一株高效溶磷細(xì)菌的條件優(yōu)化及其溶磷特性研究

李思思 張博源 符運會 周佳 屈建航

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

磷是植物細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)和結(jié)構(gòu)的組成元素，對促進(jìn)植株的生長發(fā)育和新陳代謝發(fā)揮著重要作用［1］。在植物吸收利用的磷元素中，95%以上是可溶性無機(jī)磷；但在土壤生態(tài)環(huán)境中，大部分的磷與金屬陽離子結(jié)合，以難溶性無機(jī)磷或有機(jī)磷的無效磷形式存在，導(dǎo)致植物難以直接吸收利用［2-4］。第二次全國各地土壤普查以及相關(guān)資料可知，在中堿性土壤中速效磷含量低于5 mg/kg 以及酸性土壤中低于16 mg/kg 時，土壤則處于缺磷狀態(tài)［5］。相關(guān)統(tǒng)計顯示，全世界約有43%的耕地土壤缺乏能被植物直接吸收利用的有效磷，我國缺乏有效磷的耕地土壤更是占我國總耕地的70%以上［6］。為了保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，通常會向土壤中施加可溶性磷肥來滿足作物對磷素的需求，但長期施肥會降低土壤對磷的吸附量，加大磷素在深層土壤的遷移，增加土壤磷滲漏率，造成水體富營養(yǎng)化等風(fēng)險；不合理的使用磷肥也會引發(fā)土壤生態(tài)惡化［7］、有機(jī)質(zhì)減少、微生物區(qū)系改變等問題，嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展［8］，造成農(nóng)業(yè)面源污染，進(jìn)一步加重土壤礦質(zhì)化污染［9］。同時，磷是一種不可再生資源，而大部分磷肥開采自磷酸鹽巖，按照目前的開采速度，全球的磷酸鹽巖將于50-100年內(nèi)消耗殆盡［10-13］。因此，如何能夠高效利用土壤中的難溶性磷是降低磷肥使用量和提高作物磷元素利用率的關(guān)鍵，是我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中所急需解決的問題之一。

溶磷菌在土壤磷循環(huán)中起著舉足輕重的作用，通過溶解難溶性磷酸鹽來提高植物的有效磷庫，提高磷元素利用率，減少磷肥施用量［14］。近年來溶磷菌劑逐漸成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的新型肥料，而高效溶磷菌的篩選和應(yīng)用，是當(dāng)今土壤微生物資源開發(fā)研究的熱點。在所報道的溶磷菌中，假單胞菌屬是降解難溶性磷源的優(yōu)選菌種之一，典型代表有銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）等。胡珊等［15］從中藥渣堆肥中篩選出一株對卵磷脂具有較強(qiáng)溶解效果的銅綠假單胞菌；朱夢卓等［16］從野大豆中分離出一株假單胞菌YDX26，該菌株可以溶解磷酸鈣，通過提高酶活等促進(jìn)水稻生長；沈佳佳等［17］在油用牡丹根際篩選出的假單胞菌FD4-13，對植酸鈣具有較強(qiáng)的溶解能力。不同假單胞菌溶解能力有一定差異，且于土壤中的應(yīng)用研究報道較少，高效溶磷菌種的篩選和性能考察仍是當(dāng)前研究的重要內(nèi)容之一。本研究以從湖泊沉積物中篩選出的高效溶磷菌1616X1 為研究對象，優(yōu)化和研究其溶磷特性；明確其在土壤中的定殖和溶磷能力，為該菌在微生物肥料方面的開發(fā)及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 細(xì)菌1616X1 是本實驗室從湖泊沉積物中分離篩選獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.00，酵 母 粉5.00，NaCl 10.00，pH 7.0-7.2，121℃ 滅菌20 min［18］。NBRIP（National Botanical Research Institute’s Phosphate）培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.00，MgCl2·6H2O 5.00，MgSO4·7H2O 0.25，KC1 0.20，（NH4）2SO40.10，Ca3（PO4）25.00，pH 7.0，115℃滅菌30 min［19］。

1.2 方法

1.2.1 菌種鑒定 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化測定，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》［20］和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［21］。采用SDS-堿裂解法提取細(xì)菌DNA，利用通用引物27F 和1492R 進(jìn)行16S rRNA 基因PCR擴(kuò)增［22］，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測并進(jìn)行核苷酸序列測定，所得序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對比，利用MEGA7.0 軟件鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取比色管，分別加入2 mg/L KH2PO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.25、0.50、1.50、2.50、5.00、7.50 mL，定容至25 mL；加入4 mL 鉬銻抗顯色液，混勻，靜置15 min 后測定880 nm 吸光值。以磷濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線［23］。

1.2.3 溶磷曲線 將1616X1 單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，28℃、150 r/min 培養(yǎng)12 h，種子液離心，用無菌水將菌株1616X1 種子液制備成OD600為1 的菌懸液，以5%（V/V）接種于NBRIP 液體培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min 搖床培養(yǎng)，每24 h 取樣，8 000 r/min離心10 min，鉬銻抗比色法測定上清液中可溶性磷濃度［24］。

1.2.4 溶磷條件優(yōu)化

（1）單因素試驗 培養(yǎng)基組分優(yōu)化：采用不同碳源（葡萄糖、蔗糖、檸檬酸鈉、乙酸鈉、可溶性淀粉、麥芽糖、果糖）代替NBRIP 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源，通過鉬銻抗比色法測定上清液中的有效磷含量。改變最佳碳源濃度（2.5、5、10、15、20、30 g/L）進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)以確定最佳碳源濃度［25］。最佳氮源（尿素、硝酸鉀、氯化銨、蛋白胨、硫酸銨）及最適氮源濃度（0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.40 g/L）的確定采用相同方式［18，26］。培養(yǎng)條件優(yōu)化：在其他條件不變的情況下，分別改變培養(yǎng)液的pH（4、5、6、7、8、9）、裝液量（50、75、100、125、150 mL）、接種量（1%、3%、5%、7%、10%）、培養(yǎng)溫度（20、24、28、32、37℃），以上清液中可溶性磷含量最高的條件為最適［4］。

（2）響應(yīng)面法優(yōu)化 通過SAS 9.2 對單因素進(jìn)行顯著性分析，采用Design Expert 12 對顯著影響溶磷菌溶磷的氮源濃度（A）、溫度（B）和pH（C）進(jìn)行編碼，以溶磷量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗設(shè)計響應(yīng)面試驗。試驗因素的設(shè)計水平及編碼見表1。實驗結(jié)果利用Design Expert 12 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用各因子兩兩交互響應(yīng)面，等高線以及響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行優(yōu)化，找出1616X1 的最大溶磷量對應(yīng)各因子的最優(yōu)值，并進(jìn)行驗證試驗。

表1 響應(yīng)面試驗的因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 土壤培養(yǎng)試驗 供試土壤取自校園周邊菜地以及某宿舍樓花圃（34°83′N，113°55′E），使用表層以下5-10 cm 土壤，土質(zhì)黃褐色，其中菜地土壤pH 7.94，全磷含量13.85 mg/kg，速效磷4.53 mg/kg；花圃土壤pH 7.93，全磷含量26.74 mg/kg，速效磷含量4.2 mg/kg。自然風(fēng)干后過20 目篩，250 mL 三角瓶分裝100 g 土壤，121℃ 30 min，間歇滅菌3 次，滅菌土壤加入1%（V/W）葡萄糖，接種2 mL 1616X1 菌懸液（接種后的起始濃度為4×107CFU/g），同時以加入等量無菌水的處理作為對照，土壤濕度40%，每個處理設(shè)置平行，28℃恒溫培養(yǎng)，分別在0、1、3、5、8、12、17、23 d 采樣［27-30］，以LB 固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，采用稀釋涂布平板法測定菌株1616X1 的定殖情況，利用NaHCO3浸提法和pH 計測定土壤速效磷含量以及pH 值［5，31-32］。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SAS 9.2 軟件［33］進(jìn)行顯著性分析，Origin 9.0 軟件［34］作圖，Design-Expert 12.0 軟件［35］進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化及回歸方程方差分析。

2 結(jié)果

2.1 菌種鑒定結(jié)果

細(xì)菌1616X1 為革蘭氏陰性菌，桿狀，菌落白色圓形，接觸酶、氧化酶、熒光反應(yīng)、硝酸鹽還原、脲酶反應(yīng)陽性，淀粉水解、明膠水解反應(yīng)陰性，在0-5% NaCl 條件下生長，在pH 5-9 之間生長。

將菌株1616X1 的16S rRNA 的基因序列（登錄號：MK041527.1） 輸入GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對，分析結(jié)果表明，菌株1616X1 與Pseudomonas putidaNBRC 14164（NR 113651.1） 的相似度99.37%，利用MEGA7.0 鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），聚集在一起。根據(jù)菌落形態(tài)及生理生化特征，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定菌株1616X1為假單胞菌（Pseudomonassp.）。

圖1 菌株1616X1 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain 1616X1 based on 16S rRNA sequences

2.2 溶磷曲線

在NBRIP 培養(yǎng)基中接種菌株1616X1，每24 h測試發(fā)酵液中的可溶性磷含量及pH 值，其結(jié)果如圖2所示。

由圖2-a 可知，在0-96 h，1616X1 的溶磷量不斷增加，在96 h 時，溶磷量達(dá)到最大值，為568.76 mg/L，隨后開始下降；pH 在96 h 時達(dá)到最低3.85。由圖2-b Pearson 相關(guān)性分析可知，菌株1616X1 溶磷量與pH 值之間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.976，P＜0.01），同時結(jié)合圖2-a，發(fā)酵液中pH 值隨溶磷量的上升而下降，可能是溶磷菌在發(fā)揮作用時分泌出某些酸性物質(zhì)所致。

圖2 1616X1 溶磷曲線及溶磷量與pH 相關(guān)性分析Fig.2 1616X1 phosphate-dissolving curve and correlation analysis of solubilized phosphorus amount and pH

2.3 溶磷條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 碳源 將1616X1 菌接種于含有等質(zhì)量不同碳源的培養(yǎng)基中，探究碳源對1616X1 菌株溶磷能力的影響。由圖3-a 可知，當(dāng)葡萄糖為碳源時，1616X1溶磷量最高為585.67 mg/L，對應(yīng)pH 為4.24；將葡萄糖用相同質(zhì)量的其他碳源替換后，溶磷量均顯著降低，說明菌株1616X1 對其他碳源的利用力差，以葡萄糖為最佳碳源。進(jìn)一步對葡萄糖濃度進(jìn)行優(yōu)化，由圖3-b 可知，當(dāng)葡萄糖濃度為2.50-5.00 g/L 時，由于碳源不足而導(dǎo)致菌體量較少，溶磷量低，最終pH 相比于其他梯度較高；而葡萄糖濃度在10-30 g/L范圍時溶磷量與濃度為10 g/L 時結(jié)果無顯著性差異，發(fā)酵液中最終pH 也無明顯變化，選取葡萄糖濃度10 g/L 作為最佳碳源濃度。

圖3 碳源種類和濃度對1616X1 溶磷能力的影響Fig.3 Effects of carbon source type and concentration on the phosphate-dissolving ability of 1616X1

2.3.2 氮源 氮是細(xì)菌細(xì)胞中核酸與蛋白質(zhì)的重要組成部分，在菌株生長代謝過程中不可或缺。氮源對1616X1 溶磷能力的影響如圖4-a 所示，在以硫酸銨和氯化銨為氮源時，溶磷量分別為576.38 mg/L 和575.45 mg/L，與其他氮源物質(zhì)在溶磷能力之間存在顯著性差異（P＜0.01）；6 種氮源的溶磷體系pH 變化與對氮源的利用順序一致，pH 由低到高依次為硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀、蛋白胨、胰蛋白胨、尿素，在以硫酸銨為氮源時，pH 最低，為3.92，而以胰蛋白胨為氮源時，pH 最高，為4.12，進(jìn)一步說明溶磷量與pH 的負(fù)相關(guān)性，選擇硫酸銨為最佳氮源。將硫酸銨在0.025-0.40 g/L 范圍內(nèi)分為6 個濃度，結(jié)果如圖4-b 所示，其濃度為0.10 g/L 時菌株1616X1 溶磷量最高，為632.03 mg/L，故選取硫酸銨濃度為0.10 g/L 時作為最佳氮源濃度。

圖4 氮源種類和濃度對1616X1 溶磷能力的影響Fig.4 Effects of nitrogen source type and concentration on the phosphate-dissolving ability of 1616X1

2.3.3 溫度 從圖5可知，菌株在24℃培養(yǎng)時，溶磷量最高，為627.89 mg/L，溫度為37℃時，溶磷量最低為400.46 mg/L；當(dāng)發(fā)酵溫度高于或低于24℃時，菌株1616X1 的溶磷能力均有下降，并且差異顯著（P＜0.01），選取24℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖5 溫度對1616X1 溶磷能力的影響Fig.5 Effect of temperature on the ability of 1616X1 dissolving phosphate

2.3.4 初始pH 由圖6可知，菌株1616X1 在pH 4-9 的范圍內(nèi)具有較好的溶磷能力；當(dāng)初始pH 在4-6時，溶磷量較高，差異不顯著（P＞0.05）；pH 為6 時，溶磷量最高，為619.03 mg/L；pH 9 時，溶磷量最低，為532.19 mg/L，原因可能是體系中堿性較強(qiáng)，溶磷菌分泌的有機(jī)酸有限，影響了溶磷效果，故選取pH為6 時為最佳初始pH。

圖6 初始pH 對1616X1 溶磷能力的影響Fig.6 Effects of initial pH on the ability of 1616X1 dissolving phosphate

2.3.5 接種量 如圖7所示，接種量為5%時，溶磷量最高，為637.45 mg/L；接種量為10%時，溶磷量最低，為585.02 mg/L；接種量高時，雖然能夠縮短菌株生長周期，充分利用養(yǎng)分，但菌株生長繁殖時也會產(chǎn)生對菌株具有抑制作用的代謝物，從而影響菌株的溶磷量。經(jīng)顯著性分析，接種量在1%-7%之間時，菌株1616X1 溶磷差異不顯著（P＞0.05），接種量為5%是菌株1616X1 溶磷的最佳接種量。

圖7 接種量對1616X1 溶磷能力的影響Fig.7 Effect of inoculum quantity on the phosphate-dissolving ability of 1616X1

2.3.6 裝液量 如圖8所示，裝液量為75 mL/250 mL 時，溶磷量最高，為606.72 mg/L，當(dāng)裝液量為150 mL/250 mL，溶磷量為585.02 mg/L；經(jīng)方差分析和顯著性檢驗表明，裝液量對菌株1616X1 的溶磷差異不顯著（P＞0.05），故選擇75 mL/250 mL 為最佳裝液量。

圖8 裝液量對1616X1 溶磷能力的影響Fig.8 Effect of liquid loading on the ability of 1616X1 dissolving phosphate

2.4 方差分析

在單因素實驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行方差分析來確定各因素對1616X1 溶磷量的影響，方差分析結(jié)果如表2所示。葡萄糖濃度、硫酸銨濃度、溫度、初始pH均對1616X1 溶磷產(chǎn)生極顯著影響，結(jié)合單因素分析結(jié)果，最終選擇硫酸銨濃度、pH、溫度3 個因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果如表3。其中，A 為硫酸銨濃度，B 為pH，C 為溫度，Y 為溶磷量。對其進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到響應(yīng)值為菌株1616X1 溶磷量的回歸方程：

表3 Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Box-Behnken experiment design and results

Y=674.29+40.70*A+4.38*B-0.7514*C-21.04*AB-20.79*AC+1.75*BC-66.83*A2-8.22*B2-18.49*C2

對此方程進(jìn)行方差分析：此回歸模型的F=18.45，P＜0.01，差異極顯著，并且失擬項P=0.34＞0.05，不顯著。模型的R2=0.959 5，AdjR2=0.907 5，說明實際值與預(yù)測值擬合度較好，該模型可以用來分析和預(yù)測菌株1616X1 的最佳溶磷條件。由表4可知，三因素對菌株1616X1 溶磷能力的影響從大到小依次為硫酸銨濃度＞pH＞溫度。由其二次項顯著性分析可知，A2、C2對1616X1 溶磷能力有顯著影響；交互相中AB、AC 的P＜0.05，對1616X1 溶磷能力影響顯著，而BC 的P＞0.05，說明兩者交互作用對溶磷量無顯著性影響。

表4 二次模擬的方差分析Table 4 Analysis of variance in quadratic model

2.5.2 響應(yīng)面交互作用分析 通過Design Expert 12軟件，得到三因素交互作用的響應(yīng)面和等高線見圖9。在氮源濃度與pH 的響應(yīng)面中，氮源濃度的傾斜度大于pH，說明在兩者交互作用中，氮源濃度對1616X1 溶磷能力的影響大于pH，而等高線稀疏并呈現(xiàn)橢圓狀，表明硫酸銨濃度與pH 兩因素之間交互作用顯著；同理，在氮源濃度與溫度的響應(yīng)面中，在交互作用中，氮源濃度的影響大于溫度，兩個因素交互作用顯著；而pH 與溫度的響應(yīng)曲面變化平緩，等高線密集，呈現(xiàn)微橢圓狀，說明兩因素交互作用不顯著。

圖9 各因素間對菌株1616X1 溶磷能力影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.9 Contour and response surface about the effects of two factors on the ability of strain 1616X1 dissolving phosphate

2.5.3 溶磷菌1616X1 最優(yōu)培養(yǎng)條件驗證結(jié)果 由上述響應(yīng)面與等高線圖可知，響應(yīng)值R 存在極大值，通過Design-Expert 12 對回歸模型分析得到菌株1616X1 溶磷最佳條件為：硫酸銨濃度為0.17 g/L，初始pH 5.70，溫度為23.3℃時，預(yù)測理論響應(yīng)值為681.24 mg/L。為了方便實際操作，將上述培養(yǎng)條件調(diào)整為硫酸銨濃度0.17 g/L，初始pH 為5.70，溫度為23.3℃，按此條件進(jìn)行試驗，重復(fù)3 次取平均值，測得溶磷量為684.92 mg/L，與預(yù)測值相近，說明此模型具有較好的可信度，可用于后續(xù)研究。

2.6 限菌條件下土壤速效磷、pH和溶磷菌1616X1定殖變化

2.6.1 細(xì)菌1616X1 在土壤中的定殖情況 菌株在土壤中的定殖情況影響菌株在土壤中的溶磷作用，一般而言，溶磷菌在土壤中的定殖能力越強(qiáng)，代謝分泌物越多，其功能就越顯著。菌株1616X1 在土壤中的定殖情況如圖10。將細(xì)菌1616X1 接種到菜地土壤中，培養(yǎng)到第3 天時，菌落數(shù)達(dá)到最大，為3.65×108CFU/g，之后開始逐漸下降，在第23 天時，菌落數(shù)低于初始濃度；在花圃土壤中，1616X1 接入土壤之后，培養(yǎng)到第5 天時，菌落數(shù)達(dá)到3.15×108CFU/g，雖然在之后的培養(yǎng)時間內(nèi)菌落數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢，但在23 d 時，其菌落數(shù)仍高于初始菌落數(shù)，為初始菌落數(shù)的2.13 倍。綜上所述，菌株1616X1 在土壤中能夠有很好的定殖能力。

圖10 細(xì)菌1616X1 在土壤中的定殖情況Fig.10 Colonization of bacteria 1616X1 in soil

2.6.2 細(xì)菌1616X1 對土壤速效磷含量及pH 變化的影響 由圖11可知，在限菌條件下，接種1616X1的土壤pH 值均低于對照組，且速效磷含量均高于對照組，可能是與溶磷菌在生長代謝過程中分泌有機(jī)酸和質(zhì)子有關(guān)。結(jié)果表明，溶磷菌1616X1 能夠降低菜地土壤的pH 值，在培養(yǎng)第1 天時，pH 明顯下降，同時也提高了土壤中的速效磷含量，在第3天達(dá)到最高值，為7.38 mg/kg，速效磷含量增加了62.52%；同時，在加入溶磷菌1616X1 的花圃土壤中，pH 值最低時比初始pH 值下降了0.60 個單位，在第5 天時，速效磷達(dá)到最大值，為8.08 mg/kg，比初始速效磷含量增加了92.08%。綜上所述，在接種了1616X1 的兩種土壤中，速效磷含量顯著高于對照組，說明細(xì)菌1616X1 在土壤中具有較好的溶磷效果。

圖11 細(xì)菌1616X1 對土壤速效磷含量以及pH 的影響Fig.11 Effects of bacterium 1616X1 on soil available phosphorus content and pH

3 討論

溶磷菌在土壤磷循環(huán)過程中起著不可忽視的作用。目前國內(nèi)外報道的溶磷菌主要有假單胞菌屬（Pseudomonas）［2，16］、伯克霍爾德菌屬［36］（Burkholderia）、固氮菌屬（Azotobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）［1，18］、歐文氏菌屬（Erwinia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）［4，37］、根瘤菌屬（Bradyrhizobium）［38］、青霉屬（Penicillium）［9］、鏈霉菌屬（Streptomyces）等。本研究中的菌株1616X1，經(jīng)初步鑒定為Pseudomonassp.，并且菌株1616X1 在同屬中具有較好的溶磷優(yōu)勢。

不同的溶磷菌在溶磷能力方面存在差異，莊馥璐等［2］分離篩選得到的溶磷菌假單胞菌屬菌株P(guān)sbM10 在無機(jī)磷液體培養(yǎng)時，溶磷量最高達(dá)到104.12 mg/L；趙君等［4］分離的不動桿菌屬的菌株W1，溶磷量為238.08 mg/L；于淼等［23］研究的惡臭假單胞菌623-3 的溶磷量最高為371.25 mg/L。優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，不僅可以了解細(xì)菌在培養(yǎng)過程中的特性，還能夠提高菌株的存活率和功能酶活性［39］。在菌株的優(yōu)化研究中，通常會使用單因素試驗以及響應(yīng)面試驗對菌株的生長及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。韋宜慧等［25］分離的Burkholderia ubonensis菌株P(guān)5，經(jīng)優(yōu)化后的溶磷量為268.69 mg/L；陳言柳等［40］對一株油茶根際解磷菌NC285 進(jìn)行了培養(yǎng)條件優(yōu)化，優(yōu)化后溶磷量可達(dá)586.73 mg/L；陳容彬等［41］分離得到的伯克霍爾德菌菌株P(guān)B，經(jīng)優(yōu)化后的溶磷量為569.33 mg/L。本研究中的菌株1616X1 液體培養(yǎng)96 h 時，溶磷量可達(dá)到568.76 mg/L，優(yōu)化后溶磷量可以達(dá)到684.92 mg/L，與目前已報道出的菌株相比，1616X1 的溶磷能力有著顯著優(yōu)勢，為開發(fā)微生物肥料等提供了優(yōu)良的菌種資源。

對于溶磷菌的研究，國內(nèi)外已有較多相關(guān)研究，而大多數(shù)的溶磷細(xì)菌卻不能很好的適應(yīng)土壤環(huán)境，因此在實際應(yīng)用中受到了限制。在本研究中，將1616X1 菌液施加到菜地和花圃的土壤中，速效磷含量分別提高了62.52%和92.08%，在整個培養(yǎng)周期內(nèi)，實驗組中速效磷的含量均高于對照組，說明該菌在土壤中具有較好的溶磷活性；但隨著時間的延長，實驗組中的速效磷含量呈現(xiàn)下降的趨勢，該變化與何迪［29］和虞偉斌等［28］報道的結(jié)果相似，主要原因是土壤組成成分復(fù)雜，并且受金屬離子等多種因素的影響，所以溶出的速效磷會被再次固定；同時，隨著土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，有害物質(zhì)逐漸積累，導(dǎo)致1616X1 活性降低，從而導(dǎo)致速效磷含量降低。土壤中速效磷含量降低，是多種因素共同作用的結(jié)果，揭示各因素之間的相互關(guān)系，是后期研究的重點。有研究表明，微生物在土壤中的存活率受多種因素影響，如土壤環(huán)境變化、與其他土著微生物的生態(tài)位競爭等［26］。在本研究的土壤定殖實驗中，由于菜地土壤中初始速效磷含量高于花圃土壤，有利于細(xì)菌的快速繁殖，因此菜地土壤的菌落數(shù)在第3 天達(dá)到最高，但是花圃土壤中的總磷含量為26.74 mg/L，遠(yuǎn)高于菜地土壤總磷，并且菌株1616X1 在土壤的溶磷過程中，花圃土壤中速效磷含量增加量高于菜地土壤，為1616X1 的長期定殖提供了更多磷源，故菌株在花圃土壤中的定殖時間更長，證明了該菌株具有較強(qiáng)的定殖能力，更有助于此菌種在生產(chǎn)應(yīng)用中的推廣。因此，在后續(xù)試驗中，將對菌株1616X1在農(nóng)業(yè)應(yīng)用以及溶磷機(jī)理等方面進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

從湖泊沉積物中篩選高效溶磷菌1616X1，鑒定為Pseudomonassp.。菌株1616X1 的最佳溶磷條件為：葡萄糖10 g/L、硫酸銨0.17 g/L、初始pH 5.70、接種量5%、裝液量75 mL，培養(yǎng)溫度為23.3℃，在該培養(yǎng)條件下，菌株的溶磷量為684.92 mg/L，相比優(yōu)化前的568.76 mg/L，提高了17.26%。土壤溶磷試驗證明菌株1616X1 在土壤中具有較好的溶磷能力和定殖能力。