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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討苦參堿在奶牛生產(chǎn)中的抗炎作用機(jī)制

    2023-01-05 13:57:14趙梓軒楊嘉睿蔣林樹童津津
    關(guān)鍵詞:數(shù)據(jù)庫信號(hào)

    趙梓軒 楊嘉睿 蔣林樹 童津津

    (北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京102206)

    隨著居民生活水平的不斷提高,畜產(chǎn)品的安全質(zhì)量問題日益受到重視,這對(duì)我國畜牧業(yè)實(shí)現(xiàn)綠色、健康和高質(zhì)量發(fā)展提出了更高要求。在過去的很長(zhǎng)一段時(shí)間里,獸用抗生素對(duì)動(dòng)物疾病的防治、養(yǎng)殖效益的提高以及畜禽產(chǎn)品的高效供應(yīng)起到了舉足輕重的作用;然而,抗生素使用不當(dāng)?shù)膯栴}也日益凸顯,對(duì)畜產(chǎn)品的質(zhì)量、公共衛(wèi)生、生態(tài)環(huán)境以及動(dòng)物健康造成了危害[1],阻礙了我國畜牧業(yè)大力推進(jìn)綠色健康養(yǎng)殖發(fā)展的步伐。所以,尋找安全有效并且不產(chǎn)生耐藥性的抗生素替代物成為當(dāng)務(wù)之急。

    苦參(SophoraflavescensAit.)在我國已經(jīng)具有兩千多年的使用歷史,作為傳統(tǒng)的中藥材其作用主要有清熱利尿和祛濕殺蟲等。據(jù)報(bào)道,苦參的主要生物活性成分為苦參堿,其同時(shí)也是發(fā)揮抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及抗炎等功能的最主要的活性物質(zhì)[2]。研究發(fā)現(xiàn),不僅是苦參,還包括苦豆、廣豆根等其他豆科植物的中藥材,它們的有效活性成分均為苦參堿,都能發(fā)揮殺菌消炎、抵抗病毒和腫瘤、殺蟲以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等多種生理功能[3]。此外,研究表明,苦參堿對(duì)斷奶仔豬腹瀉[4]、牛乳頭狀瘤病毒[5]以及小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎[6]等疾病的治療均有較好的效果??鄥A在奶牛臨床應(yīng)用中也取得了較好的療效。據(jù)報(bào)道,苦參堿對(duì)預(yù)防和治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的效果顯著[3],對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bMECs)增殖、凋亡及抗氧化能力有一定的影響[7]。盧金霞[8]研究發(fā)現(xiàn),苦參堿對(duì)引起奶牛乳房炎的常見致病菌金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制作用,可通過干預(yù)其對(duì)bMECs的黏附作用,從而發(fā)揮苦參堿對(duì)乳腺的保護(hù)作用。

    雖然中藥在疾病預(yù)防和治療方面發(fā)揮著舉足輕重的作用,但是由于人們?cè)谄浒l(fā)揮療效的作用靶點(diǎn)及機(jī)制方面尚未闡明,嚴(yán)重限制了中藥的重新定位及作為新獸藥的開發(fā)利用[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)借助計(jì)算機(jī)技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)等多學(xué)科的交叉融合,形成了以網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)為核心的技術(shù)體系。據(jù)報(bào)道,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)藥物的組成成分以及作用機(jī)制進(jìn)行研究,可從生物網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)的角度來揭示藥物與疾病之間的關(guān)系[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的應(yīng)用可以提高疾病的治療效率,減少機(jī)體對(duì)相關(guān)藥物的不良反應(yīng),提升中藥治療疾病的成功率,節(jié)約藥品研發(fā)成本[11]。因此,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法,探討苦參堿在奶牛生產(chǎn)中發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制,以期為苦參堿在奶牛生產(chǎn)中的臨床應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 苦參堿相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

    中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP,https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)是一個(gè)查找藥物、靶點(diǎn)和疾病之間的關(guān)系的有效中藥系統(tǒng)藥理平臺(tái)[12]。本文以“matrine”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索,將獲取的苦參堿有效化合物作用靶點(diǎn)信息輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)和PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(即有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫,是一種化學(xué)模組的數(shù)據(jù)庫[13])。然后通過PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html)預(yù)測(cè)并得到苦參堿相關(guān)的靶點(diǎn)。

    1.2 炎癥相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

    GeneCards是一個(gè)可檢索和集成的數(shù)據(jù)庫,可以在大量的基因與疾病、變異與蛋白質(zhì)和細(xì)胞與通路之間進(jìn)行有效鏈接[14]。DisGeNET是一個(gè)綜合和規(guī)范化各種與疾病有關(guān)的基因和有關(guān)變異的數(shù)據(jù)庫,其中包含了科學(xué)文獻(xiàn),同時(shí)涵蓋了所有的人類疾病以及正常與不正常的特點(diǎn)[15]。以“inflammation”為關(guān)鍵詞,分別在上述2個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索,獲取的交集為炎癥相關(guān)靶點(diǎn)。

    1.3 苦參堿抗炎靶點(diǎn)可視化分析

    將上述獲得的成分靶點(diǎn)、炎癥相關(guān)靶點(diǎn)上傳于Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)網(wǎng)絡(luò)在線服務(wù)器中繪制韋恩圖,獲得苦參堿-炎癥靶點(diǎn)的交集,并進(jìn)行可視化處理。

    1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    登錄STRING數(shù)據(jù)庫上傳苦參堿抗炎靶點(diǎn),分析苦參堿的相關(guān)靶點(diǎn)并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。STRING數(shù)據(jù)庫是現(xiàn)階段信息量最豐富,研究蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫之一,該數(shù)據(jù)庫對(duì)已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)互作信息進(jìn)行評(píng)估與整合,形成了覆蓋大于1 100生物體的綜合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。該數(shù)據(jù)庫綜合多個(gè)數(shù)據(jù)庫的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù),同時(shí)也含有生物信息學(xué)等研究方法預(yù)測(cè)的相關(guān)研究結(jié)果。STRING數(shù)據(jù)庫依據(jù)不同證據(jù)通道的概率計(jì)算,結(jié)合隨機(jī)交互概率校正,最終綜合得分為0.4時(shí),為中等可信度;為0.7時(shí),為高可信度;為0.9時(shí),為最高可信度[16]。本研究選用了評(píng)分為0.4的PPI網(wǎng)絡(luò),即中等可信度網(wǎng)絡(luò)。登錄STRING數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入苦參堿發(fā)揮抗炎作用的潛在靶點(diǎn)并選擇“Bostaurus”物種,獲取靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系;required interaction score選擇“medium confidence(0.400)”并導(dǎo)出tsv文件;上傳tsv文件至Cytoscape 3.9.1并制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖,選擇Cytoscape 3.9.1插件CytoNCA,對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治霾⒌玫疥P(guān)鍵核心靶點(diǎn),通過CytoNCA插件計(jì)算節(jié)點(diǎn)的介數(shù),接近中心性和子網(wǎng)絡(luò)中心性,疊加3個(gè)指標(biāo),篩選出前10%作為關(guān)鍵核心靶點(diǎn)[17]。

    1.5 基因本體(gene ontology,GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析

    登錄David數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)輸入苦參堿抗炎靶點(diǎn),選擇“Bostaurus”物種,select identifier設(shè)置為official gene symbol,list type設(shè)置為gene list,進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,導(dǎo)出txt文件。將靶點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行降序排列,選擇生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)進(jìn)行富集分析。根據(jù)微生信在線作圖平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并制作直方圖和KEGG氣泡圖。

    1.6 苦參堿-炎癥靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    Cytoscape源于系統(tǒng)生物學(xué),其將生物分子交互網(wǎng)絡(luò)、高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)和其他的分子狀態(tài)信息綜合分析整合,最終將數(shù)據(jù)結(jié)合成可視化網(wǎng)絡(luò)[18]。本研究通過Cytoscape 3.9.1軟件(https://cytoscape.org/)導(dǎo)入苦參堿抗炎靶點(diǎn)以及相關(guān)通路信息,建立苦參堿-炎癥靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.7 分子對(duì)接

    利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)搜索苦參堿,復(fù)制苦參堿的InChIKey,登錄PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),搜索苦參堿InChIKey,下載配體苦參堿的2D結(jié)構(gòu),保存成SDF格式;利用Chem 3D軟件轉(zhuǎn)換為mol2格式文件,導(dǎo)入Autodock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行加全氫、設(shè)置為配體(自動(dòng)分布電荷)、檢測(cè)配體的Torsion tree中的扭轉(zhuǎn)鍵、選擇扭轉(zhuǎn)鍵等處理,保存文件為pdbqt。登錄UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)復(fù)制核心靶點(diǎn)的,選擇條件應(yīng)滿足“已驗(yàn)證,物種人”。再登錄RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/),粘貼對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)Entry Name,選擇蛋白質(zhì)晶體分辨率介于2.0~3.0,下載核心靶點(diǎn),即受體白蛋白(ALB)、腫瘤壞死因子(TNF)、MYC原癌基因堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(MYC)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)、周期蛋白D1(CCND1)、CD44和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的PDB格式文件。同時(shí)在AutodockTools 1.5.6軟件中對(duì)核心靶點(diǎn)蛋白采用除去水、加入氫等處理方法。首先在AutodockTools 1.5.6軟件中設(shè)置Grid,選擇對(duì)應(yīng)的配體文件和受體文件,選擇半柔性對(duì)接,設(shè)置GridBox,包裹住全部受體,保存為GPF格式文件,運(yùn)行RUN AutoGrid,設(shè)置對(duì)接參數(shù)及運(yùn)算方法,保存為DPF格式文件;然后設(shè)置Dock,依次選擇配體文件、受體文件等,運(yùn)行Run Autodock,保存為DPF格式文件;最終對(duì)運(yùn)算結(jié)果進(jìn)行分析并選用自由結(jié)合能最低的結(jié)合構(gòu)象作為最佳構(gòu)象。利用PyMOL 2.5.2軟件進(jìn)行可視化處理。

    1.8 細(xì)胞分組

    采用DMEM-F12、10%胎牛血清(FBS)和1%青-鏈霉素培養(yǎng)基,在溫度為37 ℃的5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)bMECs。未經(jīng)處理正常培養(yǎng)的bMECs為對(duì)照組(CON組);將無乳鏈球菌與bMECs按感染復(fù)數(shù)(MOI)50∶1、共孵育6 h為奶牛乳腺炎癥模型組(TRT組)[19-20];參照已發(fā)表的文獻(xiàn)[21],利用50 μg/mL的苦參堿添加無乳鏈球菌與bMECs炎癥模型共孵育6 h,為苦參堿組(MAT組)。每組3個(gè)重復(fù)。

    1.9 Western blot

    參照本團(tuán)隊(duì)前期報(bào)道Western blot的研究方法[22-23],檢測(cè)CASP3和CCND1蛋白表達(dá)量的變化??贵wCASP3(#9662)和CCND1(#55506)均購自于Cell Signaling公司。使用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

    1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)最初使用Excel 2019進(jìn)行整理,應(yīng)用軟件SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 苦參堿炎癥靶點(diǎn)獲取結(jié)果

    本研究發(fā)現(xiàn),苦參堿在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共有10個(gè)靶點(diǎn),通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫獲得276個(gè)靶點(diǎn),兩者取并集共獲得282個(gè)苦參堿靶點(diǎn)。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得10 898個(gè)炎癥靶點(diǎn),通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得467個(gè)靶點(diǎn),兩者取并集共獲得10 900個(gè)炎癥靶點(diǎn)。

    2.2 苦參堿炎癥靶點(diǎn)可視化分析

    通過生物信息在線作圖平臺(tái),分別輸入苦參堿靶點(diǎn)和炎癥靶點(diǎn)通過韋恩圖對(duì)苦參堿和炎癥靶點(diǎn)進(jìn)行可視化(圖1)。

    2.3 苦參堿炎癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

    將獲得的苦參堿炎癥靶點(diǎn)共71個(gè)輸入STRING數(shù)據(jù)庫,限制物種為“Bostaurus”,獲取蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)。結(jié)果表明,節(jié)點(diǎn)數(shù)為71,邊數(shù)為180,預(yù)期的邊數(shù)為91,平均節(jié)點(diǎn)度值為5.07,平均局部聚類系數(shù)為0.47,PPI富集P值為2.22×10-16,保存為tsv文件。將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,根據(jù)其度值(degree)選擇排名前30繪制柱狀圖(圖3),由圖可見degree排名前5的靶點(diǎn)主要包括ALB、TNF、MYC、CASP3及CCND1。CytoNCA插件計(jì)算節(jié)點(diǎn)中心性,篩選核心靶點(diǎn)。CytoNCA包含8種中心性,分別為介數(shù)、接近中心性、自由度、特征向量中心性、平均最短路徑長(zhǎng)度、網(wǎng)絡(luò)中心性、子網(wǎng)絡(luò)中心性和信息中心性。本研究選取介數(shù)、接近中心性和子網(wǎng)絡(luò)中心性的前10%的節(jié)點(diǎn),并將3個(gè)中心性重疊,從而獲得具有關(guān)鍵靶點(diǎn)的子網(wǎng)絡(luò)。由表1和圖4可知,苦參堿抗炎核心靶點(diǎn)為ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6。

    圖1 苦參堿炎癥靶點(diǎn)韋恩圖

    ACAT2:乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶2 acetyl-CoA acetyltransferase 2;ACO1:順烏頭酸酶1 aconitase 1;IDH:異檸檬酸脫氫酶 isocitrate dehydrogenase;HSD17B4:17β-羥基類固醇4型脫氫酶 hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 4;FABP2:脂肪酸結(jié)合蛋白2 fatty acid-binding protein 2;MTAP:S-甲基-5′-硫代腺苷磷酸化酶 S-methyl-5′-thioadenosine phosphorylase;GAD:谷氨酸脫羧酶 glutamate decarboxylase;ALDH18A1:乙醛脫氫酶18家族成員A1 aldehyde dehydrogenase 18 family member A1;ODC1:鳥氨酸脫羧酶1 ornithine decarboxylase 1;HPD:4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase;PYGL:肝糖原磷酸化酶 glycogen phosphorylase, liver form;DGKA:二?;视图っ甫?diacylglycerol kinase alpha;CANT1:鈣激活核苷酸酶1 calcium activated nucleotidase 1;PRM1:魚精蛋白1 protamine 1;SYNCRIP:突觸結(jié)合蛋白結(jié)合細(xì)胞質(zhì)RNA相互作用蛋白 synaptotagmin binding cytoplasmic RNA interacting protein;SPR54:信號(hào)識(shí)別顆粒54 signal recognition particle 54;PDK3:丙酮酸脫氫酶激酶同工酶3 pyruvate dehydrogenase kinase 3;HPSE:乙酰肝素酶 heparanase;PSAP:鞘脂激活蛋白原 prosaposin;BMP7:骨形成蛋白7 bone morphogenetic protein 7;CCNA2 周期蛋白A2 cyclin A2;CAMK2A:鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶2α calcium/calmodulin dependent protein kinase 2 alpha;BCR:斷裂點(diǎn)簇集群區(qū) breakpoint cluster region;ALK:間變性淋巴瘤激酶 anaplastic lymphoma kinase;ALB:白蛋白 albumin;MYC:MYC原癌基因堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子 MYC proto-oncogene, basic helix-loop-helix transcription factor;CUL1:滯蛋白1 Cullin 1;SERPINA5:絲氨酸蛋白酶抑制劑家族A成員5 Serpin family A member 5;TPR:核蛋白易位啟動(dòng)子區(qū)域 nucleoprotein translocation promoter region;UTRN:肌營(yíng)養(yǎng)相關(guān)蛋白 Utrophin;TAB1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶結(jié)合蛋白1 transforming growth factor-β-activated kinase-binding protein 1;MMP2:基質(zhì)金屬蛋白酶2 matrix metalloproteinase 2;TTR:轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白 transthyretin;RAC1:Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1;MAPK6:絲裂原活化蛋白激酶6 mitogen-activated protein kinase 6;ESR1 雌激素受體1 estrogen receptor 1;CCND1:周期蛋白D1 cyclin D1;HBB:血紅蛋白β亞基 hemoglobin subunit beta;C8A:補(bǔ)體C8α鏈 complement C8 alpha chain;MAPKAPK2:絲裂原激活蛋白激酶激活蛋白激酶2 mitogen-activated protein kinase activated protein kinase 2;PRKCQ:蛋白激酶Cθ protein kinase C theta;CD3E:T細(xì)胞受體復(fù)合物CD3ε亞基 CD3 epsilon subunit of T-cell receptor complex;RELA:轉(zhuǎn)錄因子p65 transcription factor p65;TNF:腫瘤壞死因子 tumor necrosis factor;CASP3:半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3 Caspase-3;TJP1:緊密連接蛋白1 tight junction protein 1;DPP4:二肽基肽酶-4 dipeptidyl peptidase-4;TLL1:類Tolloid蛋白1 Tolloid like 1;INSR:胰島素受體 insulin receptor;MUC1:黏蛋白1 mucin 1;ICAM1:細(xì)胞間黏附分子1 intercellular adhesion molecule 1;IL-6:白細(xì)胞介素-6 interleukin-6;ACBD7:乙酰輔酶A結(jié)合域包含7 acyl-CoA binding domain containing 7;BCL9:B細(xì)胞淋巴瘤9 B-cell lymphoma 9;PRKD2:絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶D2 Serine/threonine protein kinase D2;HMGB2:高遷移率族蛋白B2 high mobility group box 2;GTF2E1:通用轉(zhuǎn)錄因子2E亞基1 general transcription factor 2E subunit 1;HDAC8:組蛋白脫乙?;? histone deacetylase 8;ANXA1:膜聯(lián)蛋白A1 annexin A1;NMT1:N-十四烷酰轉(zhuǎn)移酶1 N-myristoyltransferase 1;PTGS1:前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1 prostaglandin-endoperoxide synthase 1;PTPRJ:蛋白酪氨酸磷酸酶受體J protein tyrosine phosphatase receptor J;VPS4B:液泡蛋白分選蛋白4B vacuolar protein sorting 4 homolog B;KLRD1:殺傷細(xì)胞凝集素樣受體D1 killer cell lectin like receptor D1;CSF2RB:集落刺激因子2受體β亞基 colony stimulating factor 2 receptor subunit beta;ALOX12:花生四烯酸12-脂氧合酶 arachidonate 12-lipoxygenase;SMAP1:基質(zhì)膜相關(guān)蛋白1 stromal membrane-associated protein 1。圖3、圖4和圖7同 the same as Fig.3, Fig.4 and Fig.7。

    圖3 苦參堿炎癥潛在靶點(diǎn)度值排序

    表1 苦參堿炎癥核心靶點(diǎn)

    通過拓?fù)浞治觯_定苦參堿對(duì)奶牛炎癥作用相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò),顏色越深,其度值越高。

    2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

    登錄David數(shù)據(jù)庫上傳71個(gè)苦參堿抗炎靶點(diǎn),該物種限定為“Bostaurus”,并進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析結(jié)果獲得62種BP、16種CC和12種MF。選取閾值P<0.01的條目,在微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)中導(dǎo)入GO term、Count、P-value以及分類相關(guān)數(shù)據(jù)生成BP、CC和MF三合一圖(圖5)。其中,BP主要包括細(xì)胞對(duì)過氧化氫的反應(yīng)(cellular response to hydrogen peroxide)、一氧化氮(NO)生物合成過程的正調(diào)控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、脂多糖細(xì)胞反應(yīng)(cellular response to lipopolysaccharide)、異型細(xì)胞黏附的正調(diào)控(positive regulation of heterotypic cell-cell adhesion)以及白細(xì)胞介素-8產(chǎn)生的正調(diào)控(positive regulation of interleukin-8 production)等;CC主要包括細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)和細(xì)胞外間隙(extracellular space)等;MF主要包括蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)、ATP結(jié)合(ATP binding)和質(zhì)膜(membrane)等。

    圖5 GO功能富集分析

    KEGG通路富集分析(圖6)共獲得22條信號(hào)通路,主要包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、核因子-κB信號(hào)通路(NF-κB signaling pathway)以及Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)等通路,與苦參堿發(fā)揮抗炎作用密切相關(guān)。

    圖6 KEGG通路富集分析

    2.5 苦參堿-炎癥靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    將David通路注釋得到的數(shù)據(jù),登錄Cytoscape 3.9.1軟件上傳相關(guān)數(shù)據(jù),構(gòu)建苦參堿-炎癥靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)。Network Analyzer結(jié)果顯示,網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)為94,網(wǎng)絡(luò)邊數(shù)為182,網(wǎng)絡(luò)密度為0.04,網(wǎng)絡(luò)直徑為4,網(wǎng)絡(luò)半徑為2,網(wǎng)絡(luò)中心度為0.74,網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為1.92,特征路徑長(zhǎng)度為2.35。

    2.6 分子對(duì)接結(jié)果

    將苦參堿相關(guān)活性成分與潛在作用靶點(diǎn)拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)圖中連接度最高的成分苦參堿與7個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接,即受體為ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6,配體為苦參堿,分子對(duì)接結(jié)果見表2和圖8。結(jié)合自由能用來評(píng)估成分和靶點(diǎn)之間的結(jié)合;如果結(jié)合能小于0,則表明活性成分和靶點(diǎn)可以自由結(jié)合。研究表明,若兩者之間結(jié)合自由能較低,則兩者之間親和力較強(qiáng)[21]。通常認(rèn)為,結(jié)合自由能<-5 kcal/mol表示活性成分與作用靶點(diǎn)之間親和力良好[20]。本研究結(jié)果表明,ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6皆可與苦參堿穩(wěn)定結(jié)合,提示苦參堿與上述靶點(diǎn)之間的相互作用可能為苦參堿發(fā)揮抗炎的重要作用機(jī)制之一,需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

    2.7 苦參堿對(duì)無乳鏈球菌誘導(dǎo)的bMECs相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

    如圖9所示,與CON組相比,TRT組CASP3蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01),CCND1蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01);與TRT組相比,MAT組CASP3蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01),CCND1蛋白表達(dá)量極顯著提高(P<0.01)。

    Matrine:苦參堿;Metabolic pathways:代謝通路;MAPK signaling pathway:絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路;IL-17 signaling pathway:白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路;HIF-1 signaling pathway:缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路;Hematopoietic cell lineage:造血細(xì)胞譜系;Glutathione metabolism:谷胱甘肽代謝;Citrate cycle (TCA cycle):檸檬酸循環(huán)(三羧酸循環(huán));Cellular senescence:細(xì)胞衰老;Carbon metabolism:碳代謝;C-type lectin receptor signaling pathway C型凝集素受體信號(hào)通路;Butanoate metabolism:丁酸鹽代謝;Biosynthesis of amino acids:氨基酸生物合成;Adherens junction:黏著連接;2-oxocarboxylic acid metabolism;2-氧羧酸代謝;Wnt signaling pathway Wnt信號(hào)通路;Toll-like receptor signaling pathway Toll樣受體信號(hào)通路;TNF signaling pathway:腫瘤壞死因子信號(hào)通路;Th17 cell differentiation:Th17細(xì)胞分化;TGF-beta signaling pathway:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路;T cell receptor signaling pathway:T細(xì)胞受體信號(hào)通路;NF-kappa B signaling pathway:核因子-κB信號(hào)通路;Neurotrophin signaling pathway:神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路。

    表2 苦參堿與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

    3 討 論

    3.1 苦參堿抗炎關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

    本研究發(fā)現(xiàn),苦參堿在奶牛生產(chǎn)中發(fā)揮抗炎的核心靶點(diǎn)為ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6。據(jù)報(bào)道,由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等特定細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子——腫瘤壞死因子-α(TNF-α),用于刺激炎癥發(fā)生,并調(diào)節(jié)細(xì)胞中引起壞死和凋亡的一系列信號(hào)調(diào)控。這種炎性因子在抵抗感染、癌癥等過程中發(fā)揮一定的作用[24]。有研究表明,苦參堿對(duì)金黃色葡萄球菌脂磷壁酸(LTA)誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎具有一定的保護(hù)作用,且呈劑量依賴性降低促炎細(xì)胞因子[TNF-α和白細(xì)胞介素-1(IL-1)]的表達(dá)。此外,研究發(fā)現(xiàn),在LTA刺激的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(bEECs)的炎癥模型中,苦參堿處理可抑制Toll樣受體(TLR)2的表達(dá)及其下游核因子NF-κB的活化,從而降低炎癥損傷[25]。于曉紅等[26]建立了脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥模型,結(jié)果表明,苦參堿能顯著降低TNF-α、IL-1、IL-6和白細(xì)胞介素-8(IL-8)mRNA的表達(dá),具有較強(qiáng)的抗炎作用。據(jù)報(bào)道,IL-6是一種多功能細(xì)胞因子,通過其獨(dú)特的受體系統(tǒng)具有多種生物活性,能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[27]。此外,與本研究結(jié)果一致,丁園園等[28]研究發(fā)現(xiàn),苦參堿通過調(diào)節(jié)病毒復(fù)制、凋亡和炎癥反應(yīng)作用于TNF-α、IL-6和CASP3靶點(diǎn),從而達(dá)到治療COVID-19的目的。本研究通過Western blot結(jié)果證明,苦參堿可通過對(duì)CASP3和CCND1蛋白的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗炎作用。據(jù)報(bào)道,清肝化瘀顆粒的有效成分苦參堿以劑量依賴方式抑制了肝癌細(xì)胞的增殖[29],對(duì)TP53和CCND1等核心靶點(diǎn)具有調(diào)節(jié)作用,對(duì)肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激脅迫標(biāo)志物產(chǎn)生影響,引起細(xì)胞凋亡。綜上可知,本研究進(jìn)一步闡明了苦參堿抗炎作用的核心靶點(diǎn)及其作用機(jī)制。

    a~g分別代表苦參堿與ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6的對(duì)接示意圖。

    **表示P<0.01,****表示P<0.000 1。

    3.2 苦參堿炎癥GO功能和KEGG關(guān)鍵通路分析

    GO功能富集分析結(jié)果表明,苦參堿發(fā)揮抗炎作用的主要靶點(diǎn)是通過過氧化氫反應(yīng)、NO生物合成過程和IL-8等途徑。這與先前的研究結(jié)果一致,苦參堿可作用于白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-17淋巴細(xì)胞或單核巨噬細(xì)胞釋放的炎性細(xì)胞因子,通過Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮作用,與提高機(jī)體抗氧化能力及降低機(jī)體氧化損傷密切有關(guān)[30]。NO作為機(jī)體重要的信號(hào)傳遞因子,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等都具有重要作用,可廣泛參與哺乳動(dòng)物的生理調(diào)節(jié)。張想軍等[31]發(fā)現(xiàn),25~100 μg/mL的苦參堿可顯著促進(jìn)bMECs的增殖,并可抑制金黃色葡萄球菌入侵感染bMECs,此外苦參堿可通過干預(yù)抑制NO的分泌和NF-κB的活化發(fā)揮其抗炎作用。而且,研究表明細(xì)胞因子干擾素-γ(INF-γ)和IL-1可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)大量的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白并產(chǎn)生NO,NO作為一個(gè)免疫功能分子從而發(fā)揮抗炎抗病毒作用[32]。IL-8作為一種細(xì)胞因子,在炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí),具有重要的調(diào)節(jié)作用[33],研究證明,苦參堿可顯著降低血清中IL-8含量,有效抑制中晚期舌癌術(shù)后患者炎癥反應(yīng)和腫瘤轉(zhuǎn)移[21]。由此可見,苦參堿對(duì)炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用。

    KEGG通路富集分析顯示,苦參堿在奶牛生產(chǎn)中發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制與多種信號(hào)通路等密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道,MAPK信號(hào)通路作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重要的信號(hào)傳遞方式之一,可將細(xì)胞表面的信號(hào)通過刺激傳導(dǎo)給細(xì)胞及其細(xì)胞核,參與細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程[34]。研究發(fā)現(xiàn),LPS與細(xì)胞膜表面的TLR結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,活化的NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi),從而啟動(dòng)炎癥因子如TNF-α、白細(xì)胞介素-19(IL-19)和IL-6等基因的轉(zhuǎn)錄[35]。IL-17信號(hào)依賴的基因有一種獨(dú)特的、組織特異性的模式,是奶牛體內(nèi)重要的生理功能的基礎(chǔ)[36]。有研究表明,苦參堿通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MKK)/p38 MAPK信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng),對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)暴露巨噬細(xì)胞具有良好的抗炎作用[37]。據(jù)報(bào)道,苦參堿可通過抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的生成,減少炎癥浸潤(rùn)和脫髓鞘,緩解自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)生與發(fā)展。此外,苦參堿還通過高遷移率族蛋白B1(HMGB1)/TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活發(fā)揮一定的抗炎作用[38]。此外,有研究發(fā)現(xiàn),苦參堿可通過調(diào)節(jié)Th17所誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞,抑制白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)、白細(xì)胞介素-21受體(IL-21R)以及白細(xì)胞介素-22受體1(IL-22R1)的表達(dá),對(duì)由Th17介導(dǎo)的免疫性皮膚病中發(fā)揮較好的抗炎作用[39]。然而,目前關(guān)于苦參堿對(duì)奶??寡鬃饔孟嚓P(guān)的通路研究報(bào)道較少,本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明苦參堿在奶??寡鬃饔弥械臋C(jī)制研究提供了依據(jù)。

    4 結(jié) 論

    本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)及多種生物信息學(xué)工具,對(duì)苦參堿多靶點(diǎn)、多途徑防治奶牛炎癥的互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析??鄥A發(fā)揮抗炎作用的核心靶點(diǎn)為ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6。KEGG通路富集分析結(jié)果表明,苦參堿可通過MAPK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路等發(fā)揮抗炎作用。本研究結(jié)果為苦參堿進(jìn)一步在治療奶牛炎癥相關(guān)疾病中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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