枸杞多糖和靈芝孢子粉增強(qiáng)免疫力最佳組合劑量研究及有效成分測定

王冠玉，任 怡，孫桂菊

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，江蘇南京 210009）

0 引言

植物多糖（Plant Polysaccharide）就是植物細(xì)胞的代謝過程中所產(chǎn)生的一類生物大分子[1]。植物多糖成分常存在于藥食同源的植物和某些藥用植物或傳統(tǒng)中藥中[2]。有些植物多糖有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，對人類的健康和一些疾病的預(yù)防有著重要作用[3]。植物多糖多具備降糖降脂[4]、抗氧化[5-6]、抗腫瘤[7-9]、抗輻射等功能，還有一些植物多糖可以調(diào)節(jié)人體免疫功能，有助于增強(qiáng)機(jī)體免疫力[10-12]。

枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharide，LBP）是提取自我國藥食兩用中草藥枸杞中的重要活性成分[13]。研究表明，枸杞多糖在抗癌、降糖降脂、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等方面都有著良好的效果[14]。課題組前期在枸杞多糖的降糖降脂功能方面已經(jīng)開展了大量研究，探討了LBP 在大鼠的體內(nèi)對其組織細(xì)胞的代謝的影響及相關(guān)分布，針對LBP 有著良好的研究基礎(chǔ)[15]。研究希望進(jìn)一步發(fā)掘LBP 在增強(qiáng)免疫力方面的作用，為深入研究和利用LBP 等多糖類物質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。靈芝孢子粉（Ganoderma lucidumSpore Powder，GLSP）是靈芝成熟了以后釋放的比較小的顆粒狀的物質(zhì)，其主要營養(yǎng)成分有靈芝多糖、三萜類成分等，具有抗癌、免疫增強(qiáng)、護(hù)肝等效應(yīng)[16]。通過查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，其生理機(jī)制可能是靈芝多糖可活化T 淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）等的產(chǎn)生和釋放[17]。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前市面上大部分增強(qiáng)免疫力的保健食品中都含有枸杞多糖和靈芝孢子粉這2 種成分，且枸杞多糖和靈芝孢子粉各自對人體免疫效應(yīng)有著顯著增強(qiáng)作用。為測定其聯(lián)合作用的最佳配比劑量，首先測定各有效成分的含量，再通過相應(yīng)的免疫效應(yīng)試驗(yàn)[18]，探究枸杞多糖和靈芝孢子粉2 種成分在不同配比下免疫調(diào)節(jié)功能的強(qiáng)弱程度，找到增強(qiáng)免疫力的最佳劑量組合，為相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 枸杞多糖樣品中所含有的有效多糖的成分含量的測定

1.1.1 材料與儀器

枸杞多糖提取物；無水葡萄糖，苯酚，硫酸，乙醇，乙醚。

紫外-可見分光光度計(jì)、ME203E 型電子天平。

1.1.2 制備對照品溶液

稱25 mg 無水葡萄糖加到250 mL 的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的無水葡萄糖的水溶液[19]。

1.1.3 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取0.1 mg/mL 的所配葡萄糖溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加水至2.0 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的苯酚溶液1 m 和硫酸溶液5 mL，在室溫下靜置15 min，之后將其放于50 ℃的水浴鍋內(nèi)進(jìn)行保溫10 min，最后用紫外-可見分光光度法，于波長485 nm 處來測定各組溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。

1.1.4 測定方法

稱量本樣品0.5 g，往樣品中加入50 mL 乙醚，加熱回流，持續(xù)1 h，之后放冷，將乙醚液倒掉，殘?jiān)旁谒″亙?nèi)將剩余的乙醚揮發(fā)掉。加入50 mL的乙醇，進(jìn)行加熱回流，持續(xù)1 h，再趁熱將溶液進(jìn)行濾過，濾渣使用20 mL 的乙醇，分多次（至少3 次）洗滌，之后濾渣放在燒瓶中，加水100 mL，進(jìn)行加熱回流，持續(xù)2 h。趁熱進(jìn)行濾過，放冷，將洗滌液一并移至250 mL的容量瓶中，加水定容，搖勻后再量取1 mL，置于具塞試管內(nèi)，加入1 mL水[21]，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，從加入5%的苯酚溶液1 mL起，測吸光度，計(jì)算含量。

1.2 靈芝孢子粉樣品中所含有的多糖、總?cè)萍扮薮己繙y定

1.2.1 材料與儀器

已破壁的靈芝孢子粉、無水葡萄糖、齊墩果酸、香草醛、乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、高氯酸、甲醇。

紫外-可見分光光度計(jì)、AL204-IC 型電子天平、SC-2546 型離心機(jī)、KQ5200 型超聲波清洗器等。

1.2.2 對照品溶液的制備

（1）多糖。無水葡萄糖加蒸餾水配成質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL 的無水葡萄糖的溶液[22]。

（2）三萜及甾醇。適量的齊墩果酸加入甲醇配成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 齊墩果酸溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

（1）多糖。精密吸取所配對照品溶液，分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，加入蒸餾水2 mL，硫酸蔥酮溶液6 mL，搖勻靜置15 min，冰浴冷卻15 min，然后用紫外-可見分光光度法，在適宜的波長處測定各組溶液的吸光度，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）三萜及甾醇。精密吸取所配的齊墩果酸溶液，分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL，揮干后再將其放冷，分別加入香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，再分別加入高氯酸溶液0.8 mL，放于50 ℃的水浴鍋中10 min，再冰浴5 min，各加乙酸乙酯溶液2 mL，最后用紫外-可見分光光度法，于波長546 nm 處測定其吸光度，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線[23]。

1.2.4 供試品溶液的制備

（1）多糖。將2 g 樣品粉末放在250 mL 的圓底燒瓶中，加50 mL 水后，在室溫下靜置1 h，同時(shí)搭建加熱回流裝置，靜置結(jié)束后令其加熱回流持續(xù)4 h，之后過濾洗滌，再加50 mL 水加熱回流持續(xù)2 h，再過濾揮干，往殘?jiān)锛尤胍掖?00 mL，然后搖勻，在25 ℃條件下放10 h，離心，把上清倒掉，加適量的熱水溶解后放到100 mL 的容量瓶中，定容后吸取適量該溶液，離心取上清2 mL，置于25 mL 的容量瓶中定容。

（2）三萜及甾醇。稱取5 g 樣品，加100 mL 乙醇，超聲1 h，過濾，之后將濾液置于200 mL 的量瓶，乙醇分多次（至少3 次）洗滌濾渣，洗滌液用引流棒全部倒入容量瓶，最后加入乙醇定容。

1.2.5 測定方法

（1）多糖。吸取2 mL 剛剛配制的供試品溶液，依據(jù)標(biāo)上述方法，從“加入6 mL 的硫酸蔥酮溶液”開始，試驗(yàn)操作步驟完全一致，測定所配置的供試品溶液的吸光度，帶入公式計(jì)算含量。

（2）三萜及甾醇。精密地量取剛剛新配制0.5 mL所配供試品溶液，轉(zhuǎn)移到15 m：試管內(nèi)，依據(jù)上述方法，從“揮干”開始，試驗(yàn)操作步驟完全一致，測定所配置的供試品溶液的吸光度，帶入公式計(jì)算含量。

1.3 試驗(yàn)項(xiàng)目

單核-巨噬細(xì)胞功能的相關(guān)測定[24]：小鼠碳廓清試驗(yàn)。

1.3.1 原理

在一定的范圍內(nèi)，經(jīng)小鼠尾靜脈注射擴(kuò)散至全身的碳顆粒在一定時(shí)間內(nèi)含量會遞減，減少的速率通過內(nèi)眥靜脈血中的碳濃度反應(yīng)，減少得越快，光密度值相差越大，細(xì)胞吞噬能力越強(qiáng)。

1.3.2 試驗(yàn)動物

18～22 g BALB/C 小鼠，SPF 級，雄性，每組10 只，共90 只，隨機(jī)分組。

1.3.3 劑量設(shè)計(jì)和選擇

根據(jù)文獻(xiàn)資料，選擇枸杞多糖和靈芝孢子粉的劑量范圍[25-32]。

枸杞多糖與靈芝孢子粉復(fù)方二因素六水平見表1。

表1 枸杞多糖與靈芝孢子粉復(fù)方二因素六水平/ mg·kg-1 BW

1.3.4 將試驗(yàn)動物進(jìn)行隨機(jī)分組

采用均勻設(shè)計(jì)法，以枸杞多糖和靈芝孢子粉為組成，設(shè)計(jì)二因素六水平均勻設(shè)計(jì)表，同時(shí)設(shè)置陰性對照組。同時(shí)設(shè)置一組枸杞多糖700 mg/kg BW（不添加靈芝孢子粉），另一組靈芝孢子粉700 mg/kg BW（不添加枸杞多糖），共9 組。為期45 d。

枸杞多糖與靈芝孢子粉復(fù)方二因素六水平的均勻設(shè)計(jì)見表2。

表2 枸杞多糖與靈芝孢子粉復(fù)方二因素六水平的均勻設(shè)計(jì)/ mg·kg-1 BW

1.3.5 溶液配制

將現(xiàn)配5 mL 印度墨汁中加入提前準(zhǔn)好的生理鹽水20 mL。

配制Na2CO3溶液時(shí)，用天平準(zhǔn)確精密地稱取0.2 g Na2CO3粉末，轉(zhuǎn)移至200 mL 容量瓶中，然后加入蒸餾水至刻度線定容。

1.3.6 注射墨汁

找準(zhǔn)小鼠的尾部靜脈，按照規(guī)定的劑量注射（10 mL/kg BW）[33]，一旦成功注入了試驗(yàn)小鼠的尾巴，進(jìn)入全身血液，則立即使用計(jì)時(shí)器開始計(jì)時(shí)。

1.3.7 測定

一共從小鼠的內(nèi)眥靜脈叢取2 次血，成功地注入印度墨汁后的2 min 為第一次取血，取血量為每次20 μL。使用分光光度計(jì)在適宜的波長600 nm 處測其OD1。在取完第1 次血后再計(jì)時(shí)8 min，到點(diǎn)重復(fù)上述操作測其OD2，兩者進(jìn)行比較。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

吞噬速率用K 表示，計(jì)算公式如下，若受試樣品組K 值顯著高過對照組K 值，則可以判斷這項(xiàng)試驗(yàn)的結(jié)果陽性。因?yàn)閯游锉旧淼捏w重和肝脾質(zhì)量會影響小鼠清除體內(nèi)碳顆粒的速率，所以一般是采用校正的吞噬指數(shù)來表示小鼠碳廓清的能力（見下式）。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞多糖有效成分質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定結(jié)果

以葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法測枸杞多糖有效成分的質(zhì)量濃度，以5 組質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為橫坐標(biāo)，將其不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度作為縱坐標(biāo)，可以得到以下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所測得的樣品吸光度為0.412，計(jì)算可得樣品枸杞多糖有效成分質(zhì)量濃度為0.42 mg/mL。

枸杞多糖有效成分質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 枸杞多糖有效成分質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 靈芝孢子粉樣品中多糖、總?cè)萍扮薮假|(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定結(jié)果

以葡萄糖為對照品測靈芝孢子粉多糖的質(zhì)量濃度，以5 組標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，取其吸光度為縱坐標(biāo)，描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品吸光度為0.247，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣品靈芝孢子粉多糖質(zhì)量濃度為0.349 mg/mL。

靈芝孢子粉多糖質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 靈芝孢子粉多糖質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用齊墩果酸作為對照品來進(jìn)行靈芝孢子粉總?cè)萍扮薮假|(zhì)量濃度的檢測，以5 組不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為橫坐標(biāo)，取其吸光度為縱坐標(biāo)，描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品吸光度為0.576，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得樣品靈芝孢子粉總?cè)萍扮薮假|(zhì)量濃度為0.308 mg/mL。

靈芝孢子粉總?cè)萍扮薮己繙y定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 靈芝孢子粉總?cè)萍扮薮假|(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 小鼠碳廓清試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 試驗(yàn)結(jié)果

45 d 干預(yù)結(jié)束后，進(jìn)行碳廓清試驗(yàn)。

各組吞噬指數(shù)、體重、肝指數(shù)和脾指數(shù)結(jié)果比較見表3。

表3 各組吞噬指數(shù)、體重、肝指數(shù)和脾指數(shù)結(jié)果比較

2.3.2 直觀分析法評價(jià)結(jié)果

吞噬指數(shù)能夠直觀反映吞噬細(xì)胞的吞噬活力，也即是機(jī)體非特異性免疫的能力，如果以吞噬指數(shù)作為評價(jià)免疫功能的標(biāo)準(zhǔn)，可知單獨(dú)700 mg/kg 的LPB 組為最優(yōu)組。

脾指數(shù)代表了小鼠免疫器官的相對大小，是衡量機(jī)體免疫功能的指標(biāo)之一，肝指數(shù)則可以反映小鼠的肝臟功能。如果以脾指數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，可知LBP 700 mg/kg GLSP 350 mg/kg 組為最優(yōu)組；如果以肝指數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，可知單獨(dú)700 mg/kg 的LPB 組為最優(yōu)組。

2.3.3 多元二項(xiàng)式回歸模型分析結(jié)果

考慮到LPB 和GLSP 之間可能存在的聯(lián)合作用和其他數(shù)學(xué)關(guān)系，結(jié)合研究實(shí)際，回歸模型確定為二次二項(xiàng)式回歸模型，依據(jù)二項(xiàng)式回歸模型，回歸方程為[34]：

在SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件中采用逐步后退法，LBP 得到吞噬指數(shù)的回歸方程為：

偏回歸系數(shù)R=0.885，決定系數(shù)Rr=0.783，說明該模型對數(shù)據(jù)的擬合程度較高。

同樣，脾指數(shù)的回歸方程為：

偏回歸系數(shù)R=0.942，決定系數(shù)R2=0.888，說明該模型對數(shù)據(jù)的擬合程度較高。

肝指數(shù)與LBP 和GLSP 的關(guān)系不符合線性模型，無法求得回歸方程。

2.3.4 通過回歸方程尋找最佳因素水平組合

本均勻設(shè)計(jì)是36 個(gè)全面試驗(yàn)的部分實(shí)施，其中最好的試驗(yàn)點(diǎn)為單獨(dú)700 mg/kg 的LPB 組（吞噬指數(shù)最高、肝指數(shù)最低）或LBP 700 mg/kg GLSP 350 mg/kg組（脾指數(shù)最高）。但這種組合不一定是全局最優(yōu)，試圖通過回歸方程找到更好的組合。

由于在查閱文獻(xiàn)資料的過程中沒有找到吞噬系數(shù)和脾指數(shù)在評價(jià)小鼠免疫功能時(shí)的權(quán)重分布，所以將進(jìn)行分別討論。

使用Excel 提供的規(guī)劃求解工具，根據(jù)回歸方程計(jì)算出能夠獲得最大吞噬指數(shù)的最優(yōu)組合，即LBP 700 mg/kg GLSP 35 mg/kg 組。

吞噬指數(shù)的規(guī)劃求解結(jié)果見表4。

表4 吞噬指數(shù)的規(guī)劃求解結(jié)果

同時(shí)由于是優(yōu)化試驗(yàn)，也用Surfer 11 畫出了吞噬指數(shù)的等值線圖。

吞噬指數(shù)的等值線圖見圖4。

圖4 吞噬指數(shù)的等值線圖

同理，使用Excel 規(guī)劃求解工具求得能夠獲得最大脾指數(shù)的最優(yōu)組合，即LBP 700 mg/kg GLSP 700 mg/kg。

脾指數(shù)的規(guī)劃求解結(jié)果見表5，脾指數(shù)的等值線圖見圖5。

表5 脾指數(shù)的規(guī)劃求解結(jié)果

圖5 脾指數(shù)的等值線圖

3 結(jié)論

均勻設(shè)計(jì)法主要考慮試驗(yàn)點(diǎn)“均勻分散性”，而不是“整齊可比性”，因此它能大幅度減少試驗(yàn)次數(shù)，提高試驗(yàn)效率，但同時(shí)也因此使得組間可比性降低。均勻設(shè)計(jì)常使用多元回歸分析，通過擬合回歸模型預(yù)測最佳試驗(yàn)結(jié)果，精確度較高但過程較為復(fù)雜，且目前均勻設(shè)計(jì)回歸分析的一般步驟與方法尚不明晰[35]。

試驗(yàn)為配方優(yōu)化試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，單純700 mg/kg 的LPB 組的吞噬指數(shù)平均得分為4.789＞4.758。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是：均勻設(shè)計(jì)法以及后續(xù)的回歸分析時(shí)沒有并且也不應(yīng)該包含單獨(dú)700 mg/kg 的LPB 組，因此擬合回歸方程的過程中不涉及單獨(dú)LBP 700 mg/kg 組，求得的最優(yōu)解LBP 700 mg/kg GLSP 350 mg/kg 組與單獨(dú)700 mg/kg的LPB 組不可比。根據(jù)回歸方程求得的脾指數(shù)最大組合為LBP 700 mg/kg GLSP 700 mg/kg，此時(shí)脾指數(shù)為4.851 大于9 組試驗(yàn)點(diǎn)中的最大值4.788。

從產(chǎn)品研發(fā)的角度來說，并不需要一味追求吞噬指數(shù)或脾指數(shù)的最大化，相關(guān)保健食品應(yīng)該在綜合考慮LBP 和GLSP 的原料成本的基礎(chǔ)上，找到最合適的相對免疫促進(jìn)最大化的配比組合。從等值線圖的結(jié)果來看，LBP 180 mg/kg GLSP 80 mg/kg 就可以達(dá)到4.55 左右的吞噬指數(shù)水平，相比于空白對照組已經(jīng)提升了15%，應(yīng)該是最具性價(jià)比的配比方案。雖然存在邊際效益遞減，但如果研發(fā)商需要做出差異化、區(qū)分度，也可以選擇更高水平的LBP 和GLSP配比。

根據(jù)脾指數(shù)的回歸方程和等值線圖可以看出，相比于GLSP，LBP 對于脾指數(shù)的影響更大且更為均衡，因此在不考慮兩者原料價(jià)格的情況下，應(yīng)該首選增加LBP 含量來獲得的免疫效應(yīng)增加。肝指數(shù)可以衡量小鼠肝臟的健康程度，也會影響碳廓清試驗(yàn)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬速率，但是在回歸分析中肝指數(shù)沒有表現(xiàn)出與LBP 和GLSP 之間存在線性或非線性回歸關(guān)系，所以將其作為次級指標(biāo)，在主要指標(biāo)相同時(shí)輔助選擇。

吞噬指數(shù)反映機(jī)體單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能，脾指數(shù)反映脾臟的發(fā)育情況，與機(jī)體的細(xì)胞免疫能力有關(guān)，兩者代表機(jī)體免疫功能不同方面，因此無法通過權(quán)重法合并。綜合考慮兩者，免疫功能最大化的組合應(yīng)該為LBP 700mg/kg GLSP 700 mg/kg，考慮原料成本的最具性價(jià)比組合應(yīng)該在LBP 500 mg/kg GLSP 200 mg/kg 左右。