黑果枸杞莖葉響應(yīng)NaCl脅迫合成花色苷的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

郭嬡 姜牧炎 哈力馬提·巴合太力 劉煜媛 王靜，2

（1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 國(guó)家民委黃河流域農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)生態(tài)保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；2.北方民族大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林遺傳改良創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，銀川 750021）

花色苷是植物次生代謝產(chǎn)生的黃酮類色素，與植物而言，具有多種生物學(xué)功能?；ㄉ帐侵参镏饕某噬镔|(zhì)，可吸引昆蟲傳粉受精［1］。植物能夠響應(yīng)環(huán)境因子，如強(qiáng)光［2］、鹽堿［3］、溫度［4］、營(yíng)養(yǎng)匱乏［5］等合成花色苷，以適應(yīng)環(huán)境。長(zhǎng)期強(qiáng)光照射可誘導(dǎo)植物合成花色苷，花色苷吸收了高能的光量子，保護(hù)飽和的光合電子傳遞鏈［6］。不利的環(huán)境往往導(dǎo)致植物直接或者間接遭受水分脅迫，花色苷還能夠作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)揮作用［7］?；ㄉ站哂袠O強(qiáng)的抗氧化能力，能有效清除多種脅迫產(chǎn)生的游離氧、氮自由基，有助于植物適應(yīng)逆境脅迫［8-10］。擬南芥［3］、煙草［11］、假儉草［12］等，可響應(yīng)鹽脅迫迅速合成花色苷，花色苷的合成量與植株耐受鹽堿的能力正相關(guān)。

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）多年生灌木，是世界上三大鹽堿性土壤的指示植物和先鋒植物之一，廣泛分布于我國(guó)西北荒漠地區(qū)，防風(fēng)固沙能力強(qiáng)，耐鹽堿、干旱［13］。在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，黑果枸杞與環(huán)境相互作用，逐漸形成了許多內(nèi)在生理和外在形態(tài)的適應(yīng)對(duì)策［14］。目前，有關(guān)黑果枸杞響應(yīng)鹽脅迫的研究主要集中于生理、生化指標(biāo)的變化［15］；野生條件下黑果枸杞植株的功能性狀［16］、根際微生物與鹽堿環(huán)境的關(guān)系［17］；鹽脅迫后植株離子穩(wěn)態(tài)的維持等方面［18］。黑果枸杞富含花色苷，相關(guān)研究更多集中于其藥理作用。從響應(yīng)環(huán)境變化的調(diào)節(jié)因子角度，開(kāi)展黑果枸杞植株中花色苷的合成、調(diào)控與鹽堿環(huán)境關(guān)系的研究尚不多見(jiàn)。

本研究以黑果枸杞植株為實(shí)驗(yàn)材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）技術(shù)，研究NaCl脅迫下，黑果枸杞莖葉中基因的表達(dá)特性，分析并挖掘參與合成花色苷的基因，以期為深入理解黑果枸杞與鹽堿環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)，為黑果枸杞的引種馴化及品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用材料為北方民族大學(xué)植物培養(yǎng)室中培養(yǎng)的黑果枸杞扦插幼苗。

1.2 方法

1.2.1 NaCl脅迫處理黑果枸杞幼苗 選取扦插2周，長(zhǎng)勢(shì)一致的黑果枸杞幼苗，分別移至對(duì)照及含有300 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基表面［19］，培養(yǎng)5 d，觀察黑果枸杞幼苗的花色苷的積累變化，分別于第0、1、3、5 天測(cè)定花色苷含量。培養(yǎng)條件為28℃恒溫，光周期為光照12 h / 黑暗12 h，光照強(qiáng)度為4 000 lx。

1.2.2 花色苷測(cè)定方法 收集CK及NaCl處理后的黑果枸杞幼苗莖葉，稱重，按照0.05 g/200 μL比例，加入含1% HCl的甲醇溶液，置于4℃冰箱中，黑暗條件下抽提過(guò)夜。抽提結(jié)束后，加入150 μL ddH2O，150 μL氯仿，顛倒混勻，4℃ 12 000 r/min離心5 min；取200 μL上清液置于酶標(biāo)板中，分別測(cè)定上清液在530 nm、657 nm的吸光度值，通過(guò)公式A530-0.25A657計(jì)算花色苷的相對(duì)含量。

收集CK及NaCl處理后的黑果枸杞莖葉，冷凍干燥。分別稱取干粉0.05 g，用0.5 mL甲醇/水/鹽酸（500∶500∶1，V/V/V）溶液，渦旋 5 min，置于 4℃抽提5 min，12 000×g離心5 min后，取上清液，經(jīng)0.22 μmol/L濾膜過(guò)濾后用于LC-MS/MS分析。選用C18色譜柱分離（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），流動(dòng)相A相為含0.1%甲酸的水溶液，B相為含0.1%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脫，0 min B相比例為5%，6 min增至50%，12 min增至95%，保持2 min，14 min降至5%，平衡2 min。采用電噴霧離子源ESI（+），霧化器壓力35 psi，離子噴霧電壓5 500 V，掃描范圍（m/z）為50-1 500。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測(cè)定及數(shù)據(jù)分析 選取扦插2周，長(zhǎng)勢(shì)一致的黑果枸杞幼苗，分別移至對(duì)照及含300mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基表面，豎直培養(yǎng)3 d，剪取莖葉部分，液氮速凍，置于-80℃保存，用干冰將樣本運(yùn)送至諾禾致源，測(cè)定各樣本轉(zhuǎn)錄組。對(duì)照及NaCl處理組各3個(gè)重復(fù)，分別記為CK1、CK2、CK3、Na1、Na2 和 Na3。

采用全式金的TRIzol Up提取各樣本中RNA，經(jīng)DNase I消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳及超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和質(zhì)量；取1.5 μg的RNA經(jīng)NEB Next Ultra RNA文庫(kù)制備試劑盒合成測(cè)序文庫(kù)，經(jīng)Illumia TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS 生成Cluster后，在Illumina Hiseq platform 邊合成邊測(cè)序。

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)錯(cuò)誤率分布檢查，A/T/G/C含量分布檢查，測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾等獲得Clean reads，對(duì)Clean reads進(jìn)行Trinity拼接，再經(jīng)過(guò)Corset層次聚類，獲得Unigenes。

在此基礎(chǔ)上，篩選差異表達(dá)基因，以Unigenes的 fpkm（fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced，fpkm） 值 ＞ 0.3，Log2Nafpkm/CKfpkm≥0.5，Padj＜0.05，且3次生物學(xué)重復(fù)中均發(fā)生變化的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因（DEGs），對(duì)篩選所得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋和KEGG通路分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 隨機(jī)選擇12個(gè)差異表達(dá)基因，其中7個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，5個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)用于qPCR分析的特異性擴(kuò)增引物，引物序列如表1所示，LrH2B1為內(nèi)參基因。qPCR反應(yīng)步驟：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，變性至延伸循環(huán)40次，結(jié)果采用2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。分析基因表達(dá)變化趨勢(shì)是否與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相符，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的準(zhǔn)確性。

表1 qPCR特異性引物列表Table 1 List of specific primers for qPCR

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Graph pad 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪圖。

2 結(jié)果

2.1 300 mmol/L NaCl脅迫對(duì)黑果枸杞幼苗花色苷含量的影響

300 mmol/L NaCl可誘導(dǎo)黑果枸杞幼苗合成花色苷，隨著NaCl脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)，花色苷含量逐漸增多，結(jié)果如圖1-A、B所示，NaCl處理的第0、1天時(shí)，黑果枸杞幼苗嫩綠，無(wú)明顯的花色苷積累，NaCl處理的第3 天時(shí)，黑果枸杞幼苗的花色苷積累量顯著增加，相對(duì)含量為0.674，且花色苷主要集中在頂部葉片及莖部，NaCl處理的第5天，花色苷含量繼續(xù)增加，為0.893?？梢?jiàn)，NaCl脅迫能夠促進(jìn)黑果枸杞幼苗合成花色苷，并隨著NaCl脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，黑果枸杞幼苗中花色苷的積累量逐漸增加，在NaCl脅迫處理的第5天時(shí)，花色苷含量最高。

圖1 不同時(shí)間NaCl脅迫下黑果枸杞幼苗中花色苷的含量Fig.1 Contents of anthocyanin in L.ruthenicum seedlings under NaCl stress at different times

黑果枸杞莖葉中，矮牽牛素3-O-蕓香糖苷是含量最高的花色苷。NaCl脅迫后，黑果枸杞莖葉中有3種花色苷和1種黃酮顯著升高，即飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素3-O-蕓香糖苷、矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷和柚皮素-7-O-葡萄糖苷。其中，飛燕草素-3-O-蕓香糖苷含量升高的倍數(shù)最高，達(dá)11.9倍，矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷是含量最高的花色苷（5.313± 0.286）μg/g。結(jié)果如表2所示。

表2 NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉中顯著變化的花色苷種類及含量Table 2 Types and contents of significantly-changed anthocyanins in L.ruthenicum shoots under NaCl stress

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，對(duì)照組CK1、CK2、CK3及NaCl處理組Na1、Na2及Na3共產(chǎn)生48.49 G數(shù)據(jù)，包含Clean reads 323 291 058條，Clean reads總數(shù)量在總測(cè)序數(shù)量的96%以上。單個(gè)堿基數(shù)錯(cuò)誤率為0.02%、0.03%，均低于1%。評(píng)估測(cè)序堿基錯(cuò)誤率的數(shù)值Q20大于96%，Q30大于91%，GC含量在42%-43%之間，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表3所示，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的質(zhì)量符合要求，可用于后續(xù)分析。

表3 對(duì)照及NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)信息Table 3 Transcriptome sequencing data of L.ruthenicum shoots under control and NaCl stress

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉中共篩選到1 416個(gè)DEGs，其中上調(diào)的DEGs 867個(gè)，下調(diào)的DEGs 549個(gè)，上調(diào)DEGs的數(shù)目顯著多于下調(diào)DEGs的數(shù)目。

2.4 GO、KEGG功能注釋及富集分析

經(jīng)GO注釋后，1 416個(gè)DEGs可聚類分為生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3大類。在生物學(xué)過(guò)程分類中催化活性、氧化還原反應(yīng)活性及吡咯化合物的結(jié)合等具有較高富集頻次；在細(xì)胞組分中，光合的膜、類囊體部分、類囊體與光合作用相關(guān)的過(guò)程具有較高富集頻次；在分子功能中，單一有機(jī)體代謝過(guò)程、氧化還原反應(yīng)過(guò)程、碳水化合物代謝過(guò)程等具有較高富集，說(shuō)明這些過(guò)程在黑果枸杞莖葉響應(yīng)NaCl脅迫中起著重要的作用，結(jié)果如圖2所示。

圖2 NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.2 Enriched GO terms of DEGs in L.ruthenicum shoots and leaves under NaCl stress

1 416 個(gè)差異表達(dá)基因經(jīng)KEGG通路分析后，顯著富集（Q-value＜0.05）的通路有14個(gè)，結(jié)果如表4所示。其中光合作用-天線蛋白、光合作用、光合有機(jī)體的碳固定、鐵卟啉環(huán)及葉綠素的代謝與植物光合作用緊密相關(guān)；乙醛酸和二乙酸代謝、淀粉和蔗糖代謝2個(gè)通路與碳水化合物的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有關(guān)；苯丙素生物合成、黃酮生物合成、蠟質(zhì)、角質(zhì)生物合成、二苯乙烯類、二芳基庚烷類和姜辣素生物合成4個(gè)通路參與了植物次生代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)；植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也有差異表達(dá)基因顯著富集。由此推測(cè)，NaCl脅迫可能直接或通過(guò)植物激素調(diào)節(jié)黑果枸杞莖葉的光合作用、碳水化合物的穩(wěn)態(tài)變化及多種次生代謝產(chǎn)物的合成與分解。

表4 KEGG顯著富集通路Table 4 KEGG enrichment pathways

2.5 花色苷生物合成通路基因分析

花色苷屬黃酮類物質(zhì)，合成過(guò)程起始于苯丙素的生物合成途徑，因此，選擇苯丙素生物合成通路、黃酮生物合成通路及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路3條通路深入研究。

苯丙素及黃酮的生物合成通路中，共涉及21個(gè)DEGs，其中有7個(gè)DEGs屬花色苷合成的結(jié)構(gòu)基因，Cluster-45.113297（LrPAL）、Cluster-45.125726（Lr-C4H）、Cluster-45.245219（LrCHS）3個(gè)基因參與花色苷合成的早期過(guò)程，Cluster-45.100570（LrDFR）、Cluster-45.96209（LrF3H）、Cluster-45.242733（Lr-F3′H）、Cluster-45.156739（LrANS）4 個(gè)基因參與花色苷合成的晚期過(guò)程。NaCl脅迫后，7個(gè)基因的表達(dá)量均上調(diào)，結(jié)果如圖3所示。這些基因的上調(diào)表達(dá)與黑果枸杞莖葉中花色苷含量升高的表型緊密相關(guān)。

圖3 NaCl脅迫下黑果枸杞莖葉中參與花色苷生物合成的差異表達(dá)基因熱圖Fig.3 Heat map of DEGs related to anthocyanin biosynthesis in L.ruthenicum shoots under NaCl stress

NaCl脅迫后，激活了黑果枸杞莖葉中多個(gè)植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，共有27個(gè)差異表達(dá)基因參與了脫落酸（ABA）、生長(zhǎng)素、乙烯、赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素、水楊酸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果如表5所示。其中，有15個(gè)差異表達(dá)基因參與了ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中的14個(gè)差異基因表達(dá)量顯著上調(diào)。可見(jiàn)，在黑果枸杞莖葉響應(yīng)NaCl脅迫過(guò)程中，ABA信號(hào)通路的調(diào)控發(fā)揮了重要的作用。

表5 NaCl脅迫下黑果枸杞莖葉中參與植物激素信號(hào)通路的差異表達(dá)基因Table 5 DEGs related to hormone signaling transduction pathway in L.ruthenicum shoots under NaCl stress

2.6 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式分析

NaCl脅迫后，黑果枸杞莖葉轉(zhuǎn)錄組中共有25類，87個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量發(fā)生明顯變化，結(jié)果如圖4所示，位列前3位的轉(zhuǎn)錄因子家族是HB（調(diào)節(jié)蛋白）家族、MYB家族和AP2家族，分別含有的DEGs數(shù)量為13、11和10個(gè)。

圖4 NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)錄因子聚類分析Fig.4 Cluster analysis of transcription factors in L.ruthenicum shoots under NaCl stress

在花色苷合成的過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH及WD40形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體MBW，調(diào)控花色苷合成通路中的結(jié)構(gòu)基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)花色苷合成的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，分別有11個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子和5個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生顯著變化，這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量如表6所示。NaCl脅迫后，MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量均明顯上調(diào)，其中表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)最高的為Cluster-45.35768，表達(dá)量為對(duì)照的4.73倍，上調(diào)倍數(shù)最低的為Cluster-45.112186，表達(dá)量為對(duì)照的1.6倍。編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的差異基因中，有4個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)，1個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)。

表6 表達(dá)量發(fā)生顯著變化的MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子Table 6 MYB and bHLH transcription factors with significantly changed expression levels

2.7 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證

從分析獲得的差異表達(dá)基因中，隨機(jī)選取12個(gè)進(jìn)行RT-qPCR的驗(yàn)證，經(jīng)驗(yàn)證，與RNA-seq中基因的表達(dá)變化趨勢(shì)一致，結(jié)果如圖5所示?？梢?jiàn)，RNA-seq的測(cè)序結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。

圖5 RT-qPCR驗(yàn)證RNA-seq中差異表達(dá)基因Fig.5 Validation of DEGs in RNA-seq using RT-qPCR

3 討論

花色苷是調(diào)節(jié)植物生命活動(dòng)重要的次生代謝產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，在植物響應(yīng)脅迫環(huán)境中發(fā)揮積極作用。NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉合成了大量花色苷，其中矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷含量最高（5.313 ± 0.286）μg/g，NaCl脅迫后升高2.28倍。另外兩種花色苷，飛燕草素-3-O-葡萄糖苷和飛燕草素3-O-蕓香糖苷在脅迫后，分別升高7.5和11.9倍。在擬南芥pap1-D中，過(guò)量合成的花色苷能夠顯著提高植株對(duì)鹽脅迫的耐受能力［20］，轉(zhuǎn)了Del基因的煙草中，花色苷的含量升高與活性氧的清除能力呈正相關(guān)，并且增加了幼苗對(duì)鹽、干旱脅迫的耐受性［21］。由此推測(cè)，NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉中花色苷含量的顯著增加，可能提高了莖葉抗氧化、抗鹽脅迫的能力。

分析對(duì)照及NaCl脅迫后黑果枸杞莖葉轉(zhuǎn)錄組的變化，差異表達(dá)基因中有7個(gè)編碼花色苷合成的結(jié)構(gòu)基因，均有不同程度上調(diào)，在葡萄［22］和紫雨樺［23］響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程的研究中，也得到了類似的結(jié)果，即花色苷合成通路基因的表達(dá)量與花色苷的合成具有正相關(guān)性。由此可見(jiàn)，黑果枸杞莖葉中花色苷合成通路基因的上調(diào)表達(dá)與花色苷含量升高的表型緊密相關(guān)。黑果枸杞莖葉中含量最高的花色苷種類為矮牽牛素，LrF3′5′H是調(diào)節(jié)矮牽牛素合成的重要基因［24］。分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，LrF3′5′H 的表達(dá)量并沒(méi)有顯著變化。查找LrF3′5′H在NaCl處理前后的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)量始終處于較高水平，推測(cè)F3′5′H較高的表達(dá)水平，催化了更多的黃烷酮生成二氫楊梅素，為矮牽牛素的合成儲(chǔ)備更多的前體物質(zhì)。

植物能響應(yīng)環(huán)境因子、營(yíng)養(yǎng)元素變化調(diào)節(jié)花色苷的合成，這個(gè)過(guò)程可通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄復(fù)合物MYB-bHLH-WD40（MBW）的表達(dá)量，調(diào)節(jié)參與合成花色苷的多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。擬南芥［25］和蘋果［26］，能響應(yīng)低氮條件，通過(guò)上調(diào)AtPAP1（AtMYB75）、AtPAP2（AtMYB90）、AtTT8（bHLH）及MdMYB1的表達(dá)，調(diào)節(jié)花色苷合成通路中多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，促進(jìn)植物合成花色苷。蘋果經(jīng)寒冷處理后可調(diào)節(jié)MdMYB1、MdbHLH3的表達(dá)量，調(diào)控花色苷合成通路結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而合成大量花色苷［27］。經(jīng)NaCl脅迫后，黑果枸杞莖葉中，有11個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子及5個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生顯著變化，這幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在黑果枸杞花色苷合成過(guò)程中的作用，將是后續(xù)研究的重點(diǎn)之一。

植物激素可直接調(diào)控或通過(guò)調(diào)控MBW的表達(dá)量間接調(diào)控花色苷的代謝過(guò)程。蘋果［28］、桑葚［29］果實(shí)成熟過(guò)程中，乙烯含量迅速升高，可直接作用于花色苷合成通路結(jié)構(gòu)基因DFR及ANS啟動(dòng)子上的乙烯響應(yīng)元件，上調(diào)花色苷合成的基因表達(dá)，促進(jìn)花色苷的合成與積累。ABA也能調(diào)控花色苷的合成。擬南芥經(jīng)ABA處理后，花色苷含量增加，分析花色苷合成通路關(guān)鍵基因的表達(dá)量，AtDFR和AtANS顯著上調(diào)［30］。非呼吸越變型果實(shí)成熟時(shí)，施加外源ABA，可積累花色苷，加速果實(shí)著色，如藍(lán)莓、葡萄［31-32］。NaCl脅迫后，黑果枸杞莖葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中有27個(gè)差異表達(dá)基因參與了植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。其中，參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的差異表達(dá)基因有15個(gè)。因此，ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因很可能在黑果枸杞莖葉響應(yīng)NaCl脅迫，促進(jìn)花色苷合成過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及與其他植物激素之間的交互調(diào)節(jié)過(guò)程有待深入研究。

綜上所述，NaCl脅迫可促進(jìn)黑果枸杞莖葉合成花色苷，其中矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷含量最高；通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)分析黑果枸杞莖葉在NaCl脅迫后的轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果表明，7個(gè)花色苷生物合成的結(jié)構(gòu)基因顯著上調(diào)，參與植物激素ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因、多個(gè)MYB及bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量顯著改變。這些關(guān)鍵路徑基因的表達(dá)可能與黑果枸杞莖葉響應(yīng)NaCl脅迫促進(jìn)花色苷合成緊密相關(guān)。本研究的開(kāi)展，為深入理解黑果枸杞與鹽堿環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)支撐；同時(shí)，從植株角度分析黑果枸杞花色苷合成的基因網(wǎng)絡(luò)，為黑果枸杞的引種馴化及品種選育提供了參考。

4 結(jié)論

NaCl脅迫能促進(jìn)黑果枸杞莖葉合成花色苷，其中矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷含量最高，推測(cè)植物激素ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因、多個(gè)MYB、bHLH轉(zhuǎn)錄因子及花色苷生物合成通路結(jié)構(gòu)基因的顯著變化與該過(guò)程緊密相關(guān)。