G-三鏈體可視化核酸傳感器用于四環(huán)素的檢測

劉寧寧 王鑫昕 蘭欣悅 褚華碩 陳旭 常世敏 李騰飛 許文濤

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，邯鄲 056038；2.中國農業(yè)大學營養(yǎng)與健康系 食品精準營養(yǎng)與質量控制教育部重點實驗室，北京 100083；3.邯鄲學院生命科學與工程學院，邯鄲 056005）

四環(huán)素（TET）屬于四環(huán)素類抗生素，是20世紀中期發(fā)現(xiàn)的一組廣譜抗生素。四環(huán)素因其廣譜活性和低成本，在畜牧業(yè)和水產養(yǎng)殖中被廣泛用于預防細菌感染［1］，四環(huán)素還被用作生長促進劑，以提高動物的生長速度［2］。然而，由于四環(huán)素在獸藥中的過度和不當使用，導致肉類、牛奶、蜂蜜、魚、蛋和蝦等制品中的抗生素殘留［3］，嚴重威脅人類健康，如造成過敏反應、細菌耐藥性、肝臟損傷和胃腸功能紊亂等［4］。因此，對動物產品中四環(huán)素的殘留制定了嚴格的規(guī)定。例如，歐洲聯(lián)盟（EU）將牛奶中四環(huán)素的最高殘留限量定為225 nmol/L，其他一些動物產品，如美國對肝臟、腎臟和肌肉組織也設定了最高殘留限量（MRL）值［5］。常用的檢測方法有儀器分析：高效液相色譜、毛細管電泳和氣相色譜-質譜（GC-MS）［6-8］、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）［9］和微生物抑制［10］。儀器分析是抗生素檢測中最常用和最靈敏的方法。然而，高效液相色譜、毛細管電泳法和氣相色譜-質譜法都需要使用一些大型儀器和有機溶劑，這需要耗費很高的成本并且對人體健康和環(huán)境都有巨大的危害。此外，提取過程非常耗時。酶聯(lián)免疫吸附試驗可能獲得假陽性結果，因為它可能與具有相似化學結構的物質發(fā)生交叉反應［11］。

G-三鏈體是由Chua等［12］在2013年探究G-四鏈體TBA（凝血酶適配體）時首次發(fā)現(xiàn)的一種不同于之前發(fā)現(xiàn)的DNA二級結構。這種結構是將TBA序列［d（GGTTGGTGTGGTTGG）］3′端適當截短，而折疊形成的。Kim等［13］發(fā)現(xiàn)G-三鏈體結構受分子擁擠、金屬離子濃度等影響，并證明金屬離子對G-三鏈體的穩(wěn)定順序為Ca2+＞K+＞Mg2+＞Na+。2018年Jung等［14］假設G-三鏈體具有G-四鏈體相似的化學結構與功能，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的G-三鏈體可以結合硫代黃素T（ThT）作為高效的熒光探針。到目前為止，功能研究和應用方面的報道非常有限。因此，G-三鏈體在生物傳感中的應用研究還處于初級階段。

適配體是通過指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進化，從隨機序列核酸文庫中篩選出來的單鏈DNA/RNA寡核苷酸，是對靶分子表現(xiàn)出良好親和力和特異性的生物識別元件［15］。適配體已經成為傳統(tǒng)識別元件的有力競爭者，并在疾病診斷和治療、農業(yè)環(huán)境監(jiān)測和食品安全檢查領域引起了極大的關注［16］。DNA鏈可以折疊成典型的結構，包括莖、環(huán)、發(fā)夾、假結和G-四鏈體［17］。基于核酸適配體/熒光色素體系的熒光策略因其操作簡單、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點而備受青睞。2014年Liu等［18］基于人端粒G-四鏈序列TEL22（人端粒G-四鏈序列）的結構轉化，以硫代黃素T（ThT）為熒光探針，研制了一種一步開啟的K+熒光傳感器。在100 mmol/L Na+的干擾下，檢出限為1 mmol/L。

硫代黃素T（ThT）是一種市售的水溶性苯并噻唑熒光色素，在游離態(tài)下表現(xiàn)出微弱的熒光發(fā)射。然而，ThT可以通過插層、溝槽結合和末端堆積識別G-四鏈體的結構，從而顯著增強其熒光強度［19］。ThT以其低成本、可商業(yè)化和G-四鏈體的選擇性鑒定而被廣泛用于設計無標記熒光適配體傳感器［20］。

本文開發(fā)了一種基于G-三鏈體雙鏈競爭內劈裂的新型方法，在四環(huán)素適配體5′-CGGTGGTG-3′的3′端加入3個胞嘧啶C，與G-三鏈體序列5′-GGGCACCAAGGGTTAGGG-3′互補配對，使 G-三鏈體發(fā)生內劈裂，靶標四環(huán)素與G-三鏈體競爭與適配體結合，靶標與適配體結合后，G-三鏈體序列斷開與適配體的互補，重新折疊為G-三鏈體，從而增強ThT熒光強度，通過測定ThT激發(fā)波長為450 nm，發(fā)射波長為490 nm處熒光強度，來確定與適配體結合的四環(huán)素的量，實現(xiàn)了四環(huán)素的檢測。適配體的引入提高了檢測的特異性，ThT作為信號輸出，增強了輸出信號，降低了檢測成本，本方法可以在25 min內完成，且靈敏度高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 硫代黃素T（ThT）、四環(huán)素、KCl、NaCl、MgCl2、Tris、核酸序列（表1）、甲醇、蒸餾水；本實驗所有序列均由北京睿博興科生物技術有限公司合成。

表1 適配體及G-三鏈體序列表Table 1 Sequence list of aptamers and G-triplex

1.1.2 主要設備 熒光分光光度計（型號：G9800A），美國安捷倫科技有限公司；基因擴增儀（型號：A300），杭州朗基科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗原理 本實驗原理圖如圖1所示，依據G-三鏈體可以增強ThT熒光強度，在適配體存在情況下，適配體與G-三鏈體互補配對，形成復雜的雙鏈結構，此時不能增強ThT的熒光強度，加入四環(huán)素以后，四環(huán)素與適配體結合，破壞了互補雙鏈結構，使富G序列可自由折疊形成G-三鏈體結構，從而增強ThT熒光強度，依據ThT熒光強度的增強程度對四環(huán)素進行靈敏檢測。

圖1 G3-Apt1檢測四環(huán)素原理圖Fig.1 Schematic diagram of detecting tetracycline by G3-Apt1

1.2.2 序列的設計 在四環(huán)素適配體5′-CGGTGGTG-3′的3′端加入3個胞嘧啶C，得到新的四環(huán)素適配體序列 Apt1：5′-CGGTGGTGCCC-3′；將 G-四鏈 體 序 列 5′-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3′［21］去掉3′端的“TTAGGG”得到一條G-三鏈體序列5′-GGGTTAGGGTTAGGG-3′，在 5′端 3 個鳥嘌呤 G之后加入與適配體互補配對堿基并分別對其進行裁短，得到G01-G07，詳細名稱、序列、堿基數(shù)見表1。

1.2.3 適配體親和能力表征 取10 μL濃度為0.5 mol/L的氯化鈉溶液，加入8 μL水，混勻后加入到100 μL 膠體金中 ；取 5 μL 濃度為 2 μmol/L 的適配體和 5 μL水，然后加入 100 μL膠體金 ；取 5 μL 濃度為2 μL的適配體和5 μL濃度分別為1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L的四環(huán)素于不同離心管（37℃孵育20 min），然后加入100 μL膠體金；室溫孵育60 min；最后各加入10 μL濃度為0.5 mol/L的氯化鈉溶液。重復3次實驗。

1.2.4 G-三鏈體序列的優(yōu)化 分別取10 μL濃度為20 μmol/L的G01-G07序列與適配體混勻，30℃退火后，一組加入10 μL濃度為100 μmol/L的四環(huán)素溶液；另一組加入10 μL水，然后各加入60 μL濃度為100 μmol/L的氯化鉀溶液，37℃孵育20 min后，加入10 μL濃度為100 μmol/L的ThT以激發(fā)波長為450 nm測定其490 nm處熒光強度。以F0的大小作為G01-G07序列選取依據。重復3次實驗。公式為：F0=Fa/Fb（其中Fa為加入靶標后ThT熒光強度，F(xiàn)b為不加靶標時ThT熒光強度）。

1.2.5 傳感器的制備 取10 μL濃度為20 μmol/L的適配體序列與10 μL濃度為20 μmol/L的G-三鏈體序列混勻，95℃變性5 min，30℃退火15 min，得到傳感器記為G3-Apt1。

1.2.6 G3-Apt1體系的優(yōu)化 本實驗中ThT熒光強度為信號來源，影響ThT熒光強度的因素有體系中離子的種類及濃度、ThT的濃度及ThT熒光強度的測定時間；同時靶標的孵育時間會影響靶標與適配體的結合，從而影響ThT的信號輸出。所以需要對體系中離子種類及濃度、ThT濃度及測定時間、靶標孵育時間進行優(yōu)化。本實驗離子體系使用NaCl、KCl、MgCl2、Tris-HCl這 4種物質進行優(yōu)化，濃度梯度設定為 ：1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L，時間設定為：0、5、10、20和30 min。重復3次實驗。

1.2.7 靈敏度檢測及標準曲線的繪制 為了檢測G3-Apt1用于四環(huán)素的檢測能力，在優(yōu)化得到的最佳條件下，配制濃度為10 mmol/L的四環(huán)素溶液，稀釋10 000倍后得到濃度為1 μmol/L的四環(huán)素溶液，然后分別稀釋得到濃度500、100、50、10、5和1 nmol/L的四環(huán)素溶液，并加入到制備好的G3-Apt1傳感器中，加入 10 μL 濃度為 100 μmol/L 的 ThT，測定以450 nm為激發(fā)波長490 nm處ThT的熒光強度，通過測定加入不同濃度四環(huán)素后ThT熒光強度，得到四環(huán)素檢測限及定量限，來驗證G3-Apt1傳感器的靈敏度，根據加入不同濃度的四環(huán)素測定的ThT熒光強度值繪制標準曲線。重復3次實驗。

1.2.8 特異性檢測 為了檢測G3-Apt1傳感器的特異性，選取了鹽酸四環(huán)素、土霉素（四環(huán)素類）、氯霉素（酰胺醇類）、鏈霉素（氨基糖苷類）、林可霉素（林可胺類）在內的5種常見抗生素進行了G3-Apt1方法的特異性分析，采用與四環(huán)素溶解相同的方法溶解，并稀釋至1 μmol/L，取10 μL與G3-Apt1傳感器反應。重復3次實驗。

1.2.9 實際樣品中檢測 為了評價該方法在實際樣品中的檢測性能，首先將原料奶2 mL放入15 mL離心管中，用水稀釋至5 mL，然后加入1 mL的10%三氯乙酸和1 mL的氯仿，在旋渦下混合1 min，沉淀蛋白質，溶解樣品基質中的脂肪和其他有機物?；旌衔镌?0℃下超聲處理15 min，在13 000 r/min下離心10 min以分離沉淀物，取上清液。分別測定加入四環(huán)素濃度為1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L牛奶樣品與G3-Apt1反應后ThT的熒光強度，進行 3次重復檢測，通過計算ThT激發(fā)波長為450 nm、發(fā)射波長為490 nm處的熒光強度，來計算四環(huán)素的回收率，通過回收率來確定方法用于實際樣品檢測的性能。

2 結果

2.1 適配體親和能力表征

為了驗證在適配體序列5′-CGGTGGTG-3′的3′端加入3個胞嘧啶C，得到新的四環(huán)素適配體序列Apt1：5′-CGGTGGTGCCC-3′與四環(huán)素親和能力，利用膠體金進行測定。從圖2-A中可以看出，加入四環(huán)素以后，膠體金由紅色變?yōu)樽仙?，說明由于靶標與適配體的結合，而缺少單鏈對膠體金的穩(wěn)定作用，使膠體金易發(fā)生聚沉，同時隨著靶標濃度的增大膠體金聚沉程度更高，并且1 μmol/L靶標與2 μmol/L適配體即可發(fā)生膠體金的沉淀，因此適配體Apt1對四環(huán)素具有較好親和力。

圖2 適配體及序列優(yōu)化圖Fig.2 Aptamer and sequence optimization diagram

2.2 G-三鏈體序列的優(yōu)化

根據1.2.4中的方法，為了便于明顯比較加入靶標后ThT熒光強度的變化，以及不同序列加入靶標后ThT熒光強度變化，以F0值作為判斷G-三鏈體序列性能的依據。得到G01-G07加入靶標前后ThT熒光強度的比值F0，結果如圖2-B所示，G03序列的F0值要明顯高于其他序列，這可能是由于四環(huán)素適配體序列與G-三鏈體序列在至少互補8對堿基時，已經完全將富G序列封閉為雙鏈結構，但是封閉9對堿基的G02和封閉10對堿基G01序列，卻由于封閉過于嚴密而在加入靶標四環(huán)素以后不能將雙鏈打開釋放富G序列，導致F0值要比G03序列低。因此，G03序列為傳感器制備的最佳序列。

2.3 反應體系的優(yōu)化

為了探究反應的最佳體系，分別在不同環(huán)境中進行反應，得到結果如圖3-A所示，ThT熒光強度為本實驗的信號輸出源，反應體系對ThT熒光強度的增強程度越高，表示反應體系越有利于靶標與適配體的結合，氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀3種溶液加入Tris-HCl后（圖3-A，1-3），均較不加入（圖3-A，5-7）時對ThT熒光強度增強效果較低，可能是因為Tris-HCl的加入會對靶標與適配體的結合產生影響；在不加入Tris-HCl的3種溶液對比中，KCl溶液（圖3-A，7）對ThT熒光強度增強效果最好。然后又對KCl濃度進行了優(yōu)化，如圖3-B所示，KCl最佳濃度為100 μmol/L。所以最佳反應體系為100 μmol/L的KCl溶液。

圖3 不同條件下ThT熒光強度Fig.3 ThT fluorescence intensities under different conditions

2.4 適配體孵育時間

靶標與適配體的孵育時間會影響靶標與適配體的結合程度，從而影響到G-三鏈體的形成，進而影響ThT的信號輸出。為了優(yōu)化適配體的孵育時間，本實驗通過測定靶標與適配體孵育不同時間時ThT的熒光強度，來選擇適配體與靶標孵育的最佳時間。從圖4-A中可以看出，隨著孵育時間的變化，ThT的熒光強度逐漸增強，直到20 min時達到最強，所以選定20 min為靶標與適配體的孵育時間。

圖4 時間的優(yōu)化圖Fig.4 Time optimization

2.5 ThT熒光強度測定時間

作為熒光素，在不同溶液條件下，ThT熒光衰減均非常迅速，甚至可達ps、ns級別，因此，ThT熒光強度會發(fā)生快速淬滅。為了探究ThT熒光強度測定的最佳時間，本實驗探究了ThT熒光強度隨時間變化關系。從圖4-B中可以看出隨著時間的變化，ThT熒光強度逐漸降低，在2-3 min時有一個短暫的穩(wěn)定狀態(tài)，可能是由于ThT的加入，誘導更多的G07序列折疊為G-三鏈體結構，從而在2-3 min時，ThT熒光強度形成了一個短暫的平衡狀態(tài)，所以ThT熒光強度會在2-3 min時出現(xiàn)一個穩(wěn)定期。所以測定ThT熒光強度時一定要把握住時間，在加入ThT后2-3 min內完成熒光強度的測定。

2.6 G3-Apt1反應體系靈敏的測定及標準曲線的繪制

應用基于G3-Apt1傳感器獲得的ThT熒光強度值如圖5-A所示，隨著四環(huán)素濃度的增加ThT熒光強度逐漸增強，并在1 nmol/L-1 μmol/L之間有良好的線性關系。標準曲線如圖5-B所示，ThT熒光強度與四環(huán)素濃度之間的線性關系方程為Y=36.67lgX+61.02，R2為0.99，線性關系良好，通過測定加入不同濃度四環(huán)素后ThT熒光強度，得到四環(huán)素的檢測限（LOD）為0.07 nmol/L。

圖5 G3-Apt1傳感器的建立圖Fig.5 Establishment of G3-Apt1 sensor

2.7 特異性檢測

從圖6中可以看出，四環(huán)素和鹽酸四環(huán)素的熒光差異不大，可能是因為鹽酸與四環(huán)素反應生成鹽酸四環(huán)素以后并未破壞四環(huán)素與適配體的識別位點，說明該傳感器還具有檢測鹽酸四環(huán)素的潛力；土霉素、氯霉素、鏈霉素、林可霉素熒光強度基本為背景值，明顯低于四環(huán)素熒光強度，說明傳感器具有很好的特異性。

圖6 特異性驗證圖Fig.6 Specificity verification chart

2.8 實際樣品檢測

通過G3-Apt1傳感器得到的四環(huán)素在牛奶樣品中的回收率表，如表2所示，回收率均低于108%，符合規(guī)定，表明G3-Apt1傳感器可用于牛奶樣品的檢測。

表2 牛奶樣品中四環(huán)素添加回收表Table 2 Addition and recovery table of tetracycline in milk samples

3 討論

在不同溶液條件下，ThT熒光衰減均非常迅速，甚至可達ps、ns級別，因此，ThT熒光強度會發(fā)生快速淬滅。K+的存在會誘導G07序列折疊為G-三鏈體結構，ThT會嵌入到G-三鏈體從而增強ThT的熒光強度［22］，但由于ThT熒光強度會自發(fā)進行衰減，G-三鏈體只能減緩這種衰減，而不能停止ThT熒光強度衰減。但由于ThT的加入，誘導更多的G07序列折疊為G-三鏈體結構，從而在2-3 min時，ThT熒光強度形成了一個短暫的平衡狀態(tài)，所以ThT熒光強度會在2-3 min時出現(xiàn)一個穩(wěn)定期。加入ThT以后，要在2-3 min內完成ThT熒光測定，以確保避免同時測量多個孔時，因ThT熒光強度快速衰減造成的誤差。

熒光生物傳感器最近經常被用于四環(huán)素的檢測，其中 5-羧基熒光素（fluorescein amidite，F(xiàn)AM）［23］、Cy3［24］、Cy5［25］等作為熒光基團，通常被用于標記型生物傳感器的開發(fā)，來作為熒光信號的輸出，但標記型熒光傳感器在標記過程中通常都特別繁瑣，而且標記過程也非常耗時耗力，不利于目標物質的快速檢測。本方法以熒光素ThT作為熒光信號輸出，無需復雜的標記過程，應用于試劑盒以后在25 min內即可對四環(huán)素的檢測。

Khaled 等［26］建立了全自動固相微萃取法用于四環(huán)素的檢測，但此方法檢測限為 10 μg/kg；De Faria等［27］建立了一種使用鹽酸沉降蛋白后分離上清液，注入柱交換系統(tǒng)，上清液流經含限制性碳納米管的萃取柱，借助六通閥實現(xiàn)轉換管路，并使用梯度流動相凈化萃取柱后洗脫檢測的方法，此方法檢測限為 9.22-13.20 μg/L ；Zhao 等［28］合成了新型HLB 柱填料 CTPCC-TP，這種方法檢測限為8.0-16.8 μg/kg。噻唑橙（TO）熒光探針能夠與四環(huán)素G-四鏈體適配體結合，嵌入到四環(huán)素適配體中，2018年 Sun 等［29］利用TO建立了一種靈敏、快速、無標記的四環(huán)素熒光適配體傳感器，此方法檢測限為29 μg/L。2020年 Dai等［30］基于四環(huán)素適配體的 G-四鏈結構和ThT，研制了一種用于四環(huán)素快速檢測的無標記熒光適配體傳感器，此方法檢測限為0.44 μg/L。本文開發(fā)的以ThT熒光強度為信號輸出，通過G-三鏈體與四環(huán)素適配體競爭結合實現(xiàn)G-三鏈體內劈裂的方法用于四環(huán)素的檢測，檢測限低至0.03 μg/L。

G3-Apt1方法的檢測無需大型儀器，操作簡便，并且引物無需任何修飾，成本低廉，符合快速檢測以及商業(yè)化的應用，有望推廣于其他藥物及生物分子的檢測，對鹽酸四環(huán)素有很好的特異性，具有檢測鹽酸四環(huán)素的潛力。

4 結論

成功構建了基于G- 三鏈體的雙鏈競爭內劈裂可視化核酸傳感器定量檢測四環(huán)素。檢測范圍為1 nmol/L-1 μmol/L，R2達到0.99以上，檢測限低至0.07 nmol/L，并且在25 min內可以完成檢測，選擇了鹽酸四環(huán)素、土霉素、氯霉素、鏈霉親和素、林可霉素與傳感器反應，發(fā)現(xiàn)該方案特異性良好，并且還具有檢測鹽酸四環(huán)素的潛力。