大麥Thionin-like基因家族基因表達譜分析

楊宏亮 袁楨 錢徐佳志 徐大偉

（安徽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，合肥 230036）

大麥（Hordeum vulgare L.）是世界上第四大禾谷類作物，具有如食用、飼用、釀造、藥用等廣泛的用途［1］。大麥是一種抗逆性較強的作物，生長環(huán)境很廣，而且具有春、冬生長習性，中國南北各地都有栽培，是世界上最古老的種植作物之一［2-4］。當植物自然抵抗病原體時，它們會產(chǎn)生小的富含半胱氨酸的抗菌肽 AMP（antimicrobial peptides）［5］。它們是植物先天防御系統(tǒng)的重要組成部分，可在植物受到害蟲侵襲時保護植物以將其損害降至最低［6-7］，這些抗菌肽里面就包括硫素。硫素是一類分子量比較小，富含硫的蛋白，一般為5 000 Da，所有的硫素在其氨基端的第三、四位置的殘基都是由兩個保守的半胱氨酸組成［8］。

硫素廣泛存在于各種植物中，例如在禾本科、桑寄生科和十字花科植物包括擬南芥等［8］。類硫素基因的發(fā)現(xiàn)源于對擬南芥基因組序列的檢測。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，除了4個硫素基因外，還有一些類硫素基因，這些基因在其他物種中也有發(fā)現(xiàn)［9］。這些基因因其基因組較小而未被注釋，大部分也未在基因芯片中富集到，所以關(guān)于其表達和在植物中的功能尚不清楚。前人研究發(fā)現(xiàn)，類硫素蛋白更類似于硫素蛋白的酸性結(jié)構(gòu)域，而不是硫素結(jié)構(gòu)域［9］。類硫素基因可以誘導甜菜孢囊線蟲合胞體的表達，調(diào)節(jié)其他基因的表達，并增強植物對疾病的抗性［10］。Thil肽可以在辣椒果實中表達，對細菌、酵母菌和絲狀真菌具有很強的抗菌活性，并誘導程序性死亡［11-12］。

為了研究大麥中類硫素的生物學功能、表達模式和蛋白結(jié)構(gòu)，通過比較單、雙子葉模式植物水稻和擬南芥基因組的類硫素來鑒定大麥中的類硫素基因組成，通過生物信息學預(yù)測他們在植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中的作用。本研究共鑒定出7個大麥類硫素基因，進化樹分析其與其它物種中的類硫素基因都非常保守，進一步研究其在大麥中的序列組成及基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化樹和表達譜分析，為后續(xù)分析類硫素基因的生物學功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Golden Promise大麥品種在安徽省合肥市安徽農(nóng)業(yè)大學（31.85°N，117.26°E）室外常溫（15-25℃）下栽培。2021年3月初種子發(fā)芽于培養(yǎng)箱，隨后將幼苗轉(zhuǎn)移到盆中。從大麥的成熟根、莖、葉、幼苗以及穗部采集的組織樣品用鋁箔包裹并浸入液氮中，所有收獲的樣品都儲存在-80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 大麥Thil家族候選基因的篩選及理化性質(zhì)分析 從擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫TAIR（http://www.aabidopsis.org/）下載了 9 個擬南芥Thil蛋白的序列，從水稻基因組注釋項目RGAP（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）下載了 10 個水稻Thil 蛋白的序列。利用大麥Morex的基因組鑒定了大麥Thil假釋基因，基因組注釋文件Morex.v1來源于 phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）。使用 HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/） 網(wǎng)站將擬南芥和水稻Thil基因與大麥基因組進行比對，并設(shè)定閾值E-value ＜ 10-5，篩選得到大麥基因組中Thil家族候選基因。利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件對大麥類硫素蛋白的分子質(zhì)量、氨基酸長度和等電點進行分析。

1.2.2 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建、基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域序列分析 將擬南芥、水稻和大麥的蛋白質(zhì)序列進行整合，進行多重序列比對，使用MEGA-X（https://www.megasoftware.net/）軟件，采用鄰位相連方法（neighbor-joining method），Bootstrap值設(shè)置為500，構(gòu)建基因家族系統(tǒng)進化樹。使用MEME工具（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）預(yù)測大麥的Thil蛋白質(zhì)序列中的保守功能結(jié)構(gòu)域。根據(jù)Thil基因的CDS序列和DNA基因組序列，利用TBtools v1.082（https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.06.009）軟件［9］分析其基因結(jié)構(gòu)并進行結(jié)果可視化處理。

1.2.3 Thil基因在大麥染色體上的分布 從 Ensembl Plants（https://plants.ensembl.org/index.html） 數(shù) 據(jù) 庫中獲取基因在染色體上的位點信息，利用TBtools繪制染色體定位圖。

1.2.4 RNA提取和RT-qPCR（quantitative real-time PCR）分析 使用RNA提取試劑盒TRNzol（美國Invitrogen公司）提取根、葉、莖、幼葉和種子的RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和 NanoDrop 1000 分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）分析 RNA的質(zhì)量和濃度。反轉(zhuǎn)錄時利用RNase-free DNase I（大連寶生物工程有限責任公司）去除DNA污染，使用 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（莫納生物科技有限公司）從1 μg 總 RNA 生成第一鏈 cDNA。根據(jù)每個基因的序列設(shè)計跨內(nèi)含子的引物，使用Primer 5 軟件生成得分最高的，靠近基因上游的正反向引物用于熒光定量PCR擴增實驗。用于RT-qPCR分析的特異性引物列于表1中。反應(yīng)在含有SYBR mix（翌圣生物科技股份有限公司）10 μL、cDNA 2 μL、特異性PCR引物 2 μL、超純水6 μL的 20 μL反應(yīng)體系中進行。使用熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司LightCycler 96）進行熒光定量PCR實驗。運行方案如下，94℃3 min，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s 40 個循環(huán)，72℃ 5 min。Ct 值由 Roche軟件以默認設(shè)置確定。使用2-ΔΔCt方法確定Thils基因的相對表達水平。每個樣品用3個生物學重復(fù)與3個統(tǒng)計學重復(fù)進行PCR。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Sequences of qRT-PCR primers

1.2.5 基因克隆與亞細胞定位實驗 Thil基因的引物對是根據(jù)蛋白質(zhì)編碼區(qū)CDS（coding sequence）序列設(shè)計的（表2），引物兩端分別加上Bgl II和Spe I酶切位點。大麥的 cDNA 用作每個基因的模板。PCR擴增采用Vazyme Super-Fidelity DNA Polymerase（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）的高保真酶。PCR實驗步驟如下，98℃ 5 min；98℃ 30 s，55℃15 s，58℃ 30 s共36個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR程序完成后，將PCR產(chǎn)物純化，送公司測序（生工生物工程股份有限公司）。載體pCAMBIA1301-eGFP用限制性內(nèi)切酶Bgl II和Spe I（紐英倫生物技術(shù)北京有限公司）。In-Fusion Cloning 使用 Monad Single Assembly Cloning Mix（莫納生物科技有限公司）進行，將Thil基因與雙酶切空質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中（上海唯地生物有限公司）進行陽性克隆鑒定，得到陽性菌落質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中（生工生物工程股份有限公司）。引物由生工生物技術(shù)公司合成（表2），成功構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。煙草在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到3-4片葉子時期，進行煙草葉片侵染48 h后，在共聚物激光顯微鏡下觀察亞細胞定位結(jié)果。

表2 Thil基因克隆引物序列Table 2 Primer sequences for Thil gene cloning

2 結(jié)果

2.1 大麥Thil基因家族成員的鑒定

經(jīng)過比對篩選，最終獲得了7個Thil基因。根據(jù)該基因家族理化性質(zhì)的預(yù)測結(jié)果，分析了它們的理化性質(zhì)，如表3所示，ThiL基因編碼蛋白長度從227（ThiL2）到414（ThiL5）個氨基酸，蛋白分子量在18.53 kD（Thil2）-34.23 kD（Thil5），等電點為5.20（Thil4）-5.31（Thil3）。

表3 大麥類硫素基因家族成員的基因信息Table 3 Basic information of Thil family genes from barley

2.2 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建、基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域序列分析

為了研究Thil基因家族成員之間的進化關(guān)系，通過比較分析了Thil基因的結(jié)構(gòu)，預(yù)測了Thil蛋白結(jié)構(gòu)多樣性，進一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)圖。Thil家族的保守結(jié)構(gòu)與序列分析結(jié)果顯示，相同分支的基因結(jié)構(gòu)相似性高，而不同的分支的基因結(jié)構(gòu)相似性低。如圖1所示，Thil1、Thil2、Thil4和Thil5有1-3個內(nèi)含子和外顯子，但Thil6和Thil7只有一個外顯子和一個非翻譯區(qū)（UTR），而Thil3只有一個外顯子。在圖1中可以看到Thil1、Thil2、Thil7位于同一支，基本上兩端都是非翻譯區(qū)，中間包含一個或兩個編碼區(qū)，Thil3和Thil6都是編碼區(qū)在前，Thil4的非編碼區(qū)是所有基因里總和最長的，Thil5與Thil1、Thil2、Thil7類似，但是它在非編碼區(qū)中包含了3個編碼區(qū)。

圖1 大麥Thil家族基因結(jié)構(gòu)和基因蛋白保守基序的預(yù)測Fig.1 Prediction of gene structure and protein conservative motifs of Thil family in barley

MEME分析結(jié)果（圖2）顯示，大麥Thil基因家族基序的結(jié)構(gòu)，從上到下依次為motif 1、motif 2、motif 3、motif 4，motif 3是大麥Thil家族最保守的基序，除Thil4外，所有的基因都含有同一個motif3。以上結(jié)果表明，Thil基因家族主要是以LLLL*LV（*指一個或多個隨機的氨基酸）為特征結(jié)構(gòu)域。

圖2 大麥Thil基因家族基序的結(jié)構(gòu)Fig.2 Motif structure of the Thil gene family in barley

此外，為了探討不同物種Thil基因之間的進化關(guān)系，對不同植物（包括擬南芥、大麥和水稻）的Thil蛋白進行了系統(tǒng)進化樹分析。其中使用9條擬南芥的氨基酸序列、10條水稻的氨基酸序列和7條大麥的氨基酸序列構(gòu)建進化樹，進行亞家族的分類。系統(tǒng)分析Thil基因家族，可以分為四大類，即I-IV組（圖3）。I組是最大的亞家族，由ThiL1、ThiL2、ThiL4、ThiL7組成，它們中ThiL4可以被單獨拿出來分為一組，因為它的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)與基序和另外3個并不一樣，但是它與其他3個的位置較為靠近，所以劃分為一組，另外的3個基因，在基因結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)最為一致，都有motif 2和motif 3基序，可能功能作用也比較相近。II組中僅存在雙子葉植物擬南芥，沒有另外兩個物種的，這可能與該家族進化過程中的功能分化有關(guān)。III組中有ThiL3和ThiL6兩個基因，它們共同含有motif 1、motif 3、motif 4三個保守基序，motif 4也只出現(xiàn)在這一組中，其功能可能與其他基因有所不同。IV組中只有一個大麥ThiL5基因，他的基因結(jié)構(gòu)中表現(xiàn)出與其他基因不同的現(xiàn)象，它的外顯子區(qū)域更多，而保守基序只有一個最保守的motif 3。

圖3 Thil基因家族的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Thil gene family

2.3 基因在染色體上的位置

根據(jù)大麥基因組提供的染色體位置信息，繪制其染色體定位模式圖，結(jié)果（圖4）表明，7個Thils定位到大麥的5條染色體上且分布不均，其中2號染色體和5號染色體的Thil基因數(shù)量最多，而1號染色體、4號染色體和6號染色體的Thil基因數(shù)量均只有1個。

圖4 Thil基因在染色體上的的分布Fig.4 Chromosome distribution of Thil genes

2.4 Thil家族基因啟動子元件分析

利用Tbtools軟件提取大麥Thil基因結(jié)構(gòu)上游2 000 bp啟動子序列，Plant Cis-Acting Regulatory Element在線網(wǎng)站中進行順式作用元件預(yù)測（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。結(jié)果（圖5）顯示，大麥7個Thil基因，家族成員含有豐富的順式作用元件種類，圖5中顏色越深表示響應(yīng)程度越來越高，主要包括生長素（TGA-element和 GARE-motif）、赤霉素（TATC-box）、水楊酸（TCA-element）、脫落酸（ABRE）、茉莉酸甲酯（CGTCA-motif和TGACG-motif）、玉米醇溶蛋白（O2-site）等激素響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件，以及厭氧（ARE）、光 響 應(yīng)（ATC-motif、TCT-motif、G-box、GT1-motif、Sp1、MRE和 Box 4）、低溫（LTR）、干旱（MBS）等脅迫相應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件，可能與參與大麥抗逆有關(guān)。

圖5 Thil基因順式作用元件Fig.5 Cis-acting element analysis of Thil genes

2.5 大麥Thil基因的表達模式分析

本研究檢測了Thil基因在大麥的根、葉、莖、幼葉和種子中的表達水平（圖6）。qPCR結(jié)果可以看出，Thil3基因在葉中高表達，Thil1在莖中高度表達，Thil2在幼苗中高度表達，其他基因的表達量相對較低。

圖6 不同組織中Thil基因的表達水平Fig.6 Expression levels of Thil gene in different barley tissues

2.6 Thil基因在大麥中的亞細胞定位

為了分析大麥中不同Thil蛋白之間的功能是否存在差異，我們利用Thil融合蛋白在煙草異源表達，并利用共聚焦顯微鏡觀察Thil蛋白在煙草中的亞細胞定位。其中Thil1和Thil2定位于煙草的細胞膜和細胞核上，Thil3和Thil7定位于細胞膜上，Thil6定位于葉綠體中（圖7）。

圖7 Thil在亞細煙草中的亞細胞定位分析Fig.7 Subcellular localization of Thil in barley

3 討論

Thil基因是一類分子量較小并且富含半胱氨酸的蛋白，它可能參與細胞防御機制和程序性細胞死亡，這兩種機制都已在辣椒（Capsicum annuum L.）和炭疽之間的相互作用中得到報道［13］。硫蛋白是植物防御的重要組成部分，可應(yīng)對入侵的病原體，并具有針對各種植物病原體的體外抗菌活性［14-16］。硫蛋白前原蛋白包含一個信號肽、成熟硫蛋白和一個酸性結(jié)構(gòu)域［8］，成熟的硫素是具有抗菌活性的部分，而酸性結(jié)構(gòu)域的適當功能尚不清楚［17］，目前大麥中Thil 基因家族的研究尚未見報道。本研究基于大麥基因組，運用生物信息學手段，篩選并分析大麥Thil 基因家族成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、進化關(guān)系及組織表達和煙草亞細胞定位的結(jié)果等信息，豐富了植物Thil基因家族種類研究，也為進一步研究大麥Thil基因提供了理論依據(jù)。在本研究中，在大麥基因組中鑒定了7個Thil基因家族成員，一個基因家族的典型進化印跡與內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子的類型和數(shù)量有關(guān)［18］，因此它們被分為4個亞組，這與水稻和擬南芥中的亞組分類相似［9］。

大約 94% 的擬南芥 CRP（cysteine-rich peptides）基因缺乏內(nèi)含子或只含有單個內(nèi)含子，該內(nèi)含子通常位于編碼信號肽和成熟肽的外顯子之間［19］。通過Thil 基因結(jié)構(gòu)分析顯示，本研究的 7個Thil基因中有4個存在內(nèi)含子。發(fā)現(xiàn)來自不同植物科的硫素基因在酸性結(jié)構(gòu)域內(nèi)有兩個小內(nèi)含子［20］，類似地在Thil 基因中內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)模式也存在于大麥中。

前人研究發(fā)現(xiàn)，Thil基因與植物的保護和防御機制有一定的關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)Thil基因一般在幼葉中表達并且茉莉酸甲酯響應(yīng)元件數(shù)量最多。在剛發(fā)芽時植株需要強有力的保護來適應(yīng)新的環(huán)境，這樣才能更好地成長，而茉莉酸甲酯廣泛地存在于植物體中，能夠激發(fā)防御植物基因的表達，誘導植物的化學防御，產(chǎn)生與機械損傷和昆蟲取食相似的效果［21］，這與先前研究的保護和防御機制相對應(yīng)。

大麥中不同Thil蛋白之間的定位也存在差異，Thil1和Thil2定位于煙草的細胞膜、細胞核、細胞質(zhì)上，Thil3和Thil7定位于細胞膜上，Thil6定位于葉綠體中，說明不同的成員之間在進化過程中分別參與了植物不同的發(fā)育學過程。

4 結(jié)論

Thil基因與植物的保護和防御機制有關(guān)，在幼葉中能夠激發(fā)植物保護機制的元件響應(yīng)最多，在RT-qPCR中可以看到Thil基因在幼葉中的表達量最高，在亞細胞定位中可以發(fā)現(xiàn)相同的成員之間在進化過程中分別參與了植物不同的發(fā)育學過程。