Apelin-13+PBS組和Apelin-13+TM1組的細(xì)胞成管數(shù)目明顯增多，16 h細(xì)胞成管數(shù)目最多，且Apelin-13+PBS組的成管數(shù)目明顯多于Apelin-13+TM1組(P<0.05)，表明APJ同源二聚體的促成管能力高于APJ單體。

Fig 6 Effect of APJ homodimer on tube formation

3 討論

生理狀態(tài)下，成體的血管內(nèi)皮細(xì)胞更新率很低，但是在病理狀態(tài)(如動(dòng)脈粥樣硬化、惡性腫瘤、糖尿病等)下可以發(fā)生血管新生，即血管內(nèi)皮細(xì)胞脫離原來的靜息狀態(tài)，出現(xiàn)增殖、遷移并以出芽方式形成管狀結(jié)構(gòu)，管狀結(jié)構(gòu)的不斷延伸逐漸與周圍血管連接形成新生血管[7-8]。血管新生在腫瘤生長、血管生成、血管重構(gòu)和炎癥反應(yīng)等許多生理病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9-10]。在視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中，內(nèi)皮細(xì)胞遷移引起血管收縮，收縮的血管通過內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方式進(jìn)行血管重塑，形成完整的血管網(wǎng)絡(luò)；高糖誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡分泌的白介素1β通過促進(jìn)大鼠原代主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖遷移，加速動(dòng)脈損傷后內(nèi)膜的新生[11]。人參皂苷通過促進(jìn)血管生成改善糖尿病大鼠的皮膚損傷[12]，卵泡抑素樣蛋白1通過增強(qiáng)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、黏附以及血管的形成進(jìn)行肺血管重塑，從而預(yù)防和治療肺動(dòng)脈高壓[13]?？梢?，內(nèi)皮細(xì)胞正常的增殖、遷移和成管在VR和各類心血管疾病中發(fā)揮著非常重要的作用。

Apelin是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的APJ的內(nèi)源性配體，在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，大量研究表明， Apelin/APJ系統(tǒng)能通過ERK/cyclinD1途徑促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖[14]，在自發(fā)性高血壓大鼠中通過激活自噬促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖[15]。Apelin/APJ系統(tǒng)還可促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞和人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖[16-17]。另外，Apelin-13能夠促進(jìn)猴脈絡(luò)膜/視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔的形成，加速視網(wǎng)膜新生血管的形成。本課題組前期通過生物物理和生物化學(xué)的方法(免疫共沉淀、熒光共振能量轉(zhuǎn)移與生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移等)已在體外檢測(cè)到APJ同源二聚體的存在[5]，本實(shí)驗(yàn)通過Western blot和MALDI-TOF MS在原生細(xì)胞中再次證實(shí)，APJ和APJ同源二聚體均能表達(dá)于HUVECs，且Apelin-13的EC50為 2.26×10-8mol·L-1，引起最大效應(yīng)的濃度為1.0×10-6mol·L-1。隨后我們利用CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定在1.0×10-7mol·L-1Apelin-13的刺激下，APJ同源二聚體對(duì)HUVECs增殖的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Apelin-13+PBS組(APJ同源二聚體組)和Apelin-13+TM1組(APJ單體組)的HUVECs的增殖能力較PBS組顯著增強(qiáng)，且Apelin-13+PBS組的增殖效果明顯好于Apelin-13+TM1組，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)Apelin-13處理16 h的增殖最快，說明APJ同源二聚體的促增殖能力強(qiáng)于APJ單體。利用細(xì)胞劃痕法檢測(cè)APJ同源二聚體對(duì)HUVECs遷移的影響，結(jié)果顯示Apelin-13+PBS組細(xì)胞向劃痕裸區(qū)遷移速度明顯快于Apelin-13+TM1組，且16 h的遷移速度最快，表明APJ同源二聚體的促遷移能力高于APJ單體。通過人工基底膜(Matrigel)包被檢測(cè)APJ同源二聚體對(duì)HUVECs成管能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在基質(zhì)膠中孵育后均能出現(xiàn)成管，隨著激動(dòng)劑刺激時(shí)間延長，小管的密度逐漸增多，總管腔面積也逐漸增大。各時(shí)間點(diǎn)的Apelin-13+PBS組和Apelin-13+TM1組的細(xì)胞成管數(shù)目明顯多于PBS組，激動(dòng)劑刺激16 h細(xì)胞成管數(shù)目最多，且Apelin-13+PBS組的成管數(shù)目明顯多于Apelin-13+TM1組，上述結(jié)果表明APJ同源二聚體的促增殖、遷移和成管能力均高于APJ單體。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，APJ同源二聚體對(duì)HUVECs增殖、遷移和血管形成都有促進(jìn)作用，優(yōu)于單體，且激動(dòng)劑處理16 h后的作用最為顯著。我們將以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探究APJ同源二聚體對(duì)VR的調(diào)節(jié)機(jī)制，為 APJ 參與的重要生理病理過程(動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等)提供細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有助于更精確地了解相關(guān)疾病的發(fā)生并提供更有效的、特異的治療靶點(diǎn)。