玉米NF-Y轉(zhuǎn)錄因子基因ZmNF-YB13響應(yīng)干旱和鹽脅迫的功能分析

張彤彤 鄭登俞 吳忠義 張中保 于榮

（1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100097）

玉米（Zea mays L.）適應(yīng)性強(qiáng)，種植面積廣，是重要的糧食、經(jīng)濟(jì)、飼料作物［1-2］，而干旱［3-5］、鹽堿化［6-8］嚴(yán)重影響玉米的生產(chǎn)發(fā)展，因此提高玉米對(duì)干旱、鹽堿化等非生物脅迫的抗性十分重要。NF-Y家族是一類(lèi)可以與啟動(dòng)子序列中的CCAAT-box結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，又叫亞鐵血紅素激活蛋白（hemeactivator proteins，HAPs） 或 CCAAT結(jié) 合 因 子（CCAAT-binding factor，CBF）， 包括 NF-YA（CBFB/HAP2）、NF-YB（CBF-A/HAP3）、NF-YC（CBFC/HAP5）3個(gè)亞家族［9］，在植物胚胎和種子發(fā)育、脅迫響應(yīng)等進(jìn)程中發(fā)揮重要作用［10］。在擬南芥、水稻、小麥、油菜、高粱等植物中都有NF-Y家族功能的研究報(bào)道。擬南芥NF-YA5基因在干旱脅迫誘導(dǎo)下高表達(dá)；和野生型相比，敲除NF-YA5的擬南芥葉片失水更多；相反，過(guò)表達(dá)NF-YA5的擬南芥植株葉片失水少，抗旱性強(qiáng)［11］。過(guò)表達(dá)AtNF-YA2、A3、A7和A10的擬南芥植株對(duì)干旱等非生物脅迫的耐受性增強(qiáng)［12］。水稻中，Das等［13］報(bào)道OsNFYB9在水稻中的異位表達(dá)推遲了抽穗期，而且水稻OsNF-YB9能與花發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子MADS 1相互作用。在干旱脅迫下，水稻OsNF-YA7表達(dá)量上調(diào)，過(guò)表達(dá)OsNF-YA7的水稻抗旱性增強(qiáng)［14］。過(guò)表達(dá)OsHAP2E的轉(zhuǎn)基因水稻增強(qiáng)了對(duì)鹽堿化和干旱的抗性［15］。小麥中，TaNF-YA10-1基因在擬南芥中異源表達(dá)顯著提高了擬南芥對(duì)干旱脅迫的耐受性［16］。油菜BnNF-Ys基因家族中的多個(gè)基因在鹽、干旱或ABA處理后表達(dá)量迅速上調(diào)［17］。在鹽、甘露醇、ABA、低溫和高溫不同脅迫下，高粱SbNF-YB7、B12、B15和B16均受較強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá)［18］。除擬南芥、水稻、小麥、油菜和高粱外，茶樹(shù) CsNF-YAs［19］、蘋(píng)果 MsNF-YB21［20］和大蒜AsNF-YC8［21］等均在非生物脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)。總之，NF-Y在參與植物耐旱、抗鹽等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是植物抗逆育種的重要蛋白。

在玉米中，對(duì)NF-Y家族的報(bào)道還較少。ZmNFYA3能夠分別與bHLH92、FAMA和MYC4的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，提高抗旱性和耐高溫性［22］。玉米ZmNFYC8與擬南芥的NF-YC2基因高度同源，而NF-YC2基因在植物開(kāi)花過(guò)程中起調(diào)控作用［23］。我們前期工作發(fā)現(xiàn)，ZmNF-YB13（GRMZM5G804893）基因在嚴(yán)重干旱脅迫條件下被誘導(dǎo)表達(dá)并且表達(dá)量較高［24］。本研究從玉米中克隆了ZmNF-YB13基因，在序列分析基礎(chǔ)上分析該基因在玉米不同組織器官以及不同逆境脅迫下的表達(dá)模式，并分析該基因異源表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱、抗鹽表型，以期為耐旱、抗鹽性分子機(jī)制解析和分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米自交系品種B73用于玉米ZmNF-YB13全長(zhǎng)cDNA的克隆及表達(dá)模式分析；擬南芥哥倫比亞生態(tài)型Col-0用于ZmNF-YB13異源表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化；大腸桿菌Trans1 T1購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌GV3101為本實(shí)驗(yàn)室保存；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京擎科生物技術(shù)有限公司；過(guò)氧化物酶（POD）活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）含量測(cè)定試劑盒等購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶等購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司，常用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 玉米ZmNF-YB13 cDNA的克隆及生物信息學(xué)分析

1.2.1.1 玉米ZmNF-YB13 cDNA的克隆 提取玉米葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，設(shè)計(jì)引物pZmNFYB13-FP、pZmNF-YB13-RP，利用高保真DNA聚合酶對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接至T5 Zero載體，獲得單克隆后送上海生工進(jìn)行菌落測(cè)序。各引物序列見(jiàn)表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.1.2 玉米ZmNF-YB13的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析 通過(guò)ProParam工具（http://web.expasy.org/protpa ram/）預(yù)測(cè)ZmNF-YB13基因編碼的蛋白分子量和理論等電點(diǎn)；分別使用SPOMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.exp asy.org/）分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)；應(yīng)用TMH MM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進(jìn)行蛋白跨膜預(yù)測(cè)分析；使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析。

1.2.2 ZmNF-YB13基因組織差異和脅迫處理表達(dá)分析 選取生長(zhǎng)在溫室（光照16 h，28℃，黑暗8 h，23℃）中三葉一心時(shí)期的玉米幼葉、幼根和莖，選取田間種植的玉米吐絲期穗位葉、根、花絲、雄穗，授粉后10 d的幼胚，-80℃凍存。

將玉米自交系B73幼苗生長(zhǎng)于含有營(yíng)養(yǎng)液的水培桶中，在水培桶中放入通氧石，通過(guò)氣泵（45 min通氣/30 min不通氣，間歇循環(huán)）給植物提供氧氣。玉米幼苗正常生長(zhǎng)至三葉一心時(shí)期分別進(jìn)行脫水、高鹽、冷、PEG、脫落酸（ABA）以及茉莉酸（JA）處理。脫水處理為將幼苗從水培桶中取出，用吸水紙吸收表面多余水分，室溫放置，自然脫水；鹽、PEG處理為將幼苗分別放入含200 mmol/L NaCl和20% PEG的營(yíng)養(yǎng)液中；冷處理為將含有營(yíng)養(yǎng)液的幼苗放置在4℃冰箱；分別取處理0、1、2、5、10和24 h后的地上部和根，-80℃凍存。ABA和JA處理分別將含有100 μmol/L ABA和100 μmol/L JA的溶液噴施在幼苗葉片上，并包裹上保鮮膜，分別取處理0、1、2和5 h后的葉，-80℃凍存。

使用凍存的材料提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后作為qPCR模板。設(shè)計(jì)特異性引物pZmNF-YB13RT-FP、pZmNF-YB13RT-RP，以GAPDH為內(nèi)參基因，對(duì)不同處理的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)樣本，每個(gè)生物學(xué)樣本設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。應(yīng)用2-ΔΔCT方法分析ZmNF-YB13基因的表達(dá)模式。

1.2.3 植物異源表達(dá)載體pCAMBIA3301：ZmNFYB13的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

1.2.3.1 異源表達(dá)載體構(gòu)建 參照殷龍飛等的方法［25］構(gòu)建異源表達(dá)載體。

1.2.3.2 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化 將重組質(zhì)粒pCAMBIA3301∶ZmNF-YB13轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，通過(guò)浸花法侵染擬南芥Col-0，22℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h取出擬南芥苗常規(guī)培養(yǎng)。單株收取T0代種子，利用含有除草劑草銨膦的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選獲得T1代種子。提取T1代幼苗葉片基因組DNA為模板，利用引物pZmNF-YB13T-FP、pZmNF-YB13T-RP進(jìn)行PCR檢測(cè)。單株收獲陽(yáng)性植株種子并加代獲得T3代純合植株。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定

1.2.4.1 1/2 MS培養(yǎng)基中不同逆境和激素處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析 將異源表達(dá)ZmNF-YB13轉(zhuǎn)基因擬南芥3個(gè)株系及野生型擬南芥種子4℃春化3 d后，用0.5% NaClO（有效氯）消毒10 min，接著用無(wú)菌蒸餾水清洗5次，然后播種于1/2 MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)7 d后，各株系選取5株生長(zhǎng)一致的幼苗移至對(duì)照以及分別含100 mmol/L NaCl、200 mmol/L甘露醇、75 μmol/L JA和50 μmol/L ABA 的 1/2 MS培養(yǎng)基上，各設(shè)3個(gè)重復(fù)，垂直放置于22℃，16 h光/8 h暗的溫室中培養(yǎng)，8 d后拍照并使用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)。

1.2.4.2 土壤中轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型分析及生理指標(biāo)的測(cè)定 選取1周大小的發(fā)育良好、生長(zhǎng)狀態(tài)一致的轉(zhuǎn)基因擬南芥及野生型對(duì)照植株移栽至土壤中，分別設(shè)置對(duì)照組、干旱組、鹽處理組，每組4盒，每盒4株幼苗，各組設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。幼苗在營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)3周后，對(duì)干旱組進(jìn)行3周自然干旱處理和兩天覆水處理；對(duì)鹽處理組澆灌300 mmol/L NaCl進(jìn)行一周脅迫處理。表型觀(guān)察后，測(cè)定植株的MDA含量和POD的活性。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)，數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0，采用單因素方差對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，不同字母表示在0.05水平上有顯著差異，*表示 0.05 水平上顯著差異，**表示 0.01 水平上極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 ZmNF-YB13基因的克隆與生物信息學(xué)分析

通過(guò)RT-PCR的方法，從玉米中擴(kuò)增得到ZmNF-YB13基因，全長(zhǎng)537 bp，編碼178個(gè)氨基酸。對(duì)ZmNF-YB13的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因含有NF-Y家族所特有的保守結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)分析表明，ZmNF-YB13蛋白分子量為18.9 kD，理論等電點(diǎn)為6.83，不具跨膜結(jié)構(gòu)，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大（59.93%）。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ZmNF-YB13蛋白與水稻中的OsHAP3B親緣關(guān)系最近（圖1）。

圖1 ZmNF-YB13基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of gene ZmNF-YB13

利用PlantCARE對(duì)ZmNF-YB13基因上游2 000 bp DNA序列進(jìn)行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子含有啟動(dòng)子核心元件TATA-box、脫水反應(yīng)相關(guān)元件DRE、低溫響應(yīng)元件LTRE以及光反應(yīng)響應(yīng)元件G-box和Box4。此外，還含有ABA激素響應(yīng)元件ABRE和JA激素響應(yīng)元件TGACG-motif。

2.2 ZmNF-YB13基因的表達(dá)模式分析

2.2.1 玉米ZmNF-YB13基因的組織特異性分析 qPCR分析發(fā)現(xiàn)，ZmNF-YB13基因在不同組織中均有表達(dá)。在花絲中的表達(dá)量最高，在成熟根、莖、雄穗、幼根和幼胚里的表達(dá)量較低，在穗位葉和幼葉里的表達(dá)量最低（圖2）。

圖2 ZmNF-YB13基因在玉米不同組織中的差異表達(dá)分析Fig.2 Tissue-specific expression pattern of gene ZmNFYB13 in maize

2.2.2 玉米ZmNF-YB13基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析 通過(guò)qPCR對(duì)ZmNF-YB13在不同逆境處理下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。脫水處理下，地上部ZmNF-YB13的表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)，在10 h達(dá)到峰值，與對(duì)照組相比顯著上升；根中ZmNF-YB13的表達(dá)量逐漸上調(diào)，在10 h出現(xiàn)下調(diào)，隨后在24 h時(shí)上調(diào)并達(dá)到峰值，約為對(duì)照的2.3倍（圖3-A）。冷（4℃）處理下，ZmNF-YB13在地上部中表達(dá)量下調(diào)；在根中先下調(diào)后上調(diào)，在5 h時(shí)表達(dá)量最大，與對(duì)照組差異顯著（圖3-B）。鹽處理下，地上部中的表達(dá)量在24 h時(shí)顯著上調(diào)；在根中表達(dá)量迅速上調(diào)，并在24 h達(dá)到最高水平，約為對(duì)照的32倍（圖3-C）。PEG處理下，ZmNF-YB13在地上部中的表達(dá)量迅速上調(diào)，隨后下調(diào)，但在24 h達(dá)到最高，顯著高于對(duì)照水平；在根中呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)，在5 h表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，在24 h時(shí)表達(dá)量最高（圖3-D）。在噴施植物激素ABA后，ZmNF-YB13在葉中的表達(dá)量迅速下調(diào)，在3 h時(shí)出現(xiàn)上調(diào)，表達(dá)水平最高（圖3-E）。在JA處理下，ZmNF-YB13在葉中的表達(dá)量緩慢上調(diào)，在5 h時(shí)達(dá)到最高水平，約為對(duì)照的2.3倍，差異顯著（圖3-F）。

圖3 逆境和激素脅迫下ZmNF-YB13基因的表達(dá)模式分析Fig.3 Expressions of ZmNF-YB13 in response to abiotic and hormone stress in maize

2.3 ZmNF-YB13轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗逆性分析

2.3.1 ZmNF-YB13轉(zhuǎn)基因植株的獲得 提取具有草銨膦抗性的擬南芥植株DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在6個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系中檢測(cè)到目的基因的存在，而野生型和陰性對(duì)照均無(wú)相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖4-A）。通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZmNF-YB13基因在6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均有不同程度的表達(dá)，表達(dá)水平顯著高于野生型對(duì)照植株（圖4-B）。選取L-1、L-2和L-3三個(gè)株系進(jìn)行后續(xù)表型觀(guān)察與鑒定。

圖4 T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定Fig.4 Identification of T3 transgenic A.thaliana

2.3.2 1 /2 MS培養(yǎng)基中不同逆境和激素脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析 由圖5可知，在對(duì)照組1/2 MS培養(yǎng)基中，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均能正常生長(zhǎng)。在含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片萎縮，轉(zhuǎn)基因擬南芥中L-2和L-3根長(zhǎng)與野生型擬南芥無(wú)顯著差異，但L-1的根長(zhǎng)長(zhǎng)于野生型，差異顯著（P ＜ 0.05）。在含有200 mmol/L甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)長(zhǎng)于野生型，差異極顯著（P ＜ 0.01）。在含有75 μmol/L JA的1/2 MS培養(yǎng)基中，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀^少，但轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)長(zhǎng)于野生型，差異顯著（P ＜ 0.05）。在含有50 μmol/L ABA的1/2 MS培養(yǎng)基中，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片均發(fā)黃，但轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)長(zhǎng)于野生型，差異極顯著（P ＜0.01）。以上結(jié)果說(shuō)明，異源表達(dá)ZmNF-YB13使擬南芥對(duì)逆境以及激素脅迫的耐受性增強(qiáng)。

圖5 不同脅迫處理下轉(zhuǎn)ZmNF-YB13基因擬南芥的表型分析Fig.5 Phenotypic analysis of ZmNF-YB13 transgenic A.thaliana under different stress treatments

2.3.3 土壤種植條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的耐旱和抗鹽性分析 在正常培養(yǎng)條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)良好，無(wú)表型差異（圖6-A）。對(duì)轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株進(jìn)行連續(xù)3周的干旱脅迫和一周高鹽（300 mmol/L NaCl）脅迫處理，發(fā)現(xiàn)野生型植株葉片嚴(yán)重萎蔫失水，而轉(zhuǎn)基因植株含有更多的綠葉（圖6-B，C），表現(xiàn)出更健康的生長(zhǎng)狀態(tài)。干旱處理實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)過(guò)2 d的覆水處理后，野生型擬南芥葉片出現(xiàn)輕微的恢復(fù)，而過(guò)表達(dá)植株的葉片充分伸展，呈健康的狀態(tài)。分別對(duì)鹽和干旱處理的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的MDA含量和POD活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖6-D）表明，兩種處理?xiàng)l件下，ZmNF-YB13異源表達(dá)擬南芥的MDA含量均低于野生型，差異極顯著。在干旱處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的POD活性顯著高于野生型。而在正常處理和鹽處理下，POD的活性在野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥中均無(wú)明顯差異（圖6-E）。

圖6 土壤中高鹽和干旱處理下擬南芥表型分析Fig.6 Phenotypic analysis of A.thaliana under high salt and drought treatment in soil

3 討論

植物對(duì)高鹽、干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物發(fā)育過(guò)程和響應(yīng)環(huán)境變化中起著重要作用［26］。植物的NF-YB基因家族的不同成員參與了植物對(duì)干旱、鹽等逆境脅迫的響應(yīng)［27］。本研究從玉米中克隆了一個(gè)NF-YB轉(zhuǎn)錄因子基因ZmNF-YB13，具有NF-Y轉(zhuǎn)錄因子家族所特有的結(jié)構(gòu)域。

目前其它物種中有許多NF-YB亞家族在響應(yīng)植物脅迫中的報(bào)道。如分別過(guò)表達(dá)AtNF-YB1和AtNFYB2的擬南芥植株抗旱性和耐熱性增強(qiáng)［28］。在干旱脅迫條件下，ZmNF-YB16的過(guò)表達(dá)提高了玉米植株在營(yíng)養(yǎng)和生殖階段對(duì)脫水和干旱脅迫的抗性，并提高了玉米產(chǎn)量［29］。異源表達(dá)野云杉PwNF-YB3基因的擬南芥植株對(duì)鹽、干旱和滲透脅迫的耐受性顯著增強(qiáng)［30］。在缺水條件下，異源表達(dá)葡萄PdNF-YB7基因的擬南芥植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐旱性［31］。在菊花中過(guò)表達(dá)CmNF-YB8基因降低了植株的耐旱性。而通過(guò)RNA干擾降低CmNF-YB8基因的轉(zhuǎn)錄水平后，植株的抗旱性增強(qiáng)［32］。這些研究結(jié)果表明，不同物種中的NF-YB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)不同逆境的響應(yīng)存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)ZmNF-YB13基因受脫水、冷、高鹽、PEG脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明ZmNF-YB13基因能夠響應(yīng)非生物脅迫。為進(jìn)一步明確該基因在響應(yīng)玉米非生物脅迫中的作用，我們對(duì)轉(zhuǎn)ZmNF-YB13基因擬南芥進(jìn)行了抗逆分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在分別含有100 mmol/L NaCl和200 mmol/L 甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)長(zhǎng)于野生型，差異顯著。土壤中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因擬南芥，在干旱和含有300 mmol/L NaCl的高鹽處理下，綠葉數(shù)量更多，差異顯著。MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，通過(guò)測(cè)量MDA的含量可以評(píng)估植株氧化應(yīng)激反應(yīng)［33］。結(jié)果顯示，在干旱和高鹽處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥中MDA含量低于野生型，差異顯著。并且在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的POD活性顯著高于野生型，進(jìn)一步說(shuō)

明了ZmNF-YB13基因參與植物的干旱和鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)研究的ZmNF-YB13基因，曾被命名為ZmNF-YB2，前人研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)ZmNF-YB2基因玉米可以增強(qiáng)玉米的抗旱性［34］。我們的研究結(jié)果顯示，異源表達(dá)ZmNF-YB13基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性增強(qiáng)，這和前人研究結(jié)果一致。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)了ZmNF-YB13基因能夠響應(yīng)鹽脅迫。通過(guò)qPCR發(fā)現(xiàn)ZmNF-YB13基因的表達(dá)量在JA處理下上調(diào)表達(dá)。并且在含有75 μmol/L JA的1/2 MS培養(yǎng)基中，異源表達(dá)ZmNF-YB13基因的擬南芥根長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于野生型。由此推測(cè)，ZmNF-YB13基因可能是通過(guò)JA信號(hào)通路來(lái)參與干旱和高鹽的脅迫應(yīng)答。

4 結(jié)論

玉米NF-Y家族基因ZmNF-YB13 cDNA全長(zhǎng)537 bp，編碼173個(gè)氨基酸。該基因在玉米多個(gè)組織器官中均有表達(dá)，其中在花絲中表達(dá)量最高，受脫水、冷、高鹽、PEG逆境處理以及ABA、JA激素脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)；轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)在含100 mmol NaCl、200 mmol甘 露 醇、75 μmol/L JA、50 μmol/L ABA的1/2 MS培養(yǎng)基中與野生型有顯著差異；在干旱和高鹽處理下，土壤中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量降低；同時(shí)干旱處理下，轉(zhuǎn)基因植株的POD活性升高，差異顯著，推測(cè)ZmNF-YB13基因在玉米響應(yīng)干旱和高鹽脅迫中起重要作用。