牛至精油微膠囊的制備及其在抗菌食品包裝紙中的應(yīng)用

潘高峰 宋 陽 白亮亮 李永輝 寧語蘋

（1.牡丹江恒豐紙業(yè)股份有限公司，黑龍江牡丹江，157013；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱，150040）

隨著社會的發(fā)展，食品行業(yè)對產(chǎn)品包裝材料的選擇越來越重視。由于塑料對人體健康存在潛在威脅，并且具有難降解、污染大等特點，近年來，國內(nèi)外市場已逐步禁止塑料直接用于食品包裝。2020 年1 月，國家發(fā)改委、生態(tài)環(huán)境部發(fā)布《關(guān)于進一步加強塑料污染治理的意見》，被稱為“新限塑令”[1]。食品包裝紙作為一種綠色環(huán)保的包裝材料，成為了塑料等不可降解包裝材料的最佳替代品。食品包裝紙的主要作用是保護食品不受損壞，以及防止微生物滋生，延長食品的保存期。因此，食品包裝紙的綠色可持續(xù)性和抑菌作用非常重要[2-3]?？咕称钒b紙的應(yīng)用給人們的生活帶來了極大便利，能夠減少食品因發(fā)霉而變質(zhì)的情況發(fā)生[4]。

羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）是β-環(huán)糊精的醚化產(chǎn)物。通過在β-環(huán)糊精中引入羥丙基，使β-環(huán)糊精的分子內(nèi)環(huán)狀氫鍵被破壞，水溶性提高，同時維持了環(huán)糊精的空腔。HP-β-CD 具有包合能力強、刺激性小、安全性高等優(yōu)點，是近年來發(fā)展較快的一種綠色包埋材料[5-6]。

牛至精油是從牛至植物的根、莖、葉中提取純化得到的黃紅色或棕紅色精油，其主要成分是香芹酚和百里酚[7-8]，具有廣譜殺菌、生物降解和安全無毒等優(yōu)點，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等具有一定的抗菌和殺菌作用[9]，但其沸點低、易揮發(fā)。因此，可以通過將其微膠囊化，提高穩(wěn)定性，使其便于生產(chǎn)和應(yīng)用[10]。

本研究以HP-β-CD為壁材，牛至精油為芯材，通過飽和水溶液法制備牛至精油-HP-β-CD微膠囊及微膠囊復(fù)合涂料，涂布制備具有抑菌性能的抗菌食品包裝紙。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HP-β-CD（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，上海麥克林生物科技有限公司）；牛至精油（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，上海源葉生物科技有限公司）；殼聚糖（脫乙酰度≥95%，上海麥克林生物科技有限公司）；陽離子淀粉（牡丹江恒豐紙業(yè)有限公司）；戊二醛（質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；丙三醇（分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒速攪拌器（S-212型，上海申勝生物技術(shù)有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-I型，天津市泰斯特儀器有限公司）；冷凍干燥機（SCIENTZ-12N型，寧波新芝生物科技股份有限公司）；紫外可見分光光度計（UV-Vis，Carry100型，北京普析通用儀器有限公司）；掃描電子顯微鏡（SEM，QUANTA200型，美國FEI公司），傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，F(xiàn)rontier 型，PerkinElmer 公司）；熱重分析儀（TG209F3 型，德國耐馳公司）；涂布機（K303型，英國RK 公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9146MBE型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；電熱式壓力蒸汽滅菌鍋（XFH-40CA型，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）；Boxum超凈工作臺（SW-CJ-2型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 牛至精油-HP-β-CD微膠囊的制備

將8 g HP-β-CD 加入至40 mL 蒸餾水中完全溶解，恒速攪拌下，逐滴加入牛至精油的無水乙醇溶液（體積比1∶1），并在一定溫度下攪拌一段時間后置于4 ℃冰箱過夜，用少量的乙酸乙酯萃取未包合的牛至精油，樣品冷凍干燥24 h，得到牛至精油-HP-β-CD 微膠囊（以下簡稱微膠囊）[11-12]。

1.3.2 包合率及產(chǎn)率

以無水乙醇為參比樣，用UV-Vis 測試牛至精油的最大吸收波長為277 nm。

配制0.5～2.5 μL/mL 牛至精油的無水乙醇溶液，在波長277 nm 處測定牛至精油的吸光度值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.341X+0.0101（R2=0.9997）[13-14]。

取0.1 g 微膠囊于30 mL 離心管中，加入10 mL 無水乙醇，超聲震蕩20 min，靜置12 h后，以2500 r/min的速度離心15 min，取1 mL上清液置于25 mL容量瓶中，使用無水乙醇定容，在277 nm 處測定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到微膠囊中牛至精油的含量。通過式(1)和式(2)計算包合率及產(chǎn)率[15]。

式中，A表示微膠囊中牛至精油的含量，g；m表示微膠囊的質(zhì)量，g；B表示HP-β-CD 的添加量，g；M表示牛至精油的添加量，g。

1.3.3 正交實驗

選取芯壁比、包合時間、包合溫度作為包合條件的主要因素及確定水平范圍，以包合率為指標(biāo)，進行3 因素4 水平正交實驗，因素和水平如表1 所示，探討最佳制備工藝。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Orthogonal experiment factor level table

1.4 抗菌食品包裝紙的制備

1.4.1 微膠囊復(fù)合涂料的制備

向50 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液中加入0.5 g 殼聚糖，使其充分溶解，得到殼聚糖溶液；將10 g陽離子淀粉于100 mL熱水中糊化，制備淀粉膠黏劑；將殼聚糖溶液和淀粉膠黏劑按體積比1∶2均勻混合，作為涂料膠黏劑。向涂料膠黏劑中加入少量甘油，于50 ℃下均勻攪拌，加入9 g 最優(yōu)條件下制備的微膠囊，以500 r/min 攪拌20 min，得到具有抗菌性能的微膠囊復(fù)合涂料[16]。

1.4.2 抗菌食品包裝紙的制備

采用線棒涂布機以3 m/min的速度將涂料均勻地涂布在原紙表面，80 ℃下干燥，制得抗菌食品包裝紙。原紙定量52 g/m2，涂布量2.77 g/m2。采用相同實驗方法，采用不添加微膠囊的涂料制備的紙張命名為涂布紙。

1.5 微膠囊緩釋性能

稱量一定質(zhì)量的微膠囊，采用紫外分光光度法，按式(3)計算微膠囊中牛至精油的保留率（Y）。

式中，v0表示微膠囊中牛至精油的初始含量，g/L；vt表示緩釋t時間后微膠囊中牛至精油的含量，g/L。

1.5.1 不同溫度下微膠囊的緩釋性能

將盛有一定質(zhì)量微膠囊的稱量瓶置于干燥器中，控制環(huán)境相對濕度為33%，然后將干燥器分別放在恒溫5、26、45 ℃環(huán)境中，每12 h 對干燥器進行1 次換氣，以排放緩釋出的牛至精油，在緩釋第5、10、15、20、30、40、50、60、70 天測量微膠囊中牛至精油的保留率。

1.5.2 不同濕度下微膠囊的緩釋性能

將盛有一定質(zhì)量微膠囊的干燥器置于26 ℃控溫培養(yǎng)箱中，控制環(huán)境達到不同的相對濕度（33%、52%、71%），采用與1.5.1 相同的表征方法和緩釋時間測量微膠囊中牛至精油的保留率。

1.5.3 不同儲存條件下微膠囊的緩釋性能

將盛有一定質(zhì)量微膠囊的干燥器置于26 ℃、相對濕度33%條件下，采用與1.5.1 相同的表征方法，緩釋第5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90和100天測量微膠囊中牛至精油的保留率。

1.5.4 高溫下微膠囊牛至精油的保留率

將盛有一定質(zhì)量微膠囊的稱量瓶置于100 ℃的不同烘箱中，分別稱量緩釋第0、10、20、30、40、50、60、70 min時的質(zhì)量，由式(4)計算微膠囊中牛至精油的保留率（Y’）。

式中，m0表示樣品初始質(zhì)量，g；mt表示緩釋t時間后樣品質(zhì)量，g。

1.6 抑菌實驗

1.6.1 微膠囊最小抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC）

參照GB/T 21510—2008測試微膠囊的MIC。首先配制14.0、7.0、3.5、1.8、0.9、0.4 和0.2 g/L 微膠囊懸浮液，與營養(yǎng)肉湯的液體培養(yǎng)基按體積比1∶1 混合，然后取0.1 mL 含菌量約105CFU/mL 菌懸液，接種于含有微膠囊的液體培養(yǎng)基試管中，將其作為實驗組；加入無菌水和菌液的培養(yǎng)基為對照組；將實驗組與對照組置于37 ℃培養(yǎng)箱中，1000 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)24 h，肉眼觀察試管中細(xì)菌的生長情況，即觀察液體是否渾濁，未出現(xiàn)渾濁的微膠囊懸浮液最低濃度為MIC[17-18]。取100 μL 微膠囊懸浮液轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)瓊脂的固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)24 h 后，觀察菌落生長情況，導(dǎo)致99.9%以上細(xì)菌死亡的微膠囊懸浮液最低濃度為MBC[19]。

1.6.2 抑菌圈

參照GB/T 39101—2020及相關(guān)文獻[20]，在無菌條件下，用營養(yǎng)瓊脂配制保存菌種的斜面，將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌在斜面培養(yǎng)基上進行活化，用生理鹽水配制成104CFU/mL 左右的菌懸液，震蕩搖勻。取200 μL 菌懸液均勻涂布在倒好營養(yǎng)瓊脂的培養(yǎng)皿上。以原紙為對照組，涂布紙和抗菌食品包裝紙為實驗組，每組做3 個平行樣，將實驗組與對照組進行2 h 的紫外滅菌后，貼在含菌平板的中央，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實驗

進行正交實驗以分析各因素相互間的影響和優(yōu)化最佳包合條件，結(jié)果如表2 所示。由表2 極差分析可知，各因素對包合率影響順序是B＞C＞A，即包合時間＞包合溫度＞芯壁比。獲得微膠囊的最佳制備工藝為B3C2A3，即包合時間3 h、包合溫度50 ℃、芯壁比1∶8。在此工藝條件下制備微膠囊，進行再次驗證，微膠囊的包合率達83.69%。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experimental test

2.2 微膠囊的表征與分析

2.2.1 形貌表征

對HP-β-CD 及微膠囊進行顯微鏡及SEM 觀察，如圖1 所示。由圖1(a)～圖1(c)可知，包合前HP-β-CD為球狀，中空球體較大且尺寸不均勻（直徑30～140 μm，多分布在60～80 μm），有較大的內(nèi)腔，壁厚，球壁具有發(fā)達的孔隙。HP-β-CD 固體粉末溶于水后，以7個葡萄糖單元的小分子結(jié)構(gòu)分散在水溶液中。由圖1(d)可知，包合芯材后的微膠囊，形態(tài)近似球體，失去了原有的表面光滑結(jié)構(gòu)，體積變小，直徑10 μm以內(nèi)。

圖1 HP-β-CD及微膠囊的顯微鏡和SEM圖Fig.1 Microscope and SEM images of HP-β-CD and microcapsules

2.2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

圖2 為微膠囊、HP-β-CD 和牛至精油在波數(shù)500～4000 cm-1范圍內(nèi)的FT-IR譜圖。牛至精油的特征峰主要為3314 cm-1處的O—H鍵伸縮振動吸收峰，2964 cm-1處的C—H 鍵伸縮振動吸收峰，1591 cm-1處烯烴C==C 和1421 cm-1處的芳香族C==C[21]。HP-β-CD在3345 cm-1處出現(xiàn)O—H 鍵伸縮振動吸收峰，2920 cm-1處出現(xiàn)C—H 鍵伸縮振動吸收峰，1151 cm-1、1079 cm-1、1020 cm-1處出現(xiàn)C—O 鍵伸縮振動吸收峰。微膠囊的FT-IR 譜圖中，HP-β-CD和牛至精油的吸收峰均發(fā)生了變化，O—H鍵伸縮振動吸收峰從3345 cm-1移動到3337 cm-1，C—H鍵伸縮振動吸收峰從2920 cm-1移動到2924 cm-1，C—O鍵伸縮振動吸收峰從1020 cm-1移動到1023 cm-1。由于在微膠囊中牛至精油的特征峰受到了一定的遮蔽，微膠囊主要呈現(xiàn)HP-β-CD的FT-IR特征峰。以上分析表明，牛至精油成功被HP-β-CD包合。

圖2 微膠囊、HP-β-CD和牛至精油FT-IR譜圖Fig.2 FT-IR spectra of microcapsules,HP-β-CD and oregano essential oil

2.2.3 熱穩(wěn)定性分析

圖3 為微膠囊和HP-β-CD 的熱重分析曲線。由圖3 可知，微膠囊和HP-β-CD 的熱質(zhì)量損失主要分為4 個階段：①30～100 ℃之間，微膠囊和HP-β-CD均發(fā)生不同程度的熱質(zhì)量損失，主要是樣品中水分蒸發(fā)；②100～300 ℃之間，HP-β-CD 的質(zhì)量損失較小，微膠囊的質(zhì)量損失較明顯，主要是所包合的牛至精油隨著溫度的升高而揮發(fā)；③300～350 ℃之間，主要是HP-β-CD 分子的共價鍵遭到破壞，聚合物分子鏈部分?jǐn)嗔?，HP-β-CD 分子開始熱降解，造成大量的質(zhì)量損失；④350～600 ℃之間，HP-β-CD 繼續(xù)熱降解，由于其結(jié)構(gòu)疏松，熱降解比較徹底，殘留質(zhì)量非常少；而微膠囊由于芯材組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜，高溫下焦化程度不同，或與壁材有熱反應(yīng)，使其殘余量較單純壁材增多。熱質(zhì)量損失的過程說明HP-β-CD 對牛至精油具有很好的保護作用，尤其100 ℃內(nèi)，對防止其揮發(fā)非常有效，形成微膠囊后牛至精油的穩(wěn)定性得到了提高。

圖3 微膠囊、HP-β-CD熱重分析圖Fig.3 Thermogravimetric analysis of microcapsules and HP-β-CD

2.3 牛至精油微膠囊的緩釋性能

2.3.1 溫度對微膠囊緩釋性能的影響

圖4(a)為溫度5 ℃、26 ℃、45 ℃下，微膠囊中牛至精油的保留率隨時間變化的趨勢。由圖4(a)可以看出，溫度對微膠囊中牛至精油的釋放具有一定的影響。微膠囊在溫度5 ℃、26 ℃和45 ℃條件下，緩釋70天后，微膠囊中牛至精油的保留率分別為82.04%、79.37%和77.01%。由上述結(jié)果可知，溫度影響分子的布朗運動，溫度越高，分子的布朗運動越劇烈，加快了牛至精油從微膠囊逸出的速度。溫度越高，對HP-β-CD 的破壞越大，加快微膠囊中牛至精油的釋放，使其保留率降低。因此微膠囊應(yīng)保存在較低溫度環(huán)境中。

圖4 不同因素對微膠囊保留率的影響Fig.4 Effect of different factors on the retention of microcapsules

2.3.2 相對濕度對微膠囊緩釋性能的影響

圖4(b)相對濕度為33%、52%、71%的條件下，微膠囊中牛至精油的保留率隨時間變化的趨勢。由圖4(b)可以看出，相對濕度對微膠囊中牛至精油的釋放影響較大。微膠囊在相對濕度33%、52%和71%條件下，緩釋70 天后，微膠囊中牛至精油的保留率分別為79.37%、75.67%和72.48%。由上述結(jié)果可知，相對濕度越大，微膠囊中牛至精油的保留率越小。這是由于HP-β-CD具有一定的吸濕性，易吸水膨脹，減少了對微膠囊中牛至精油的保護，導(dǎo)致微膠囊中牛至精油的保留率逐漸降低。因此微膠囊應(yīng)保存在干燥環(huán)境中。

2.3.3 儲存時間對微膠囊緩釋性能的影響

圖4(c)為溫度26 ℃、相對濕度33%條件下微膠囊中牛至精油隨時間釋放的保留率曲線。由圖4(c)可以看出，隨著緩釋時間的延長，微膠囊中牛至精油的保留率逐漸降低。微膠囊中牛至精油在緩釋0～20 天時釋放速率較快，這可能是HP-β-CD表面少量的牛至精油快速揮發(fā)；緩釋20 天后，微膠囊中牛至精油揮發(fā)較慢，緩釋效果較好；緩釋100天后，微膠囊中牛至精油的保留率為72.14%。因此微膠囊化對于牛至精油的保存極為有利，可以抑制牛至精油的揮發(fā)，起到了緩釋的效果和作用。

2.3.4 微膠囊高溫穩(wěn)定性

圖4(d)為100 ℃下牛至精油和微膠囊的保留率曲線。由圖4(d)可以看出，在高溫條件下，牛至精油的揮發(fā)速率與時間幾近線性增加，前40 min微膠囊中牛至精油的揮發(fā)速率較快，可能是壁材表面的牛至精油揮發(fā)所致，40 min后微膠囊中牛至精油的揮發(fā)速率趨于平緩和穩(wěn)定。70 min 時，牛至精油的保留率達4.33%，微膠囊中牛至精油的保留率41.52%。因此，微膠囊化對牛至精油具有顯著的緩釋和保護作用，并提高了牛至精油的熱穩(wěn)定性。

2.4 抑菌性能分析

2.4.1 微膠囊抗菌活性

微膠囊對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度實驗結(jié)果如圖5 所示。從圖5 可以看出，微膠囊對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為3.5 g/L，最小殺菌濃度為3.5 g/L；對大腸桿菌的最小抑菌濃度為7.0 g/L，最小殺菌濃度為7.0 g/L。微膠囊對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有良好的抑菌效果。

圖5 最小抑菌濃度Fig.5 Minimum inhibitory concentration

2.4.2 抑菌圈

抑菌圈的直徑大小從一定程度上代表抑菌能力，本研究制備材料的抑菌圈實驗結(jié)果如圖6所示。由圖6 可知，制備的抗菌食品包裝紙對金黃色葡萄球的抑菌圈為3 mm，對大腸桿菌的抑菌圈為2 mm，原紙對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均未出現(xiàn)明顯的抑菌圈，可能是由于涂布配方中殼聚糖的加入量較少的原因。本研究制備的抗菌食品包裝紙對2種目標(biāo)菌均有較好的抑制作用，對金黃色葡萄球菌效果更好。

圖6 紙張對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈Fig.6 Bacterial inhibition circles of paper against S.aureus and E.coli.

3 結(jié)論

本研究以羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）為壁材，牛至精油為芯材，通過飽和水溶液法制備牛至精油-HP-β-CD 微膠囊，與涂料復(fù)合涂布制備抗菌食品包裝紙。探究了微膠囊制備的最佳工藝條件，以及制備的微膠囊和抗菌食品包裝紙對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌性能。

3.1 牛至精油-HP-β-CD 微膠囊的最佳制備條件為芯壁比1∶8、包合溫度50 ℃、包合時間3 h，此條件下制備的微膠囊達到最大包合率，為83.69%。

3.2 微膠囊具有良好的緩釋性能和高溫穩(wěn)定性，在相對濕度33%、溫度26 ℃下，緩釋70 天后微膠囊中牛至精油的保留率為79.37%；儲存100 天后微膠囊中牛至精油的保留率為72.14%。牛至精油微膠囊化具有顯著的緩釋作用和效果。

3.3 微膠囊對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有一定的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為3.5 g/L，最小殺菌濃度為3.5 g/L；對大腸桿菌的最小抑菌濃度為7 g/L，最小殺菌濃度為7 g/L。制備的抗菌涂布紙對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈分別是3 mm和2 mm，具備良好的抑菌效果。