水稻苗期致死突變體的鑒定及其基因定位

唐躍輝 趙雨凡 林錦 王胤 曹博遠(yuǎn) 車(chē)怡帆 楊文杰 包欣欣 楊同文

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，周口 466001）

水稻（Oryza sativa L.）是世界最重要的糧食作物之一，從種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、分蘗至授粉結(jié)實(shí)的各個(gè)階段，均由各個(gè)基因協(xié)作調(diào)控來(lái)維持水稻正常生長(zhǎng)發(fā)育。因此，挖掘和鑒定控制水稻生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中的功能基因，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和糧食安全都具有重要的意義。

蛋白質(zhì)合成是所有生物體必不可少的過(guò)程，mRNA向蛋白質(zhì)的翻譯包括3個(gè)階段：起始、延伸和終止，每個(gè)階段都需要特定的輔助蛋白或因子參與［1］。在真核生物中，蛋白質(zhì)翻譯終止過(guò)程需要eRF1和eRF3兩類(lèi)肽鏈釋放因子的參與，eRF1通過(guò)識(shí)別核糖體A位點(diǎn)的UAA，UAG或UGA終止密碼子并刺激新生肽鏈的釋放，導(dǎo)致mRNA翻譯成多肽的過(guò)程終止，eRF3通過(guò)水解GTP協(xié)助eRF1完成新生肽鏈的釋放［2-3］。研究表明，eRF1蛋白含有3個(gè)高度保守的域即N，M和C結(jié)構(gòu)域［4-5］。其中，N結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)密碼子識(shí)別，且位于N結(jié)構(gòu)域中的NIKS和Y-C-F基序在N結(jié)構(gòu)域識(shí)別密碼子過(guò)程中扮演重要的角色，尤其是NIKS基序在eRF1與終止密碼子識(shí)別過(guò)程中起重要的作用［6］；M結(jié)構(gòu)域中的CGQ基序能夠結(jié)合tRNA的CAA末端，進(jìn)而激活核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心的水解，在肽基-tRNA的肽釋放中起重要的作用［7］。近年來(lái)，eRF1功能的研究主要集中在動(dòng)物，酵母和真菌中［8-10］，然而在植物方面的研究相對(duì)較少，僅僅在模式植物擬南芥中有少數(shù)報(bào)道。在擬南芥中，eRF1家族有3個(gè)成員，分別是AteRF1-1、AteRF1-2和AteRF1-3，這3個(gè)基因編碼蛋白不僅具有高度相似性，而且均具有肽鏈釋放因子的活性［11］。除此之外，AteRF1-1還參與擬南芥細(xì)胞伸長(zhǎng)和胚根細(xì)胞分裂的調(diào)控，如共抑制AteRF1-1擬南芥植株表現(xiàn)為節(jié)間伸長(zhǎng)減少，且共抑制AteRF1-1影響轉(zhuǎn)基因植株徑向細(xì)胞分裂［12］，然而AteRF1-2可以通過(guò)影響葡萄糖和植物激素應(yīng)答調(diào)節(jié)擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育，如提高AteRF1-2的表達(dá)增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)葡萄糖和多效唑（一種赤霉素合成抑制劑）的敏感性，且外施GA可以恢復(fù)植物的生長(zhǎng)，相反，erf1-2突變體植株增加了對(duì)多效唑的抗性，表明AteRF1-2也許在赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起負(fù)調(diào)控因子的作用［13］。

目前，eRF1家族基因在植物中的研究十分有限，主要集中于模式植物擬南芥，然而在單子葉植物水稻中已鑒定并明確功能的未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以粳稻花之舞和T-DNA插入突變體為材料，通過(guò)Tail-PCR、Southern雜交、Northern雜交和石蠟切片分析，鑒定到一株T-DNA插入苗期致死突變體ls。并對(duì)OseRF1-1進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析，為進(jìn)一步分析OseRF1在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為粳稻花之舞和T-DNA插入突變體，種植在周口師范學(xué)院人工溫室。種子用1/1 000的汞消毒后，平鋪于含有濾紙和少量水的培養(yǎng)皿中，置于30℃催芽，發(fā)芽后移入水稻營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)，2周后進(jìn)行表型分析，并保存水稻第四片葉用于DNA和RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、ls突變體鑒定和Southern雜交采用美基生物植物快速DNA提取試劑盒（D3187，http://www.magentec.com.cn/）提取DNA，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。設(shè)計(jì)3輪特異PCR嵌套引物（表1），利用Tail-PCR技術(shù)鑒定T-DNA插入突變體，具體步驟參考Zhao等［14］方法，Southern雜交所用 DNA需經(jīng) EcoR I、EcoR V、Hind III和Sac I（TaKaRa）酶切消化，具體操作參考Codner等［15］方法。

表1 本研究所需引物Table 1 Primers used in the study

1.2.2 ls突變體組織石蠟切片分析 選擇野生型和突變體植株葉鞘與分蘗節(jié)連接區(qū)域進(jìn)行石蠟切片分析。先將材料切成0.5 cm小塊，用90 mL 70%酒精、5 mL冰醋酸、5 mL福爾馬林配置的混合液固定，抽氣30 min，固定24 h后用于后續(xù)試驗(yàn)，隨后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、切片，然后對(duì)石蠟切片進(jìn)行硼砂甲苯胺藍(lán)染色5 min，用水洗干凈并置于37℃烘干，最后用二甲苯脫蠟20 min，2次，用加拿大樹(shù)膠封藏。將切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。試驗(yàn)所需試劑及配置方法參考Yang等［16］方法。

1.2.3 RNA提取和Northern雜交 采用美基生物植物RNA提取試劑盒提取RNA，詳細(xì)步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。利用地高辛Northern試劑盒（Roche）進(jìn)行Northern雜交和探針合成，試驗(yàn)所需封閉劑和抗體均由DIG熒光檢測(cè)試劑盒（Roche）提供。具體方法參考Zia等［17］方法。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 采用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行蛋白氨基酸序列分析，利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子量、等電點(diǎn)、疏水性等。

1.2.5 基因表達(dá)模式分析 選取粳稻花之舞2周齡幼苗的根、莖、分蘗結(jié)、幼葉和抽穗后7 d的老葉、穗和種子進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析。利用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，所用儀器為ABI 7500 fast system。每個(gè)試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù)。以O(shè)sRUB1（Os06g0681400）為內(nèi)參基因，利用2-△△CT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 基因克隆與亞細(xì)胞定位 以水稻葉片cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增OseRF1-1（不含終止密碼子）編碼區(qū)序列，將測(cè)序正確的序列經(jīng)Kpn I和Xba I酶酶切。與GFP融合構(gòu)建OseRF1-1-GFP融合表達(dá)亞細(xì)胞定位載體。以PEG介導(dǎo)的方法，將空載體和OseRF1-1-GFP融合表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞，16℃暗培養(yǎng)16 h，熒光共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位情況，原生質(zhì)體的制備參考Tang等［18］方法。

2 結(jié)果

2.1 水稻苗期致死突變體表型分析

在前期研究中，發(fā)現(xiàn)一株水稻苗期致死（seedling lethal）純合突變體，命名為ls突變體。與野生型植株相比，ls突變體植株在3葉期前沒(méi)有任何表型，但3-5葉分蘗期時(shí)，ls突變體植株迅速死亡（圖1-a）。表型分析進(jìn)一步表明，與野生型相比，ls突變體首先從莖基部由下往上逐漸褐化壞死，然后植株脫水而死（圖1-b），通常在分蘗生長(zhǎng)前l(fā)s突變體植株就已經(jīng)死亡。

圖1 野生型和ls突變體表型Fig.1 Phenotype of wild type and ls mutant

2.2 ls突變體組織石蠟切片分析

為了明確ls突變體導(dǎo)致苗期致死的原因，通過(guò)奧林巴斯SZX7體視顯微鏡對(duì)葉鞘與分蘗節(jié)相連部位進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)ls突變體褐化區(qū)最早出現(xiàn)在葉鞘與分蘗節(jié)相連的泡沫狀組織中，然后向內(nèi)擴(kuò)散，直至整個(gè)分蘗節(jié)壞死（圖2）。為進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)野生型和ls突變體分蘗節(jié)從下往上橫切面進(jìn)行了石蠟切片分析。結(jié)果（圖3）表明，ls突變體葉鞘與分蘗節(jié)連接區(qū)域的組織結(jié)構(gòu)破壞，分蘗節(jié)較下部位癥狀較嚴(yán)重，越向上癥狀越輕。

圖2 野生型和ls突變體葉鞘與分蘗節(jié)部位顯微鏡結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Microscopic structure analysis of wild type and ls mutants leaf sheaths and tiller node sites

圖3 野生型和ls突變體橫切面結(jié)構(gòu)Fig.3 Cross-sections of wild-type and ls mutant

2.3 ls突變體為T(mén)-DNA單拷貝插入突變體

選取ls突變體（至少600株雜合體后代）進(jìn)行表型統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)正常表型與致死表型的比例為3∶1，因此，推測(cè)ls突變體可能是單隱性基因突變。為了明確T-DNA插入的拷貝數(shù)，用潮霉素序列作為探針進(jìn)行Southern雜交試驗(yàn)，結(jié)果（圖4）表明，EcoR V、EcoR I和Xba I酶切結(jié)果均出現(xiàn)一條帶，表明ls突變體基因組中只有T-DNA單拷貝插入。

圖4 ls突變體基因組DNA Southern雜交Fig.4 Southern blot of genome DNA in the ls mutant

2.4 ls突變體的鑒定

為了明確導(dǎo)致水稻苗期致死的基因，通過(guò)Tail-PCR技術(shù)對(duì)ls突變體T-DNA插入的位點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入在第1染色體Os01g0939500區(qū)域（圖5-a）。結(jié)果表明，ls致死突變體為eRF1-1（Os01g0939500）的T-DNA插入突變體。測(cè)序分析進(jìn)一步表明，ls突變體T-DNA插入時(shí)，丟失了T-DNA的右邊界和NOS的終止子序列，導(dǎo)致GUS和eRF1-1融合轉(zhuǎn)錄，而GUS的終止密碼子仍然存在，因此eRF1-1不能進(jìn)行正常翻譯（圖5-b）。為了進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)果，以GUS和eRF1-1序列設(shè)計(jì)探針進(jìn)行Northern雜交試驗(yàn)。結(jié)果表明，Northern雜交證明erf1-1中確實(shí)轉(zhuǎn)錄出GUS和eRF1-1的融合轉(zhuǎn)錄子（圖5-c和圖5-d）。

圖5 ls突變體中T-DNA插入位置分析Fig.5 T-DNA insertion site analysis of ls mutant

2.5 OseRF1-1的基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列分析

OseRF1-1（Os01g0939500） 序 列 分 析 發(fā) 現(xiàn)，OseRF1-1全長(zhǎng)3 290 bp，不含內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄形成mRNA長(zhǎng)1 311 bp，編碼436個(gè)氨基酸。氨基酸序列比對(duì)分析表明，水稻eRF1-1與小麥eRF1同源性為93.81%，與擬南芥eRF1同源性為87%，且水稻eRF1-1蛋白也存在NIKS、Y-C-F和CGQ保守基序（圖6）。以上結(jié)果表明，eRF1編碼的氨基酸序列在雙子葉植物和單子葉植物是高度保守的。

圖6 eRF1和其同源蛋白氨基酸序列分析Fig.6 Analysis of amino acid sequences of eRF1 and its homologous proteins

2.6 OseRF1家族基因表達(dá)模式分析

運(yùn)用NCBI序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，eRF1家族在水稻中有4個(gè)成員，依據(jù)它們?cè)谌旧w上的位置，分別命名 為 OseRF1-1、OseRF1-2、OseRF1-3和 OseRF1-4。為了進(jìn)一步明確OseRF1家族基因的表達(dá)模式，運(yùn)用 RT-qPCR技 術(shù) 檢 測(cè) 了OseRF1-1、OseRF1-2、OseRF1-3和OseRF1-4在根、莖、幼葉、老葉、分蘗節(jié)、穗和種子中的表達(dá)情況。結(jié)果（圖7）表明，水稻eRF1的4個(gè)拷貝都是組成型表達(dá)，其中，OseRF1-2、OseRF1-4表 達(dá) 量 高，OseRF1-1、OseRF1-3表達(dá)量很低，OseRF1-1在穗里表達(dá)較高，OseRF1-3在種子中特異表達(dá)。

圖7 OseRF1家族基因的表達(dá)模式分析Fig.7 Expression profile of OseRF1 family genes

2.7 OseRF1-1蛋白亞細(xì)胞定位分析

為了明確OseRF1-1蛋白的基本特性，構(gòu)建OseRF1-1-GFP融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞，進(jìn)行亞細(xì)胞定位情況觀察。結(jié)果（圖8）表明，35S∷GFP對(duì)照載體在細(xì)胞任何部位都檢測(cè)到了綠色熒光信號(hào)，與此類(lèi)似，35S∷eRF1-1-GFP融合蛋白在所有細(xì)胞中也檢測(cè)到了綠色熒光信號(hào)，結(jié)果表明，OseRF1-1蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。

圖8 OseRF1-1的亞細(xì)胞定位Fig.8 Subcellular localization of OseRF1-1

3 討論

eRF1和eRF3已被證實(shí)在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中起重要的作用［19-20］。研究表明，核糖體在細(xì)胞核中完成組裝，然后在細(xì)胞質(zhì)中行使其蛋白翻譯的功能，eRF1和eRF3一起在核糖體中協(xié)同完成終止密碼子的識(shí)別與翻譯過(guò)程［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)OseRF1-1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，該結(jié)果與eRF1蛋白在細(xì)胞質(zhì)中完成蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程相一致。

eRF1蛋白除了蛋白翻譯功能外，eRF1也在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［23-24］。如擬南芥eRF1-1的Cas9基因編輯突變體植株呈現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育缺陷表型［23］；eRF1-2和ORANG互作調(diào)控?cái)M南芥葉柄細(xì)胞伸長(zhǎng)［24］；共抑制擬南芥eRF1影響轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞伸長(zhǎng)和徑向細(xì)胞分裂［12］。在擬南芥中，eRF1-2也參與植物對(duì)葡萄糖脅迫的調(diào)控，在葡萄糖脅迫條件下，過(guò)表達(dá)eRF1-2植株呈現(xiàn)出種子發(fā)芽延遲和早期幼苗發(fā)育停滯表型［13］。本研究鑒定了一株T-DNA插入引起水稻幼苗致死ls突變體，ls突變體5葉期后分蘗節(jié)和莖基部連接處細(xì)胞逐漸壞死，且分蘗節(jié)越往下癥狀越嚴(yán)重，結(jié)果表明，ls突變體導(dǎo)致苗期致死可能是由于引起分蘗節(jié)下部位細(xì)胞死亡造成的。Tail-PCR和Northern雜交分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入到eRF1-1基因組，且GUS和eRF1-1融合轉(zhuǎn)錄然而GUS終止密碼子仍存在導(dǎo)致eRF1-1不能正常的轉(zhuǎn)錄，這說(shuō)明ls突變體導(dǎo)致水稻苗期致死的原因可能是因?yàn)門(mén)-DNA插入eRF1-1導(dǎo)致該基因不能正常轉(zhuǎn)錄所造成的。

同源序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，eRF1基因在水稻中存在4個(gè)拷貝，且OseRF1-3在種子中特異表達(dá)，表明OseRF1-3也許在種子生長(zhǎng)發(fā)育中起重要的調(diào)控作用，OeeRF1-2和OseRF1-4為組成型表達(dá)，推測(cè)這兩個(gè)基因也許在植物生產(chǎn)發(fā)育的整個(gè)進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用，有待進(jìn)一步研究。綜上所述，本研究為進(jìn)一步研究eRF1基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的功能提供有價(jià)值的參考信息。

4 結(jié)論

鑒定了一個(gè)水稻eRF1-1的T-DNA插入突變體ls，該突變體在3-5葉期后呈現(xiàn)苗期致死表型。OseRF1-1在穗中高表達(dá)，且編碼一個(gè)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的蛋白。eRF1-1參與植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程的調(diào)控。