提取方法對(duì)葉綠素含量的影響

徐 偉，季索菲

(1.安徽林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230061）

0 引言

植物光合色素主要包括葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素和藻膽素等。其中高等綠色植物的葉綠素主要是葉綠素a、葉綠素b兩種［1］，葉綠素a呈藍(lán)綠色，葉綠素b呈黃綠色。葉綠素分子中含有很多共軛雙鍵，能捕獲光能，并將捕獲的光能傳遞到反應(yīng)中心色素，因此也常被稱(chēng)為天線色素。葉綠素分子含有一個(gè)卟啉環(huán)的“頭部”和葉綠醇的“尾巴”，因此不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，所以一般用乙醇或丙酮等有機(jī)溶劑來(lái)提取。葉綠素含量是反映植物特別是光合機(jī)構(gòu)生理狀況的一個(gè)基本指標(biāo)［2］，其含量的多少與光合能效的高低有著重要的關(guān)系。因此，植物生理學(xué)的研究常常離不開(kāi)植物組織中葉綠素含量的測(cè)定。

葉綠素具有特定的紫外吸收光譜［3］，根據(jù)朗伯-比爾定律D=KCL，D為吸光度，C為溶液濃度，K為吸光系數(shù)，L為液層厚度，可用分光光度計(jì)精確測(cè)定葉綠素含量。常用的測(cè)定方法包括研磨法和浸提法兩種。研磨法中使用最為廣泛的是Arnon改良法：將待測(cè)植物材料稱(chēng)重、剪碎、研磨、沖洗、過(guò)濾、定容、測(cè)定吸光值、帶入公式換算出葉綠素含量。浸提法：將待測(cè)植物材料剪碎置于有機(jī)溶劑中浸泡，待葉片葉綠素完全進(jìn)入浸提液后，測(cè)定浸提液的吸光值，再帶入公式換算出葉綠素含量。有報(bào)道指出：使用不同的方法，即使同樣的樣品、同樣的鑒定儀器，測(cè)定的結(jié)果差別也可能在20%以上［4］。目前暫時(shí)沒(méi)有絕對(duì)準(zhǔn)確的測(cè)定方法。本試驗(yàn)用綠蘿的葉片為試驗(yàn)材料，使用丙酮研磨法、96%乙醇和DMSO浸提法分別測(cè)定葉綠素含量，比較測(cè)定結(jié)果，分析相關(guān)原因，為今后植物葉片葉綠素含量測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采取11月份安徽省合肥地區(qū)自然光下生長(zhǎng)的綠蘿頂部的第一片葉為試驗(yàn)材料。

1.2 研究方法

擦拭綠蘿葉片表面并在自來(lái)水下沖洗干凈，避開(kāi)主葉脈，用邊長(zhǎng)1cm的模板或面積1cm2的打孔器截取單位面積葉片，然后剪成寬1-2mm、長(zhǎng)5mm左右的細(xì)絲備用。

1.2.1 研磨法提取

將葉片細(xì)絲放入研缽中，加入少量石英砂、碳酸鈣和2-3mL80%丙酮，研磨成勻漿。將勻漿沿玻璃棒倒入墊有濾紙的漏斗中進(jìn)行過(guò)濾，用少量80%丙酮反復(fù)沖洗，直至研缽和濾紙上的色素全部沖洗干凈，以避免因色素殘留造成誤差。最后用80%丙酮定容至10mL，放入棕色試劑瓶中待測(cè)定。

1.2.2 浸提法提取

將取樣得到的葉片細(xì)絲分別浸入裝有DMSO和96%乙醇的10mL容量離心管中，蓋緊瓶蓋，用錫紙包裹離心管營(yíng)造黑暗環(huán)境，浸提至葉絲完全變白，約24h，期間輕輕晃動(dòng)離心管，然后取出葉絲，分別用DMSO和96%乙醇定容至10mL待測(cè)定。

1.3 葉綠素含量計(jì)算

研磨法以80%丙酮溶液為空白對(duì)照，浸提法以DMSO和96%乙醇為空白對(duì)照，用元析UV-5100紫外分光光度計(jì)測(cè)量對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的吸光度。每種處理測(cè)定3次，取平均值計(jì)算。由于葉綠素在不同溶劑中的最大吸收峰的波長(zhǎng)有差異，在80%丙酮溶液中的最大吸收峰的波長(zhǎng)理論值分別是663nm和646nm，按照Lichtenthaler對(duì)Arnon法進(jìn)行修正的公式計(jì)算葉綠素濃度［5］：

在96%乙醇中的最大吸收峰的波長(zhǎng)分別為665nm和649nm，計(jì)算葉綠素濃度的公式［5］為：

用DMSO浸提法計(jì)算葉綠素的濃度時(shí)，測(cè)量波長(zhǎng)665、649nm時(shí)的吸光度，參照Alan的計(jì)算公式［6］：

單位面積葉綠素含量=葉綠素濃度*提取液體積/葉片面積，D是吸光值，Ca是葉綠素a濃度，Cb是葉綠素b濃度。利用EXCEL2007和DPS數(shù)據(jù)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素提取液的吸收光譜分析

將得到的葉綠素提取液倒入1cm的比色皿中，分別以80%丙酮、DMSO和96%乙醇為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)掃描500-750nm波段，每間隔1nm讀取吸光值，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葉綠素吸收光譜曲線圖。

圖1 綠蘿葉綠素提取液的吸收光譜

葉綠素在三種提取液的紫外吸收光譜圖相似，有些許偏差。但是最大吸收值不同，表明不同的提取液對(duì)葉綠素的提取能力不同。葉綠素在80%丙酮溶液的最大吸收波峰在665nm，OD值為0.184±0.022，公式中需要測(cè)量663nm處的OD值為0.173±0.021，兩處OD值相差6%，通過(guò)計(jì)算P值為0.544，差異不顯著。葉綠素在DMSO溶液的最大吸收波峰在667nm，OD值為0.310±0.032，公式中需要測(cè)量665nm處的OD值為0.297±0.031，兩處OD值相差4%，通過(guò)計(jì)算P值為0.645，差異不顯著。葉綠素在96%乙醇溶液的最大吸收波峰在666nm，OD值為0.294±0.016，公式中需要測(cè)量665nm處的OD值為0.286±0.016，兩處OD值相差3%，通過(guò)計(jì)算P值為0.568，差異不顯著。因此可以使用以上公式對(duì)葉綠素含量進(jìn)行計(jì)算。但是在646nm［8］處葉綠素b的吸收峰并未檢測(cè)到，此結(jié)果與劉暢等［9］研究一致。

2.2 不同提取方法對(duì)葉綠素提取效果的影響

由表1可知，將三種方法得到的Ca和Cb進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)80%丙酮研磨法所得Ca和Cb均低于DMSO和96%乙醇浸提法。其中DMSO浸提法所得Ca和Cb均最高，分別是80%丙酮研磨法所得Ca和Cb的1.68和1.91倍。但96%乙醇浸提法得到的葉綠素濃度的標(biāo)準(zhǔn)差最小，一般來(lái)說(shuō)標(biāo)準(zhǔn)差較小代表測(cè)量值較為集中，測(cè)量結(jié)果比較穩(wěn)定。DMSO和96%乙醇浸提法得到的Ca差異不顯著，但他們均與80%丙酮研磨法所得Ca差異極顯著。DMSO浸提法所得Cb濃度最高，80%丙酮研磨法所得Cb濃度與DMSO浸提法所得Cb差異顯著但達(dá)不到極顯著水平。

表1 不同提取方法葉綠素含量

2.3 不同提取方法對(duì)葉綠素穩(wěn)定效果的影響

將80%丙酮研磨法、DMSO和96%乙醇浸提法得到的提取液分別放置在自然光下曝光20分鐘、40分鐘、60分鐘后測(cè)定葉綠素含量，結(jié)果見(jiàn)表2。80%丙酮研磨法所得的葉綠素在自然光下放置20分鐘、40分鐘、60分鐘后基本沒(méi)有變化。DMSO浸提法得到的Ca分別下降10.80%、9.14%、4.97%；Cb分別下降21.52%、5.03%、13.99%，但各組間差異不顯著。96%乙醇浸提法得到的Ca放置20分鐘后與原Ca差異極顯著，放置20分鐘和放置40分鐘后Ca差異不顯著，放置40分鐘后和放置60分鐘后Ca差異極顯著，且Ca下降高達(dá)68.60%。96%乙醇浸提法得到的Cb放置20、40分鐘后Cb差異不顯著，但放置40、60分鐘后Cb差異極顯著，Cb下降高達(dá)54.17%，由此可知：96%乙醇浸提法提取的葉綠素溶液盡量不要曝光20分鐘以上，提取過(guò)程中要嚴(yán)格避光保存；80%丙酮研磨法提取的葉綠素穩(wěn)定性相對(duì)較好。

表2 不同提取方法對(duì)葉綠素穩(wěn)定性的影響

3 討論

在測(cè)定植物葉片的葉綠素含量時(shí)，不同葉齡或不同生長(zhǎng)期的葉片、同一種植物不同位置的葉片之間都有明顯差別，所以本試驗(yàn)為了減小誤差，選用同一棵綠蘿頂部的第一枚葉片為材料。大多數(shù)植物Ca/Cb的比值在3左右，本試驗(yàn)測(cè)得的Ca/Cb在2.8-3.5之間，符合大多數(shù)健康植物Ca/Cb比值規(guī)律，可信度較高。但研磨法所得葉綠素提取液的濃度低于DMSO和96%乙醇浸提法得到的葉綠素提取液濃度，可能是由于葉片研磨不充分，且沖洗、過(guò)濾等過(guò)程中葉綠素有所損失所導(dǎo)致。

本試驗(yàn)中葉綠素在三種提取液中的吸收光譜圖雖然相似，但紅光區(qū)的最大吸收峰位置均不相同，這可能是由于不同溶劑對(duì)葉綠素有增、減色效應(yīng)。本試驗(yàn)中葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收波峰與經(jīng)典公式中的最大吸收峰也相差1～2nm，這可能是由于紫外分光光度計(jì)的靈敏度有差異，邱念偉［10］就證明葉綠素在80%丙酮溶液和DMSO浸提液中的最大吸收峰不是一個(gè)固定值，而是一個(gè)區(qū)間；也有可能是植物葉片中含有多種物質(zhì)成分，提取液將這些物質(zhì)均提取在溶液中，多種物質(zhì)成分的吸光性疊加后造成最大吸收峰偏離。

常見(jiàn)的葉綠素含量表示方法有兩種：一種是以葉片單位鮮重來(lái)表示，一種是以葉片單位面積來(lái)表示。本試驗(yàn)以葉片單位面積來(lái)表示葉綠素含量，這樣測(cè)量的葉綠素含量可以不受葉片含水量變化的干擾。同時(shí)，由于光合作用速率也通常是以單位面積表示，可以更好地將葉綠素含量和光合速率聯(lián)系起來(lái)進(jìn)行對(duì)比分析［11］。

光合速率的變化在某些情況下可能是由于葉綠素含量的差異引起的，也可能是由于葉片氣孔開(kāi)合引起的，還有可能由于其他未知因素引起的［12］。光合速率的高低與葉綠素含量并不呈正相關(guān)。僅僅在弱光下，光合速率會(huì)隨葉片葉綠素含量的增加而增高，而在飽和光下光合速率往往與葉綠素含量的多少無(wú)關(guān)［11］。合肥地區(qū)每年11月日照強(qiáng)度相對(duì)較弱，此時(shí)取材所測(cè)得的葉綠素含量多少是否能作為測(cè)定光合速率的依據(jù)還有待研究。

4 結(jié)論

用80%丙酮研磨提取法、96%乙醇和DMSO浸提法都能提取植物葉片中的葉綠素。研磨法需要對(duì)葉片進(jìn)行研磨和過(guò)濾等操作，這些過(guò)程會(huì)導(dǎo)致葉片中的葉綠素有所損失，以致葉綠素測(cè)量值偏低，且在野外不方便開(kāi)展研磨法操作。浸提法操作簡(jiǎn)便，提高了野外實(shí)驗(yàn)的可操作性，浸提液DMSO雖有一定的刺激性，但與丙酮相比其毒性更低［13］，在一般情況下對(duì)人影響較小，且葉綠素提取液1小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性較好，因此可以作為良好的葉綠素提取溶劑；浸提液96%乙醇，毒性小、價(jià)格便宜且是常見(jiàn)化學(xué)試劑也可以作為很好的葉綠素提取溶劑，但葉綠素提取液穩(wěn)定性稍差，葉綠素提取過(guò)程應(yīng)注意避光保存。