超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法測定環(huán)境水體中三種苯扎氯銨同系物

董會軍，馬天翼，李義，白雪山，董建芳，張璐

(河北省地質(zhì)環(huán)境監(jiān)測院，河北省地質(zhì)資源環(huán)境監(jiān)測與保護(hù)重點實驗室，河北 石家莊 050021)

苯扎氯銨(Benzalkonium Chlorides，BACs)，別名潔爾滅，是一種季銨鹽類陽離子表面活性劑，主要由十二烷基二甲基芐基氯化銨(C12-BAC)、十四烷基二甲基芐基氯化銨(C14-BAC)、十六烷基二甲基芐基氯化銨(C16-BAC)三種同系物組成。苯扎氯銨具有非氧化性殺菌作用，被應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)，消毒濕巾、免洗洗手液、滴眼液中均含有苯扎氯銨成分[1]。新型冠狀病毒(2019-nCoV)肺炎疫情發(fā)生以來，苯扎氯銨更是在日常消毒中被大量使用，隨著污水排放到環(huán)境中。苯扎氯銨已被列入歐盟委員會提出的優(yōu)先物質(zhì)清單，并確定為可能嚴(yán)重影響生態(tài)系統(tǒng)中敏感生物的有害化合物。有報道表明，苯扎氯銨對體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞具有明確的毒性作用[2]，可造成小鼠干眼癥形成[3]，當(dāng)城市污水苯扎氯銨的濃度超過2mg/L時，會影響污水處理廠污泥的呼吸作用，抑制生物脫氮作用[4]。準(zhǔn)確檢測環(huán)境水體中苯扎氯銨的含量對于維護(hù)人體和生態(tài)環(huán)境健康具有重要意義。

苯扎氯銨的檢測方法主要有化學(xué)法和儀器法。國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 2871、ISO 2271和中國標(biāo)準(zhǔn)《表面活性劑 洗滌劑 陽離子活性物含量的測定 直接兩相滴定法》(GB/T 5174)采用滴定法檢測洗滌劑中季銨鹽(含苯扎氯銨)的含量，適用于苯扎氯銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%～100%范圍內(nèi)的樣品。儀器分析法中較早開始采用分光光度法對其進(jìn)行檢測，包括示差分光光度法[5]、基于曙紅Y和曙紅B與苯扎氯銨離子締合反應(yīng)的紫外分光光度法[6]、鋁試劑或考馬斯亮藍(lán)G250與苯扎氯銨相互作用的共振光散射光譜法等[7-8]。分光光度法是利用苯扎氯銨的特異性反應(yīng)，具有儀器簡單、測定速度快等優(yōu)點，可以檢測溶液濃度在0.05～10mg/L范圍的樣品。拉曼光譜法[9]和傅里葉變換紅外光譜[10]可以結(jié)合回歸模型對工業(yè)產(chǎn)品中的苯扎氯銨進(jìn)行快速且非破壞性檢測。另外一類檢測苯扎氯銨的方法是先對樣品進(jìn)行分離,再采用紫外檢測器定量，如采用毛細(xì)管電泳法(CE)進(jìn)行分離，分離緩沖液為磷酸二氫鈉，分離電壓為10kV時可實現(xiàn)苯扎氯銨同系物的有效分離[11]。毛細(xì)管電泳法在分離效率上優(yōu)勢明顯，但是前處理步驟較為復(fù)雜，且容易受樣品基質(zhì)影響[12]。國際上早期有研究采用氣相色譜法分離苯扎氯銨[13]，F(xiàn)ID檢測器進(jìn)行定量分析。黃渤能[14]嘗試采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定嬰幼兒濕巾中苯扎氯銨的含量，在0.5～10mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。但是苯扎氯銨在氣相色譜儀上會發(fā)生熱降解，產(chǎn)物為烷基二甲胺[13]。目前國內(nèi)外用于苯扎氯銨檢測最為廣泛的方法是高效液相色譜法[15-26]，設(shè)備普及率高，前處理方法簡便、穩(wěn)定性好，儀器上機(jī)的濃度線性范圍在10.0～500mg/L左右，如果用于環(huán)境水體的檢測需要濃縮10000倍以上。近些年液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法因其對痕量有機(jī)物強(qiáng)大的定性定量能力已被逐步推廣，被應(yīng)用于苯扎氯胺的檢測中[27-31]。該方法具有準(zhǔn)確、高靈敏度的特點，但王浩等[28]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方乳粉中6種消毒劑殘留時發(fā)現(xiàn)，采用MRM模式檢測，C16-BAC依然會出現(xiàn)假陽性問題，這可能是因為母離子和子離子同時受到了m/z近似的離子干擾。解決這一問題，則需要分辨率更高的質(zhì)譜檢測器。目前比三重四極桿質(zhì)譜儀分辨率高的質(zhì)譜儀器，有傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR)、飛行時間質(zhì)譜(TOF)、靜電場軌道離子肼質(zhì)譜(Orbirap)等，這些儀器尚未應(yīng)用于苯扎氯銨的檢測。

在已報道的苯扎氯銨檢測方法中，檢測對象多為滴眼液、濕巾等，鮮見以環(huán)境水體為研究基體的報道。對于環(huán)境水體，其污染組分的來源復(fù)雜，存在更多的干擾物質(zhì)影響苯扎氯銨的檢測，更容易出現(xiàn)假陽性，并且環(huán)境水體中殘留苯扎氯銨的濃度相對于消毒劑、滴眼液等基體低得多。本文擬建立一種環(huán)境水體中檢出限低、抗干擾能力強(qiáng)的三種苯扎氯銨同系物C12-BAC、C14-BAC、C16-BAC的檢測方法，探索環(huán)境水體簡單準(zhǔn)確的前處理方法，通過優(yōu)化液相色譜分離條件，選擇一種靈敏度和分辨率兼具的高分辨質(zhì)譜檢測模式，并通過實際樣品驗證方法的適用性。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

超高效液相色譜儀(Vanquish，美國ThermoFisher公司)，配備在線脫氣機(jī)、二元高壓泵、柱溫箱、自動進(jìn)樣器；四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測器(Orbitrap Exploris 120，美國ThermoScientific公司)；液相色譜柱(Accucore C18，150mm×2.1mm，2.6μm，美國ThermoFisher公司)。

棕色玻璃進(jìn)樣瓶(2mL，上海安譜公司)，聚四氟乙烯微孔濾膜(0.22μm孔徑，美國Waters公司)。

三種苯扎氯銨同系物(C12-BAC、C14-BAC、C16-BAC)混合溶液(1000mg/L，溶劑甲醇，上海安譜公司)。

甲醇(色譜級，美國ThermoFisher公司)，乙酸銨(優(yōu)級純，國藥集團(tuán))，三乙胺(色譜級，上海安譜公司)。

實驗用水為Milli-Q超純水，其他試劑均為優(yōu)級純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

三種苯扎氯銨混合溶液(1000mg/L)使用甲醇逐級稀釋，得到1.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液；使用50%甲醇-水溶液稀釋得到10.0μg/L標(biāo)準(zhǔn)使用液；使用50%甲醇-水溶液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)使用液，得到0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、10.00μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列；進(jìn)行樣品加標(biāo)時，取一定體積的10.0μg/L或100μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到每組待加標(biāo)樣品中。

1.3 樣品采集及前處理

樣品采集于干凈干燥的棕色玻璃瓶中，配螺旋塑料瓶蓋(內(nèi)墊為聚四氟乙烯材質(zhì))；水樣充滿100mL樣品瓶，4℃冷藏保存；3天內(nèi)完成檢測，適用于地下水和地表水的采樣。

樣品在上機(jī)前，經(jīng)過0.22μm孔徑的濾膜過濾，棄去至少1mL初濾液，移取0.50mL過濾后的樣品于棕色玻璃進(jìn)樣瓶中，并加入0.50mL甲醇，混勻待測。

1.4 色譜-質(zhì)譜分析條件

1.4.1色譜條件

流動相：A為含1%三乙胺的10mmol/L乙酸銨-水溶液，B為甲醇。梯度洗脫：0～3.0min，B由50%線性遞增至 95%；3.0～7.0min，B保持95%；7.0～7.1min，B的比例降到50%；7.1～10.0min，B保持50%。流速0.25mL/min；柱溫箱40℃；進(jìn)樣量20μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離(ESI)源，正離子掃描；工作模式：選擇離子掃描(SIM，±1m/z)；質(zhì)譜參數(shù)為：鞘氣流速35Arb；輔助氣流速10Arb；噴霧電壓3500V(ESI+)。毛細(xì)管溫度320℃；離子源溫度350℃；一級質(zhì)量分辨率60000。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方式的選擇

為了有效地去除環(huán)境水體中的顆粒和膠體，本研究中水樣采用0.22μm孔徑的微孔濾膜過濾的前處理方式，避免堵塞高效液相色譜體系。有研究表明聚乙烯塑料對苯扎氯胺有較強(qiáng)的吸附作用[32]，因此與樣品有接觸的器皿應(yīng)避免使用聚乙烯材質(zhì)。

在建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程中發(fā)現(xiàn)，用純水配制的苯扎氯銨標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制過程及標(biāo)準(zhǔn)曲線的溶液均采用渦旋振蕩器進(jìn)行了搖勻處理，三種苯扎氯銨同系物的線性關(guān)系僅為0.90～0.996。而使用50%甲醇-水溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，三種苯扎氯銨同系物的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，且添加甲醇后，靈敏度有明顯增加。

純水和50%甲醇-水溶液兩種溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值詳見圖1。圖1中，純水配制的標(biāo)準(zhǔn)系列線性相關(guān)性較差，說明三種苯扎氯銨同系物在純水溶液中的均勻性較差，這可能是由于三種苯扎氯銨同系物均含有苯環(huán)和長碳鏈結(jié)構(gòu)，雖然在水中易溶，但仍然處在非均質(zhì)態(tài)。線性相關(guān)性上，C16-BAC

因此，為了保證環(huán)境水體中苯扎氯銨保持均質(zhì)狀態(tài)，過濾后的水樣取0.5mL與相同體積的甲醇混勻待測，雖然樣品稀釋了2倍，但是樣品稀釋后的儀器信號響應(yīng)值依然大于原樣品中的響應(yīng)值，方法的靈敏度并沒有降低，且樣品測試的精密度更高。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究借鑒文獻(xiàn)中液相色譜分離條件，確定了考察的液相色譜柱、流動相和流速條件，尋求一種簡單、快速分離三種苯扎氯銨同系物的方法。

圖1 不同溶劑中苯扎氯銨標(biāo)準(zhǔn)系列的儀器信號響應(yīng)Fig.1 Instrument signal response of standard series of benzalkonium chloride in different solvents

2.2.1色譜柱

以往的報道中，反相色譜柱[15,17,19,27-31]和氰基色譜柱[16,18,21-25]均能夠?qū)崿F(xiàn)三種苯扎氯銨同系物的分離。本研究根據(jù)三種苯扎氯銨因碳鏈長短不同而產(chǎn)生的極性差異，選用兼容性較強(qiáng)的反相色譜柱(考慮到pH范圍適用，文獻(xiàn)中也曾使用)，考察了Accucore C18(150mm×2.1mm，2.6μm)[27,30]、ODS(100mm×2.0mm，1.9μm)[15]、T3(100mm×2.1mm，1.8μm)[21]，這三根色譜柱鍵合相存在區(qū)別，從分離效果和峰形上考慮，確定選擇效果最好的Accucore C18色譜柱。

2.2.2流動相

本研究采用反相C18色譜柱，而苯扎氯銨同系物中的碳鏈較長，洗脫需要高比例的有機(jī)相，另外考慮到環(huán)境水體中存在極性較強(qiáng)的雜質(zhì)，初始梯度為10mmol/L 乙酸銨水溶液(含1%三乙胺)和甲醇的比例為50%∶50%，可以用于洗脫這部分雜質(zhì)[26-27]，因此本研究采用梯度洗脫?？疾炝艘译婧图状甲鳛橛袡C(jī)流動相，分離度和峰形區(qū)別不大，但乙腈作為流動相時，三種苯扎氯銨的保留時間比甲醇晚0.5～0.6min，故選擇甲醇作為有機(jī)流動相。

圖2 三乙胺對苯扎氯胺色譜分離的影響Fig.2 Effect of triethylamine on chromatographic separation of benzalkonium chloride

當(dāng)采用C18反相色譜柱分離三種苯扎氯銨同系物時，在水相流動相中加入乙酸銨作為離子對試劑，加入三乙胺作為掃尾劑。實驗中考察了乙酸銨4個濃度：5mmol/L[29]、10mmol/L、20mmol/L[17]、100mmol/L[26]，結(jié)果表明乙酸銨濃度越大，苯扎氯銨出峰越快。液相體系內(nèi)水相的比例為5%時，在乙酸銨濃度為20mmol/L和100mmol/L條件下，三種苯扎氯銨同系物無法實現(xiàn)有效分離；濃度為5mmol/L時，最后一種苯扎氯銨出峰的時間是7.8min；濃度為10mmol/L時，最后出峰的時間為6.0min，選擇該濃度能夠更快出峰。水相僅為乙酸銨溶液時，三種苯扎氯銨同系物的色譜峰存在一定的拖尾和展寬的情況，在水相溶液中加入三乙胺可以改善峰展寬，使得峰形更尖銳。從峰形對比情況(圖2)來看，1.0%(V/V)的三乙胺比0.5%(V/V)的效果更明顯，但當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為2%時，C12-BAC和C14-BAC的分離不完全，這與文獻(xiàn)[15,19-20]選擇相同。另外，三乙胺也能夠使三種苯扎氯銨同系物出峰時間提前，為了使得乙酸銨和三乙胺疊加以后，三種苯扎氯銨同系物也能夠?qū)崿F(xiàn)分離，因此乙酸銨不能選擇過高的濃度。

2.2.3柱溫

實驗考察了20℃、25℃、30℃、35℃、40℃五個溫度的分離情況，在不同溫度條件下，三種苯扎氯銨同系物均能夠?qū)崿F(xiàn)分離。本研究選擇出峰速度最快的40℃作為實驗溫度。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將濃度為100μg/L 的三種苯扎氯銨同系物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中，在正離子模式下進(jìn)行母離子掃描，得到苯扎氯銨同系物的母離子。同時正離子模式下進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，優(yōu)化Absolute模式電壓，選擇30kV電壓，得到苯扎氯銨同系物的主要產(chǎn)物離子。苯扎氯銨同系物的母離子、產(chǎn)物離子及響應(yīng)強(qiáng)度見表1。

表1 苯扎氯銨同系物的母離子、產(chǎn)物離子及其強(qiáng)度Table 1 Parent ions,product ions of benzalkonium chloride homologues and their response intensity

由于苯扎氯銨同系物為長碳鏈結(jié)構(gòu)，二級碎片斷裂位置不固定，優(yōu)化出的產(chǎn)物離子為m/z91.053，通過準(zhǔn)確質(zhì)量推測應(yīng)為苯甲基，其結(jié)構(gòu)上也相對穩(wěn)定，符合斷裂的規(guī)律。但是背景噪聲較高，二級掃描的優(yōu)勢發(fā)揮不出來，并且產(chǎn)物離子的強(qiáng)度因為經(jīng)過碰撞碎裂的過程，信號響應(yīng)值不如母離子掃描。因此本研究選用母離子掃描模式。

在以往的文獻(xiàn)報道中，無論液相色譜法還是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，研究人員發(fā)現(xiàn)C16-BAC存在假陽性的情況[26-28]。通過高分辨質(zhì)譜對離子之間極小的質(zhì)量差異分辨，從而從復(fù)雜基質(zhì)樣品中準(zhǔn)確測定目標(biāo)物，減少出現(xiàn)假陽性和假陰性的可能性[34]。在本研究中，尤其注意了C16-BAC的譜圖，在檢測某城市中心河水時發(fā)現(xiàn)，C12-BAC和C16-BAC檢出，但C16-BAC譜圖包含2個質(zhì)量數(shù)m/z360.361和m/z360.323，C16-BAC的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)應(yīng)該為m/z360.361。通過調(diào)整流動相的洗脫梯度，在C16-BAC色譜峰后分離出一個小峰，但還是不能完全分離。

在分辨率15000、30000、60000和120000條件下分別進(jìn)行掃描分析,得到譜圖見圖3。圖中包含了4個分辨率條件下的譜圖，每個分辨率分為a和b兩部分，圖3a是色譜分離的總離子流圖(TIC)，圖3b是C16-BAC后小峰峰尖位置(保留時間為8.01min或7.99min)的質(zhì)譜掃描圖?？梢钥闯?，在4個分辨率條件下，都能看到m/z360.361和m/z360.323兩個質(zhì)量數(shù)，其中m/z360.361是C16-BAC的質(zhì)量數(shù)，m/z360.323通過準(zhǔn)確質(zhì)量推測為丙二醇脂肪酸酯；在分辨率15000的條件下，m/z360.361和m/z360.323無法完全分離；隨著分辨率的增加，m/z360.361和m/z360.323逐步分離，當(dāng)分辨率為60000時，兩個質(zhì)核比的分離度R大于1.5，即使色譜峰不分離或分離效果不佳，在定量時準(zhǔn)確輸入C16-BAC的質(zhì)量數(shù)，m/z360.323的響應(yīng)值不再影響C16-BAC的定量。在色譜分離的基礎(chǔ)上進(jìn)行質(zhì)量數(shù)分辨，能夠有效地避免假陽性和基質(zhì)干擾。由于質(zhì)譜掃描時，分辨率越高，靈敏度越低，因此在質(zhì)量數(shù)可以有效地分離的情況下，選擇60000的分辨率。

2.4 線性關(guān)系及方法檢出限

測定濃度范圍在0.10～10.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，測定結(jié)果經(jīng)線性回歸(y為峰面積；x為濃度，單位μg/L)，得到相關(guān)系數(shù)。在7份空白水樣中進(jìn)行加標(biāo)實驗，加標(biāo)濃度為0.10μg/L，計算7份平行樣測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按照公式MDL=t(n-1,0.99)×s計算方法檢出限(式中：n=7，t=3.143，s為標(biāo)準(zhǔn)偏差)。三種苯扎氯銨同系物的方法特性指標(biāo)見表2。

表2 三種苯扎氯銨同系物的方法特性指標(biāo)Table 2 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits of three benzalkonium chloride homologues

2.5 方法準(zhǔn)確度和精密度

采集了石家莊市內(nèi)某斷面河水和地下水監(jiān)測井兩種類型的水樣進(jìn)行方法準(zhǔn)確度和精密度測定，水樣相對潔凈，溶解性總固體含量小于200mg/L。采集的樣品使用0.22μm孔徑濾膜進(jìn)行過濾，取0.50mL過濾液與等體積甲醇混合后上機(jī)測定。其中地表水中檢出C12-BAC(1.71μg/L)和C16-BAC(1.34μg/L)，地下水未有檢出。地表水取兩組樣品，每組6份，分別加入1.00、5.00μg/L兩個濃度的苯扎氯銨混合溶液；地下水取三組樣品，每組6份，分別加入0.20、1.00、5.00μg/L三個濃度的苯扎氯銨混合溶液，樣品經(jīng)前處理后進(jìn)行測定。從測定結(jié)果(表3)可以看出不同濃度平均加標(biāo)回收率為86.7%～111.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.7%～10.2%(n=6)。

表3 三種苯扎氯銨同系物的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and RSD for three benzalkonium chloride homologues in spiked samples (n=6)

2.6 實際樣品檢測

采用本方法對4個污染地塊的淺層地下水進(jìn)行檢測，其中2個淺層地下水中檢出了苯扎氯銨。且每個樣品中同時檢出三種同系物，第1個樣品檢出濃度在0.61～1.20μg/L范圍，第2個樣品檢出濃度在3.84～5.41μg/L范圍。以第1個樣品的譜圖為例進(jìn)行分析，圖4a為色譜分離圖，C16-BAC受到一定的基體干擾；圖4中b、c、d分別為C12-BAC、C14-BAC、C16-BAC對應(yīng)質(zhì)量數(shù)提取的定量譜圖，從圖4d可以看出，與圖4a對應(yīng)的色譜分離圖不同，C16-BAC的質(zhì)譜圖峰形對稱，不再受基體干擾的影響。對水樣進(jìn)行加標(biāo)回收確認(rèn)，第一個樣品加標(biāo)1.0μg/L，第2個樣品加標(biāo)5.0μg/L，加標(biāo)回收率在93.5%～107.1%之間，且原樣品出峰時間和加標(biāo)樣品出峰時間匹配。結(jié)果表明該方法的靈敏度高，定性和定量能力強(qiáng)。

圖4 實際水樣譜圖Fig.4 Spectrograms of actual aqueous sample

3 結(jié)論

本文在環(huán)境水體前處理過程中對過濾后的樣品加入甲醇，增強(qiáng)了苯扎氯銨的溶解及其在水樣中的均勻性，優(yōu)化了液相色譜分離條件，使得三種苯扎氯銨同系物能夠快速有效地分離，利用靜電場軌道阱質(zhì)譜分析了干擾C16-BAC檢測的物質(zhì)。建立的超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法能夠滿足環(huán)境水體中三種苯扎氯銨同系物的檢測需求。

本文建立的方法檢出限低、抗干擾能力強(qiáng)，契合了環(huán)境水體監(jiān)測的要求，解決了液相色譜法分離苯扎氯銨同系物可能存在的假陽性問題，實現(xiàn)了環(huán)境水體中苯扎氯銨同系物的準(zhǔn)確定量分析，可為環(huán)境水體中苯扎氯銨同系物的監(jiān)測提供技術(shù)支撐。同時發(fā)現(xiàn)水相中的苯扎氯銨并非均勻地分布，其在環(huán)境水體中的賦存狀態(tài)需要今后開展進(jìn)一步深入研究。