基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討苦參堿在奶牛生產(chǎn)中的抗炎作用機(jī)制

趙梓軒 楊嘉睿 蔣林樹 童津津

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

隨著居民生活水平的不斷提高，畜產(chǎn)品的安全質(zhì)量問題日益受到重視，這對(duì)我國畜牧業(yè)實(shí)現(xiàn)綠色、健康和高質(zhì)量發(fā)展提出了更高要求。在過去的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，獸用抗生素對(duì)動(dòng)物疾病的防治、養(yǎng)殖效益的提高以及畜禽產(chǎn)品的高效供應(yīng)起到了舉足輕重的作用；然而，抗生素使用不當(dāng)?shù)膯栴}也日益凸顯，對(duì)畜產(chǎn)品的質(zhì)量、公共衛(wèi)生、生態(tài)環(huán)境以及動(dòng)物健康造成了危害[1]，阻礙了我國畜牧業(yè)大力推進(jìn)綠色健康養(yǎng)殖發(fā)展的步伐。所以，尋找安全有效并且不產(chǎn)生耐藥性的抗生素替代物成為當(dāng)務(wù)之急。

苦參(SophoraflavescensAit.)在我國已經(jīng)具有兩千多年的使用歷史，作為傳統(tǒng)的中藥材其作用主要有清熱利尿和祛濕殺蟲等。據(jù)報(bào)道，苦參的主要生物活性成分為苦參堿，其同時(shí)也是發(fā)揮抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及抗炎等功能的最主要的活性物質(zhì)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，不僅是苦參，還包括苦豆、廣豆根等其他豆科植物的中藥材，它們的有效活性成分均為苦參堿，都能發(fā)揮殺菌消炎、抵抗病毒和腫瘤、殺蟲以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等多種生理功能[3]。此外，研究表明，苦參堿對(duì)斷奶仔豬腹瀉[4]、牛乳頭狀瘤病毒[5]以及小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎[6]等疾病的治療均有較好的效果?？鄥A在奶牛臨床應(yīng)用中也取得了較好的療效。據(jù)報(bào)道，苦參堿對(duì)預(yù)防和治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的效果顯著[3]，對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bMECs)增殖、凋亡及抗氧化能力有一定的影響[7]。盧金霞[8]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿對(duì)引起奶牛乳房炎的常見致病菌金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制作用，可通過干預(yù)其對(duì)bMECs的黏附作用，從而發(fā)揮苦參堿對(duì)乳腺的保護(hù)作用。

雖然中藥在疾病預(yù)防和治療方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，但是由于人們?cè)谄浒l(fā)揮療效的作用靶點(diǎn)及機(jī)制方面尚未闡明，嚴(yán)重限制了中藥的重新定位及作為新獸藥的開發(fā)利用[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)借助計(jì)算機(jī)技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)等多學(xué)科的交叉融合，形成了以網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)為核心的技術(shù)體系。據(jù)報(bào)道，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)藥物的組成成分以及作用機(jī)制進(jìn)行研究，可從生物網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)的角度來揭示藥物與疾病之間的關(guān)系[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的應(yīng)用可以提高疾病的治療效率，減少機(jī)體對(duì)相關(guān)藥物的不良反應(yīng)，提升中藥治療疾病的成功率，節(jié)約藥品研發(fā)成本[11]。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，探討苦參堿在奶牛生產(chǎn)中發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制，以期為苦參堿在奶牛生產(chǎn)中的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 苦參堿相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)是一個(gè)查找藥物、靶點(diǎn)和疾病之間的關(guān)系的有效中藥系統(tǒng)藥理平臺(tái)[12]。本文以“matrine”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，將獲取的苦參堿有效化合物作用靶點(diǎn)信息輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)和PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(即有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫，是一種化學(xué)模組的數(shù)據(jù)庫[13])。然后通過PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html)預(yù)測(cè)并得到苦參堿相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.2 炎癥相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

GeneCards是一個(gè)可檢索和集成的數(shù)據(jù)庫，可以在大量的基因與疾病、變異與蛋白質(zhì)和細(xì)胞與通路之間進(jìn)行有效鏈接[14]。DisGeNET是一個(gè)綜合和規(guī)范化各種與疾病有關(guān)的基因和有關(guān)變異的數(shù)據(jù)庫，其中包含了科學(xué)文獻(xiàn)，同時(shí)涵蓋了所有的人類疾病以及正常與不正常的特點(diǎn)[15]。以“inflammation”為關(guān)鍵詞，分別在上述2個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，獲取的交集為炎癥相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 苦參堿抗炎靶點(diǎn)可視化分析

將上述獲得的成分靶點(diǎn)、炎癥相關(guān)靶點(diǎn)上傳于Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)網(wǎng)絡(luò)在線服務(wù)器中繪制韋恩圖，獲得苦參堿-炎癥靶點(diǎn)的交集，并進(jìn)行可視化處理。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

登錄STRING數(shù)據(jù)庫上傳苦參堿抗炎靶點(diǎn)，分析苦參堿的相關(guān)靶點(diǎn)并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。STRING數(shù)據(jù)庫是現(xiàn)階段信息量最豐富，研究蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫之一，該數(shù)據(jù)庫對(duì)已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)互作信息進(jìn)行評(píng)估與整合，形成了覆蓋大于1 100生物體的綜合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。該數(shù)據(jù)庫綜合多個(gè)數(shù)據(jù)庫的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)也含有生物信息學(xué)等研究方法預(yù)測(cè)的相關(guān)研究結(jié)果。STRING數(shù)據(jù)庫依據(jù)不同證據(jù)通道的概率計(jì)算，結(jié)合隨機(jī)交互概率校正，最終綜合得分為0.4時(shí)，為中等可信度；為0.7時(shí)，為高可信度；為0.9時(shí)，為最高可信度[16]。本研究選用了評(píng)分為0.4的PPI網(wǎng)絡(luò)，即中等可信度網(wǎng)絡(luò)。登錄STRING數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入苦參堿發(fā)揮抗炎作用的潛在靶點(diǎn)并選擇“Bostaurus”物種，獲取靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系；required interaction score選擇“medium confidence(0.400)”并導(dǎo)出tsv文件；上傳tsv文件至Cytoscape 3.9.1并制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，選擇Cytoscape 3.9.1插件CytoNCA，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治霾⒌玫疥P(guān)鍵核心靶點(diǎn)，通過CytoNCA插件計(jì)算節(jié)點(diǎn)的介數(shù)，接近中心性和子網(wǎng)絡(luò)中心性，疊加3個(gè)指標(biāo)，篩選出前10%作為關(guān)鍵核心靶點(diǎn)[17]。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

登錄David數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)輸入苦參堿抗炎靶點(diǎn)，選擇“Bostaurus”物種，select identifier設(shè)置為official gene symbol，list type設(shè)置為gene list，進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，導(dǎo)出txt文件。將靶點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行降序排列，選擇生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)進(jìn)行富集分析。根據(jù)微生信在線作圖平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并制作直方圖和KEGG氣泡圖。

1.6 苦參堿-炎癥靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

Cytoscape源于系統(tǒng)生物學(xué)，其將生物分子交互網(wǎng)絡(luò)、高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)和其他的分子狀態(tài)信息綜合分析整合，最終將數(shù)據(jù)結(jié)合成可視化網(wǎng)絡(luò)[18]。本研究通過Cytoscape 3.9.1軟件(https://cytoscape.org/)導(dǎo)入苦參堿抗炎靶點(diǎn)以及相關(guān)通路信息，建立苦參堿-炎癥靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 分子對(duì)接

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)搜索苦參堿，復(fù)制苦參堿的InChIKey，登錄PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，搜索苦參堿InChIKey，下載配體苦參堿的2D結(jié)構(gòu)，保存成SDF格式；利用Chem 3D軟件轉(zhuǎn)換為mol2格式文件，導(dǎo)入Autodock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行加全氫、設(shè)置為配體(自動(dòng)分布電荷)、檢測(cè)配體的Torsion tree中的扭轉(zhuǎn)鍵、選擇扭轉(zhuǎn)鍵等處理，保存文件為pdbqt。登錄UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)復(fù)制核心靶點(diǎn)的，選擇條件應(yīng)滿足“已驗(yàn)證，物種人”。再登錄RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)，粘貼對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)Entry Name，選擇蛋白質(zhì)晶體分辨率介于2.0～3.0，下載核心靶點(diǎn)，即受體白蛋白(ALB)、腫瘤壞死因子(TNF)、MYC原癌基因堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子(MYC)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)、周期蛋白D1(CCND1)、CD44和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的PDB格式文件。同時(shí)在AutodockTools 1.5.6軟件中對(duì)核心靶點(diǎn)蛋白采用除去水、加入氫等處理方法。首先在AutodockTools 1.5.6軟件中設(shè)置Grid，選擇對(duì)應(yīng)的配體文件和受體文件，選擇半柔性對(duì)接，設(shè)置GridBox，包裹住全部受體，保存為GPF格式文件，運(yùn)行RUN AutoGrid，設(shè)置對(duì)接參數(shù)及運(yùn)算方法，保存為DPF格式文件；然后設(shè)置Dock，依次選擇配體文件、受體文件等，運(yùn)行Run Autodock，保存為DPF格式文件；最終對(duì)運(yùn)算結(jié)果進(jìn)行分析并選用自由結(jié)合能最低的結(jié)合構(gòu)象作為最佳構(gòu)象。利用PyMOL 2.5.2軟件進(jìn)行可視化處理。

1.8 細(xì)胞分組

采用DMEM-F12、10%胎牛血清(FBS)和1%青-鏈霉素培養(yǎng)基，在溫度為37 ℃的5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)bMECs。未經(jīng)處理正常培養(yǎng)的bMECs為對(duì)照組(CON組)；將無乳鏈球菌與bMECs按感染復(fù)數(shù)(MOI)50∶1、共孵育6 h為奶牛乳腺炎癥模型組(TRT組)[19-20]；參照已發(fā)表的文獻(xiàn)[21]，利用50 μg/mL的苦參堿添加無乳鏈球菌與bMECs炎癥模型共孵育6 h，為苦參堿組(MAT組)。每組3個(gè)重復(fù)。

1.9 Western blot

參照本團(tuán)隊(duì)前期報(bào)道Western blot的研究方法[22-23]，檢測(cè)CASP3和CCND1蛋白表達(dá)量的變化?？贵wCASP3(#9662)和CCND1(#55506)均購自于Cell Signaling公司。使用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)最初使用Excel 2019進(jìn)行整理，應(yīng)用軟件SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參堿炎癥靶點(diǎn)獲取結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共有10個(gè)靶點(diǎn)，通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫獲得276個(gè)靶點(diǎn)，兩者取并集共獲得282個(gè)苦參堿靶點(diǎn)。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得10 898個(gè)炎癥靶點(diǎn)，通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得467個(gè)靶點(diǎn)，兩者取并集共獲得10 900個(gè)炎癥靶點(diǎn)。

2.2 苦參堿炎癥靶點(diǎn)可視化分析

通過生物信息在線作圖平臺(tái)，分別輸入苦參堿靶點(diǎn)和炎癥靶點(diǎn)通過韋恩圖對(duì)苦參堿和炎癥靶點(diǎn)進(jìn)行可視化(圖1)。

2.3 苦參堿炎癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

將獲得的苦參堿炎癥靶點(diǎn)共71個(gè)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，限制物種為“Bostaurus”，獲取蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)。結(jié)果表明，節(jié)點(diǎn)數(shù)為71，邊數(shù)為180，預(yù)期的邊數(shù)為91，平均節(jié)點(diǎn)度值為5.07，平均局部聚類系數(shù)為0.47，PPI富集P值為2.22×10-16，保存為tsv文件。將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，根據(jù)其度值(degree)選擇排名前30繪制柱狀圖(圖3)，由圖可見degree排名前5的靶點(diǎn)主要包括ALB、TNF、MYC、CASP3及CCND1。CytoNCA插件計(jì)算節(jié)點(diǎn)中心性，篩選核心靶點(diǎn)。CytoNCA包含8種中心性，分別為介數(shù)、接近中心性、自由度、特征向量中心性、平均最短路徑長(zhǎng)度、網(wǎng)絡(luò)中心性、子網(wǎng)絡(luò)中心性和信息中心性。本研究選取介數(shù)、接近中心性和子網(wǎng)絡(luò)中心性的前10%的節(jié)點(diǎn)，并將3個(gè)中心性重疊，從而獲得具有關(guān)鍵靶點(diǎn)的子網(wǎng)絡(luò)。由表1和圖4可知，苦參堿抗炎核心靶點(diǎn)為ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6。

圖1 苦參堿炎癥靶點(diǎn)韋恩圖

ACAT2：乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶2 acetyl-CoA acetyltransferase 2；ACO1：順烏頭酸酶1 aconitase 1；IDH：異檸檬酸脫氫酶 isocitrate dehydrogenase；HSD17B4：17β-羥基類固醇4型脫氫酶 hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 4；FABP2：脂肪酸結(jié)合蛋白2 fatty acid-binding protein 2；MTAP：S-甲基-5′-硫代腺苷磷酸化酶 S-methyl-5′-thioadenosine phosphorylase；GAD：谷氨酸脫羧酶 glutamate decarboxylase；ALDH18A1：乙醛脫氫酶18家族成員A1 aldehyde dehydrogenase 18 family member A1；ODC1：鳥氨酸脫羧酶1 ornithine decarboxylase 1；HPD：4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase；PYGL：肝糖原磷酸化酶 glycogen phosphorylase, liver form；DGKA：二?；视图っ甫?diacylglycerol kinase alpha；CANT1：鈣激活核苷酸酶1 calcium activated nucleotidase 1；PRM1：魚精蛋白1 protamine 1；SYNCRIP：突觸結(jié)合蛋白結(jié)合細(xì)胞質(zhì)RNA相互作用蛋白 synaptotagmin binding cytoplasmic RNA interacting protein；SPR54：信號(hào)識(shí)別顆粒54 signal recognition particle 54；PDK3：丙酮酸脫氫酶激酶同工酶3 pyruvate dehydrogenase kinase 3；HPSE：乙酰肝素酶 heparanase；PSAP：鞘脂激活蛋白原 prosaposin；BMP7：骨形成蛋白7 bone morphogenetic protein 7；CCNA2 周期蛋白A2 cyclin A2；CAMK2A：鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶2α calcium/calmodulin dependent protein kinase 2 alpha；BCR：斷裂點(diǎn)簇集群區(qū) breakpoint cluster region；ALK：間變性淋巴瘤激酶 anaplastic lymphoma kinase；ALB：白蛋白 albumin；MYC：MYC原癌基因堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子 MYC proto-oncogene, basic helix-loop-helix transcription factor；CUL1：滯蛋白1 Cullin 1；SERPINA5：絲氨酸蛋白酶抑制劑家族A成員5 Serpin family A member 5；TPR：核蛋白易位啟動(dòng)子區(qū)域 nucleoprotein translocation promoter region；UTRN：肌營(yíng)養(yǎng)相關(guān)蛋白 Utrophin；TAB1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶結(jié)合蛋白1 transforming growth factor-β-activated kinase-binding protein 1；MMP2：基質(zhì)金屬蛋白酶2 matrix metalloproteinase 2；TTR：轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白 transthyretin；RAC1：Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1；MAPK6：絲裂原活化蛋白激酶6 mitogen-activated protein kinase 6；ESR1 雌激素受體1 estrogen receptor 1；CCND1：周期蛋白D1 cyclin D1；HBB：血紅蛋白β亞基 hemoglobin subunit beta；C8A：補(bǔ)體C8α鏈 complement C8 alpha chain；MAPKAPK2：絲裂原激活蛋白激酶激活蛋白激酶2 mitogen-activated protein kinase activated protein kinase 2；PRKCQ：蛋白激酶Cθ protein kinase C theta；CD3E：T細(xì)胞受體復(fù)合物CD3ε亞基 CD3 epsilon subunit of T-cell receptor complex；RELA：轉(zhuǎn)錄因子p65 transcription factor p65；TNF：腫瘤壞死因子 tumor necrosis factor；CASP3：半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3 Caspase-3；TJP1：緊密連接蛋白1 tight junction protein 1；DPP4：二肽基肽酶-4 dipeptidyl peptidase-4；TLL1：類Tolloid蛋白1 Tolloid like 1；INSR：胰島素受體 insulin receptor；MUC1：黏蛋白1 mucin 1；ICAM1：細(xì)胞間黏附分子1 intercellular adhesion molecule 1；IL-6：白細(xì)胞介素-6 interleukin-6；ACBD7：乙酰輔酶A結(jié)合域包含7 acyl-CoA binding domain containing 7；BCL9：B細(xì)胞淋巴瘤9 B-cell lymphoma 9；PRKD2：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶D2 Serine/threonine protein kinase D2；HMGB2：高遷移率族蛋白B2 high mobility group box 2；GTF2E1：通用轉(zhuǎn)錄因子2E亞基1 general transcription factor 2E subunit 1；HDAC8：組蛋白脫乙?；? histone deacetylase 8；ANXA1：膜聯(lián)蛋白A1 annexin A1；NMT1：N-十四烷酰轉(zhuǎn)移酶1 N-myristoyltransferase 1；PTGS1：前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1 prostaglandin-endoperoxide synthase 1；PTPRJ：蛋白酪氨酸磷酸酶受體J protein tyrosine phosphatase receptor J；VPS4B：液泡蛋白分選蛋白4B vacuolar protein sorting 4 homolog B；KLRD1：殺傷細(xì)胞凝集素樣受體D1 killer cell lectin like receptor D1；CSF2RB：集落刺激因子2受體β亞基 colony stimulating factor 2 receptor subunit beta；ALOX12：花生四烯酸12-脂氧合酶 arachidonate 12-lipoxygenase；SMAP1：基質(zhì)膜相關(guān)蛋白1 stromal membrane-associated protein 1。圖3、圖4和圖7同 the same as Fig.3, Fig.4 and Fig.7。

圖3 苦參堿炎癥潛在靶點(diǎn)度值排序

表1 苦參堿炎癥核心靶點(diǎn)

通過拓?fù)浞治觯_定苦參堿對(duì)奶牛炎癥作用相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，顏色越深，其度值越高。

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

登錄David數(shù)據(jù)庫上傳71個(gè)苦參堿抗炎靶點(diǎn)，該物種限定為“Bostaurus”，并進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析結(jié)果獲得62種BP、16種CC和12種MF。選取閾值P<0.01的條目，在微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)中導(dǎo)入GO term、Count、P-value以及分類相關(guān)數(shù)據(jù)生成BP、CC和MF三合一圖(圖5)。其中，BP主要包括細(xì)胞對(duì)過氧化氫的反應(yīng)(cellular response to hydrogen peroxide)、一氧化氮(NO)生物合成過程的正調(diào)控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、脂多糖細(xì)胞反應(yīng)(cellular response to lipopolysaccharide)、異型細(xì)胞黏附的正調(diào)控(positive regulation of heterotypic cell-cell adhesion)以及白細(xì)胞介素-8產(chǎn)生的正調(diào)控(positive regulation of interleukin-8 production)等；CC主要包括細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)和細(xì)胞外間隙(extracellular space)等；MF主要包括蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)、ATP結(jié)合(ATP binding)和質(zhì)膜(membrane)等。

圖5 GO功能富集分析

KEGG通路富集分析(圖6)共獲得22條信號(hào)通路，主要包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、核因子-κB信號(hào)通路(NF-κB signaling pathway)以及Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)等通路，與苦參堿發(fā)揮抗炎作用密切相關(guān)。

圖6 KEGG通路富集分析

2.5 苦參堿-炎癥靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將David通路注釋得到的數(shù)據(jù)，登錄Cytoscape 3.9.1軟件上傳相關(guān)數(shù)據(jù)，構(gòu)建苦參堿-炎癥靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)。Network Analyzer結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)為94，網(wǎng)絡(luò)邊數(shù)為182，網(wǎng)絡(luò)密度為0.04，網(wǎng)絡(luò)直徑為4，網(wǎng)絡(luò)半徑為2，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.74，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為1.92，特征路徑長(zhǎng)度為2.35。

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

將苦參堿相關(guān)活性成分與潛在作用靶點(diǎn)拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)圖中連接度最高的成分苦參堿與7個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，即受體為ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6，配體為苦參堿，分子對(duì)接結(jié)果見表2和圖8。結(jié)合自由能用來評(píng)估成分和靶點(diǎn)之間的結(jié)合；如果結(jié)合能小于0，則表明活性成分和靶點(diǎn)可以自由結(jié)合。研究表明，若兩者之間結(jié)合自由能較低，則兩者之間親和力較強(qiáng)[21]。通常認(rèn)為，結(jié)合自由能<-5 kcal/mol表示活性成分與作用靶點(diǎn)之間親和力良好[20]。本研究結(jié)果表明，ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6皆可與苦參堿穩(wěn)定結(jié)合，提示苦參堿與上述靶點(diǎn)之間的相互作用可能為苦參堿發(fā)揮抗炎的重要作用機(jī)制之一，需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.7 苦參堿對(duì)無乳鏈球菌誘導(dǎo)的bMECs相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

如圖9所示，與CON組相比，TRT組CASP3蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，CCND1蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與TRT組相比，MAT組CASP3蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，CCND1蛋白表達(dá)量極顯著提高(P<0.01)。

Matrine：苦參堿；Metabolic pathways：代謝通路；MAPK signaling pathway：絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路；IL-17 signaling pathway：白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路；HIF-1 signaling pathway：缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路；Hematopoietic cell lineage：造血細(xì)胞譜系；Glutathione metabolism：谷胱甘肽代謝；Citrate cycle (TCA cycle)：檸檬酸循環(huán)(三羧酸循環(huán))；Cellular senescence：細(xì)胞衰老；Carbon metabolism：碳代謝；C-type lectin receptor signaling pathway C型凝集素受體信號(hào)通路；Butanoate metabolism：丁酸鹽代謝；Biosynthesis of amino acids：氨基酸生物合成；Adherens junction：黏著連接；2-oxocarboxylic acid metabolism；2-氧羧酸代謝；Wnt signaling pathway Wnt信號(hào)通路；Toll-like receptor signaling pathway Toll樣受體信號(hào)通路；TNF signaling pathway：腫瘤壞死因子信號(hào)通路；Th17 cell differentiation：Th17細(xì)胞分化；TGF-beta signaling pathway：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路；T cell receptor signaling pathway：T細(xì)胞受體信號(hào)通路；NF-kappa B signaling pathway：核因子-κB信號(hào)通路；Neurotrophin signaling pathway：神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路。

表2 苦參堿與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

3 討 論

3.1 苦參堿抗炎關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

本研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿在奶牛生產(chǎn)中發(fā)揮抗炎的核心靶點(diǎn)為ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6。據(jù)報(bào)道，由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等特定細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子——腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，用于刺激炎癥發(fā)生，并調(diào)節(jié)細(xì)胞中引起壞死和凋亡的一系列信號(hào)調(diào)控。這種炎性因子在抵抗感染、癌癥等過程中發(fā)揮一定的作用[24]。有研究表明，苦參堿對(duì)金黃色葡萄球菌脂磷壁酸(LTA)誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎具有一定的保護(hù)作用，且呈劑量依賴性降低促炎細(xì)胞因子[TNF-α和白細(xì)胞介素-1(IL-1)]的表達(dá)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在LTA刺激的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(bEECs)的炎癥模型中，苦參堿處理可抑制Toll樣受體(TLR)2的表達(dá)及其下游核因子NF-κB的活化，從而降低炎癥損傷[25]。于曉紅等[26]建立了脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥模型，結(jié)果表明，苦參堿能顯著降低TNF-α、IL-1、IL-6和白細(xì)胞介素-8(IL-8)mRNA的表達(dá)，具有較強(qiáng)的抗炎作用。據(jù)報(bào)道，IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，通過其獨(dú)特的受體系統(tǒng)具有多種生物活性，能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[27]。此外，與本研究結(jié)果一致，丁園園等[28]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿通過調(diào)節(jié)病毒復(fù)制、凋亡和炎癥反應(yīng)作用于TNF-α、IL-6和CASP3靶點(diǎn)，從而達(dá)到治療COVID-19的目的。本研究通過Western blot結(jié)果證明，苦參堿可通過對(duì)CASP3和CCND1蛋白的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗炎作用。據(jù)報(bào)道，清肝化瘀顆粒的有效成分苦參堿以劑量依賴方式抑制了肝癌細(xì)胞的增殖[29]，對(duì)TP53和CCND1等核心靶點(diǎn)具有調(diào)節(jié)作用，對(duì)肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激脅迫標(biāo)志物產(chǎn)生影響，引起細(xì)胞凋亡。綜上可知，本研究進(jìn)一步闡明了苦參堿抗炎作用的核心靶點(diǎn)及其作用機(jī)制。

a～g分別代表苦參堿與ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6的對(duì)接示意圖。

**表示P<0.01，****表示P<0.000 1。

3.2 苦參堿炎癥GO功能和KEGG關(guān)鍵通路分析

GO功能富集分析結(jié)果表明，苦參堿發(fā)揮抗炎作用的主要靶點(diǎn)是通過過氧化氫反應(yīng)、NO生物合成過程和IL-8等途徑。這與先前的研究結(jié)果一致，苦參堿可作用于白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-17淋巴細(xì)胞或單核巨噬細(xì)胞釋放的炎性細(xì)胞因子，通過Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮作用，與提高機(jī)體抗氧化能力及降低機(jī)體氧化損傷密切有關(guān)[30]。NO作為機(jī)體重要的信號(hào)傳遞因子，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等都具有重要作用，可廣泛參與哺乳動(dòng)物的生理調(diào)節(jié)。張想軍等[31]發(fā)現(xiàn)，25～100 μg/mL的苦參堿可顯著促進(jìn)bMECs的增殖，并可抑制金黃色葡萄球菌入侵感染bMECs，此外苦參堿可通過干預(yù)抑制NO的分泌和NF-κB的活化發(fā)揮其抗炎作用。而且，研究表明細(xì)胞因子干擾素-γ(INF-γ)和IL-1可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)大量的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白并產(chǎn)生NO，NO作為一個(gè)免疫功能分子從而發(fā)揮抗炎抗病毒作用[32]。IL-8作為一種細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，具有重要的調(diào)節(jié)作用[33]，研究證明，苦參堿可顯著降低血清中IL-8含量，有效抑制中晚期舌癌術(shù)后患者炎癥反應(yīng)和腫瘤轉(zhuǎn)移[21]。由此可見，苦參堿對(duì)炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用。

KEGG通路富集分析顯示，苦參堿在奶牛生產(chǎn)中發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制與多種信號(hào)通路等密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，MAPK信號(hào)通路作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重要的信號(hào)傳遞方式之一，可將細(xì)胞表面的信號(hào)通過刺激傳導(dǎo)給細(xì)胞及其細(xì)胞核，參與細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程[34]。研究發(fā)現(xiàn)，LPS與細(xì)胞膜表面的TLR結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，活化的NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，從而啟動(dòng)炎癥因子如TNF-α、白細(xì)胞介素-19(IL-19)和IL-6等基因的轉(zhuǎn)錄[35]。IL-17信號(hào)依賴的基因有一種獨(dú)特的、組織特異性的模式，是奶牛體內(nèi)重要的生理功能的基礎(chǔ)[36]。有研究表明，苦參堿通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MKK)/p38 MAPK信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)暴露巨噬細(xì)胞具有良好的抗炎作用[37]。據(jù)報(bào)道，苦參堿可通過抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的生成，減少炎癥浸潤(rùn)和脫髓鞘，緩解自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)生與發(fā)展。此外，苦參堿還通過高遷移率族蛋白B1(HMGB1)/TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活發(fā)揮一定的抗炎作用[38]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可通過調(diào)節(jié)Th17所誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞，抑制白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)、白細(xì)胞介素-21受體(IL-21R)以及白細(xì)胞介素-22受體1(IL-22R1)的表達(dá)，對(duì)由Th17介導(dǎo)的免疫性皮膚病中發(fā)揮較好的抗炎作用[39]。然而，目前關(guān)于苦參堿對(duì)奶?？寡鬃饔孟嚓P(guān)的通路研究報(bào)道較少，本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明苦參堿在奶?？寡鬃饔弥械臋C(jī)制研究提供了依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)及多種生物信息學(xué)工具，對(duì)苦參堿多靶點(diǎn)、多途徑防治奶牛炎癥的互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析?？鄥A發(fā)揮抗炎作用的核心靶點(diǎn)為ALB、TNF、MYC、CASP3、CCND1、CD44和IL-6。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，苦參堿可通過MAPK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路等發(fā)揮抗炎作用。本研究結(jié)果為苦參堿進(jìn)一步在治療奶牛炎癥相關(guān)疾病中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。