煙草NtCBT基因啟動(dòng)子酵母單雜誘餌載體構(gòu)建及互作蛋白篩選

余婧 楊慧 余世洲 趙會(huì)納 鄭慶霞 王兵 雷波

（1.貴州省煙草科學(xué)研究院 煙草行業(yè)煙草分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550081；2.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州 450001）

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）是一類(lèi)能特異識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子順式作用元件的蛋白質(zhì)，可調(diào)控靶基因以特定的強(qiáng)度在不同時(shí)間或空間表達(dá)［1-3］。煙草類(lèi)西柏烷是一類(lèi)在煙草分泌型腺毛中特異合成及分泌的代謝物，主要為α-和β-西柏三烯二醇［4-5］，研究表明西柏三烯二醇具有抗病毒、神經(jīng)保護(hù)等作用，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值［5-6］。此外，栽培煙草經(jīng)調(diào)制、陳化后，類(lèi)西柏烷則進(jìn)一步降解為茄酮等與煙草香氣密切相關(guān)的物質(zhì)［4-5，7］。煙草類(lèi)西柏烷的生物合成主要包括兩個(gè)步驟：（1）前體物質(zhì)牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，由GGPP基因編碼）在西柏三烯一醇合酶（cembratrienol synthase，由CBT基因編碼）的催化下環(huán)化，生成α-和β-西柏三烯一醇［8-9］；（2）在細(xì)胞色素P450加氧酶（cytochrome P450 hydroxylase，由CYP71D16基因編碼）催化下，α-和β-西柏三烯一醇氧化生成α-和β-西柏三烯二醇［9-10］。雖然煙草類(lèi)西柏烷生物合成途徑及相關(guān)結(jié)構(gòu)酶基因已較為清楚，但有關(guān)分子調(diào)控機(jī)制的報(bào)道較少。

酵母單雜交（yeast one-hybrid，Y1H）是一項(xiàng)在酵母細(xì)胞內(nèi)研究蛋白與核酸相互作用的技術(shù)，可通過(guò)酵母cDNA文庫(kù)的篩選，獲得與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白質(zhì)［11-13］，科研人員已采用該技術(shù)經(jīng)識(shí)別并鑒定出許多與目的核酸序列相結(jié)合的蛋白質(zhì)，余玉珍等［14］通過(guò)酵母單雜技術(shù)獲得了與甲基酶編碼基因（CYP82E4）啟動(dòng)子相結(jié)合的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，推測(cè)該蛋白通過(guò)調(diào)控CYP82E4的表達(dá)，進(jìn)而影響煙草去甲基煙堿的合成。宋國(guó)琦等［15］構(gòu)建了擬南芥球形胚時(shí)期種子的酵母文庫(kù)，并從中篩選到與胚柄特異基因G564啟動(dòng)子相結(jié)合的22個(gè)結(jié)合蛋白。Spyropoulou等［16］為了鑒定番茄腺毛中調(diào)控萜烯生物合成的蛋白，將芳樟醇合成酶基因（SlTPS5）啟動(dòng)子構(gòu)建誘餌載體，并從番茄腺毛cDNA酵母文庫(kù)中篩選到與SlTPS5啟動(dòng)子互作的轉(zhuǎn)錄因子SlEOT1。

為篩選與NtCBT基因啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，解析煙草類(lèi)西柏烷生物合成的分子調(diào)控機(jī)制，從栽培煙草K326基因組中克隆NtCBT基因的啟動(dòng)子序列［17］，并將啟動(dòng)子區(qū)域-612 - 0 bp、-499 - 0 bp序列構(gòu)建誘餌載體進(jìn)行酵母單雜自激活實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，二段序列均存在自激活現(xiàn)象（本研究未展示），不能進(jìn)行下一步的酵母單雜篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)。為篩選出與NtCBT基因啟動(dòng)子相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，本實(shí)驗(yàn)將該基因起始密碼子ATG 5′端上游-929 - +10 bp區(qū)域進(jìn)一步截為6個(gè)片段分別進(jìn)行自激活實(shí)驗(yàn)，并將沒(méi)有自激活的區(qū)域之一：P5（-279 - -119 bp）作為誘餌載體，從煙草腺毛cDNA文庫(kù)中篩選與NtCBT基因啟動(dòng)子互作的結(jié)合蛋白，旨在為進(jìn)一步挖掘及鑒定煙草類(lèi)西柏烷合成途徑的調(diào)控基因、解析其合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 栽培煙草K326（Nicotiana tabacum L.）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 酵母單雜交試劑盒Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System、Y1H Gold酵母菌、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒Yeastmaker Yeast Tranformation System 2、酵母培養(yǎng)基、金擔(dān)子素（aureobasidinA，AbA）、酵母菌落PCR檢測(cè)試劑盒Matchmaker Insert Check PCR Mix 1購(gòu)自美國(guó)Clontech公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶BstB I購(gòu)自美國(guó)NEB公司；煙草腺毛cDNA酵母文庫(kù)于本實(shí)驗(yàn)室保存，文庫(kù)庫(kù)容為2.6×106CFU；引物、基因合成及測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.3 啟動(dòng)子順式作用元件分析 采用在線網(wǎng)站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）、PlantPAN3.0（http://plantpan.itps.ncku.edu.tw/）預(yù)測(cè)NtCBT基因啟動(dòng)子中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 motif。

1.2 方法

1.2.1 pBait-AbAi重組誘餌載體構(gòu)建 將NtCBT基因啟動(dòng)子-929 - 10 bp分為6 個(gè)區(qū)域（P1 ：-929 --750 bp，P2 ：-769 - -590 bp ，P3 ：-609 - -430 bp，P4 ：-449 - -270 bp，P5 ：-279 - -119 bp，P6 ：-129 -10 bp），通過(guò)基因合成的方法，將目的片段構(gòu)建成3個(gè)串聯(lián)重復(fù)，連接至酵母單雜誘餌載體pBait-AbAi，并將重組誘餌載體pAbAi-Px分別命名為 ：pAbAi-P1、pAbAi-P2、pAbAi-P3、pAbAi-P4、pAbAi-P5、pAbAi-P6。

1.2.2 誘餌載體線性化及轉(zhuǎn)化酵母Y1H Gold 參照Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System說(shuō)明書(shū)中的方法，采用內(nèi)切酶BstB I分別將6個(gè)pAbAi-Px重組質(zhì)粒單酶切線性化，將1 μg線性化后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Y(jié)1H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布SD/-Ura固體平板，30℃培養(yǎng)3-5 d后挑取單菌落，采用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1試劑盒進(jìn)行PCR菌落反應(yīng)，若擴(kuò)增出一段約1.35 kb+X的片段，表明誘餌質(zhì)粒成功整合到酵母Y1H Gold基因組中，即為誘餌菌株Y1H［pAbAi-Px］。

1.2.3 重組誘餌載體對(duì)AbA的敏感性 從SD/-Ura平板上挑取整合成功的酵母單菌落，用0.9% NaCl溶液懸浮菌落并將OD600調(diào)至0.002（即每100 μL中包含2 000個(gè)細(xì)胞），各取100 μL菌液涂布以下培養(yǎng)基：SD/-Ura、SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）、SD/-Ura/AbA（500 ng/mL）、SD/-Ura/AbA（800 ng/mL）、SD/-Ura/AbA（1 000 ng/mL），30℃培養(yǎng) 3-5 d后觀察酵母菌落的生長(zhǎng)情況，以確定各重組誘餌載體對(duì)AbA的敏感性。

1.2.4 酵母單雜交cDNA文庫(kù)篩選 取煙草腺毛cDNA酵母文庫(kù)質(zhì)粒10 μg，按照Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酵母單雜篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)。在質(zhì)粒導(dǎo)入酵母誘餌菌株后，取轉(zhuǎn)化后的重懸菌液150 μL，涂布到含有相應(yīng)濃度AbA的SD/-Leu固體平板，30℃培養(yǎng)3-5 d，此時(shí)單克隆大小為1-2 mm，初篩完成；將初篩平板上長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移到相同的篩選培養(yǎng)基，進(jìn)行二次篩選。30℃培養(yǎng)3-5 d后，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物送生物公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 pAbAi-Px重組誘餌載體自激活

采用BstB I將重組誘餌載體pAbAi-Px單酶切線性化，電泳結(jié)果如圖1所示，酶切成功的質(zhì)粒電泳呈單一條帶，且條帶比未酶切的質(zhì)粒條帶略大，說(shuō)明6個(gè)載體均成功線性化。將線性化載體轉(zhuǎn)化Y1H Gold酵母菌感受態(tài)，鑒定為陽(yáng)性后，取菌液涂布到含有相應(yīng)濃度AbA的SD/-Ura平板，5個(gè)誘餌菌株Y1H［pAbAi-P1］-Y1H［pAbAi-P5］在 含 有 SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）的培養(yǎng)基上均不能正常生長(zhǎng)（圖2），說(shuō)明這5個(gè)誘餌菌株對(duì)AbA的敏感性為200 ng/mL。而對(duì)于Y1H［pAbAi-P6］誘餌菌株，當(dāng)AbA濃度加至1 000 ng/mL時(shí)，仍不能抑制住酵母的生長(zhǎng)（圖3）。重組誘餌載體pAbAi-P1-P5在200 ng/mL AbA的存在下無(wú)自激活，可采用這5個(gè)載體進(jìn)行下一步的酵母單雜篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)；而Y1H［pAbAi-P6］誘餌菌株在含有1 000 ng/mL AbA的SD/-Ura平板上仍能生長(zhǎng)，說(shuō)明pAbAi-P6存在著強(qiáng)烈的自激活，不能用作酵母單雜篩庫(kù)的誘餌載體。

圖1 重組誘餌載體pAbAi-Px線性化Fig.1 Linearization of recombinant bait vector pAbAi-Px

圖2 pAbAi-Px誘餌載體自激活Fig.2 Self-activation of pAbAi-Px bait vector

圖3 pAbAi-P6誘餌載體自激活Fig.3 Self-activation of pAbAi-P6 bait vector

2.2 P5區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif預(yù)測(cè)及pAbAi-P5重組誘餌載體PCR鑒定

選取構(gòu)建好的pAbAi-P5誘餌載體做進(jìn)一步的酵母單雜篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)，首先預(yù)測(cè)P5區(qū)域中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif，結(jié)果如圖4所示，PlantCARE及Plant-PAN3.0均預(yù)測(cè)到P5區(qū)域中存在一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的核心motif：CAGTTA；另外，PlantPAN3.0還預(yù)測(cè)到P5區(qū)域中存在著AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif：AGCTA、ATTTA；bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif：ATGCGTGG、ATACGATT；以及HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif：CAATTATAG。按照2.1中的實(shí)驗(yàn)，從SD/-Ura平板上挑取生長(zhǎng)健康的Y1H［pAbAi-P5］單菌落，使用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1試劑盒進(jìn)行PCR菌落反應(yīng)，如圖5所示，擴(kuò)增獲得一段約1.84 kb（1.35 kb+0.49 kb）片段，表明誘餌載體成功轉(zhuǎn)入酵母基因組，可以進(jìn)行下一步的酵母單雜篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 酵母單雜交cDNA文庫(kù)篩選

將Y1H［pAbAi-P5］作為誘餌菌株，在煙草腺毛cDNA酵母文庫(kù)中篩選與NtCBT基因啟動(dòng)子P5區(qū)域互作的結(jié)合蛋白。在SD/-Leu/AbA（200 ng/mL）平板的初篩中，共獲得50個(gè)1-2 mm的陽(yáng)性酵母菌落（圖6，展示部分菌落），將這50個(gè)陽(yáng)性克隆在相同培養(yǎng)基上進(jìn)行二次點(diǎn)種篩選，最終獲得49個(gè)陽(yáng)性克?。▓D7）。提取陽(yáng)性克隆的酵母質(zhì)粒，使用通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，部分PCR結(jié)果如圖8所示，其片段長(zhǎng)度在400-2 500 bp之間，隨后將PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序。

圖6 NtCBT基因啟動(dòng)子P5區(qū)域結(jié)合蛋白的初篩Fig.6 Preliminary screening of binding protein interacting with P5 regions of NtCBT promoter

圖7 NtCBT基因啟動(dòng)子P5區(qū)域結(jié)合蛋白的二次篩選Fig.7 Secondary screening of binding protein interacting with P5 regions of NtCBT promoter

圖8 部分陽(yáng)性菌落的PCR檢測(cè)Fig.8 Identification of partial positive colonies by PCR

2.4 陽(yáng)性克隆測(cè)序和分析

將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，ID為XP_016475182.1的蛋白在陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果中出現(xiàn)9次，該蛋白注釋為BURP domain protein RD22-like isoform X1；ID為 XP_019247962.1的蛋白出現(xiàn)7次，注釋為功能未知的蛋白。去掉多余及重復(fù)的基因，共獲得35個(gè)可能與NtCBT基因啟動(dòng)子P5區(qū)域結(jié)合的蛋白，包括XP_009798273.1、XP_009780978.1等5個(gè)功能未知的蛋白，以及注釋 為 calcineurin B-like protein 10、protein BPS1，chloroplastic-like、GDP-L-galactose phosphorylase 1-like等27個(gè)蛋白。另外，還篩選到3個(gè)推定的轉(zhuǎn)錄因子，分別為HD-ZIP蛋白家族的ANL2（homeobox-leucine zipper protein ANTHOCYANINLESS 2-like isoform X2，XP_009602857.1）、ML1（homeobox-leucine zipper protein MERISTEM L1-like，XP_009799795.1） 以 及NF-Y蛋白家族的NF-YA3（nuclear transcription factor Y subunit A-3-lik，XP_016441195.1），這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能與NtCBT基因啟動(dòng)子的P5區(qū)域存在著潛在的結(jié)合關(guān)系。

3 討論

通過(guò)酵母單雜交cDNA文庫(kù)篩選通常可獲得與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步分析獲得候選轉(zhuǎn)錄因子［11］。對(duì)煙草類(lèi)西柏烷生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)酶基因CBT、CYP71D16已有廣泛的研究［5，9-10］，然而，有關(guān)該途徑的調(diào)控基因及分子調(diào)控機(jī)制研究較少，為了獲得調(diào)控?zé)煵蓊?lèi)西柏烷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子，將NtCBT基因啟動(dòng)子截為6個(gè)區(qū)域并分別進(jìn)行酵母單雜誘餌載體自激活實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，除P6區(qū)域外，另外5個(gè)區(qū)域（P1-P5）在SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）平板中均無(wú)自激活現(xiàn)象。根據(jù)Ennajdaoui等［9］在林煙草中的實(shí)驗(yàn)，CBT基因啟動(dòng)子中的P5區(qū)域（-279 - -119 bp）是決定CBT基因在煙草腺毛特異表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)域，但與之結(jié)合的蛋白未知，因此，選擇P5區(qū)域進(jìn)行酵母單雜篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)篩選，獲得3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分別是HD-ZIP以及NF-Y蛋白家族成員。在對(duì)NtCBT基因啟動(dòng)子P5區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif進(jìn)行分析時(shí)，預(yù)測(cè)到MYB、AP2/ERF、bHLH、HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)CAGTTA、AGCTA、ATGCGTGG、CAATTATAG 等motif結(jié)合到P5區(qū)域上，然而，在我們的篩庫(kù)結(jié)果中，僅篩到了HD-ZIP蛋白成員，以及一個(gè)沒(méi)有預(yù)測(cè)到的NF-Y蛋白，轉(zhuǎn)錄因子MYB、AP2/ERF及bHLH在本次篩庫(kù)中沒(méi)有篩到，這可能是在酵母單雜篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)中，存在著一定程度上的漏篩［3］。另外，在我們的實(shí)驗(yàn)中，NtCBT基因啟動(dòng)子的P1-P4四個(gè)區(qū)域在SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）平板上均無(wú)自激活現(xiàn)象，進(jìn)一步可將這4個(gè)誘餌載體從文庫(kù)中篩選與NtCBT基因啟動(dòng)子相結(jié)合的其它轉(zhuǎn)錄因子。

M：Marker；泳道1，2：菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M：Marker.Lane 1 and 2：PCR-amplified products

本次篩庫(kù)獲得的ANL2、ML1蛋白均屬于HDZIP轉(zhuǎn)錄因子的IV亞家族成員，主要參與表皮細(xì)胞分化、角質(zhì)的生物合成、表皮細(xì)胞花青素積累，如擬南芥ANL2基因跟表皮層中花青素的組織特異性積累有關(guān)［18］，番茄的CD2是ANL2的同源基因，參與表皮角質(zhì)層蠟的生物合成［19］；棉花GbML1基因在擬南芥中表達(dá)后影響表皮毛的數(shù)量及花青素的積累［20］。NF-YA3屬于NF-Y轉(zhuǎn)錄因子的NF-YA亞家族成員［21］，參與植物開(kāi)花的分子調(diào)控［22］、果實(shí)成熟及糖分積累［23-24］、以及響應(yīng)生物及非生物脅迫等生物學(xué)功能［21］。然而，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道說(shuō)明這些轉(zhuǎn)錄因子是否參與了煙草類(lèi)西柏烷合成的表達(dá)調(diào)控。鑒于篩庫(kù)結(jié)果，推測(cè)3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子ANL2、ML1、NF-YA3可能與NtCBT基因啟動(dòng)子相結(jié)合，調(diào)控NtCBT基因的表達(dá)，進(jìn)而參與煙草類(lèi)西柏烷的生物合成，下一步需要過(guò)表達(dá)、干涉表達(dá)等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其功能。

4 結(jié)論

通過(guò)煙草腺毛單雜交cDNA文庫(kù)篩選，獲得3個(gè)與NtCBT基因啟動(dòng)子P5區(qū)域相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，分別是HD-ZIP蛋白家族的ANL2、ML1以及NF-Y蛋白家族的NF-YA3，這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)調(diào)控?zé)煵軳tCBT基因的表達(dá)進(jìn)而參與類(lèi)西柏烷的生物合成過(guò)程。