13C-2H雙同位素示蹤法研究未漂硫酸鹽漿中殘余木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

路德勝 張 凱 陳旭東 謝益民

（湖北工業(yè)大學(xué)制漿造紙研究院，湖北武漢，430068）

制漿是造紙工業(yè)中的重要一環(huán)，其中硫酸鹽法制漿是最常用的制漿工藝。硫酸鹽法制漿過程可以去除木材中約97%的木質(zhì)素[1]，但在硫酸鹽漿中仍然存在相當(dāng)一部分殘余木質(zhì)素，主要是由于木質(zhì)素間形成的縮合結(jié)構(gòu)及與多糖類物質(zhì)形成的木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合體（LCC），嚴(yán)重阻礙了木材組分的選擇性分離[2-4]。從紙漿中分離出殘余木質(zhì)素，能夠更好地了解硫酸鹽制漿的脫木質(zhì)素原理及殘留在紙漿中的木質(zhì)素和LCC化學(xué)鍵連接的信息[1]，對制漿過程中木質(zhì)素的深度去除具有重要意義[5-6]。從紙漿中分離殘余木質(zhì)素一般不需要球磨，避免機械研磨造成木質(zhì)素結(jié)構(gòu)改變[7-8]。從紙漿中分離殘余木質(zhì)素有酸水解和酶水解2 種常用方法[9]。酸水解法是利用酸催化水解多糖組分，得到硫酸鹽漿中殘余木質(zhì)素，但在一定程度上會改變木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)[10]；而酶水解法條件溫和，與磨木木質(zhì)素相比木質(zhì)素得率較高，分離得到的殘余物在一定程度上更能代表漿中的殘余木質(zhì)素，而且由酶水解得到的木質(zhì)素仍然存在5%～10%的木質(zhì)素與碳水化合物相連[9-10]，可以了解漿中殘余木質(zhì)素和LCC的結(jié)構(gòu)信息。Terashima和Xie 等人研究發(fā)現(xiàn)[11-13]，通過向植物體投入帶有13C和2H同位素標(biāo)記的前驅(qū)物，可以選擇性實現(xiàn)特定的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)及糖類信號的富集，結(jié)合核磁共振技術(shù)可以得出木質(zhì)素及LCC連接鍵的結(jié)合位點，進而能夠有效地斷裂木質(zhì)素及LCC的連接，達到去除木質(zhì)素的目的。

本研究首先向銀杏植株中投入帶13C 和2H 標(biāo)記的前驅(qū)物，使之在植物體內(nèi)正常轉(zhuǎn)化為帶13C 標(biāo)記的木質(zhì)素和帶2H 標(biāo)記的碳水化合物，然后通過硫酸鹽法蒸煮除去大量木質(zhì)素，對得到的硫酸鹽漿進行酶處理，獲得酶解木質(zhì)素，結(jié)合固態(tài)、液態(tài)核磁共振波譜對硫酸鹽法蒸煮前后銀杏木質(zhì)部的木質(zhì)素及LCC 進行分析，探討蒸煮前后化學(xué)鍵的結(jié)構(gòu)變化，有望為制漿過程中木質(zhì)素的高效脫除提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 實驗試劑及原料

實驗所用原料為6 年生銀杏植株，產(chǎn)地為湖北省。松伯醇葡萄糖苷-[α-13C]參考Xie 等人[12]的方法自主合成；D-葡萄糖-[6-2H2]購自Sigma 公司；羧甲氧基胺半鹽酸鹽（AOA）購自麥克林試劑公司；纖維素酶“Onozuka”RS 購自日本Yakult 株式會社；半纖維素酶（來源于黑曲霉）購自Sigma 公司；其他所需試劑均為分析純，購自國藥試劑有限公司。

1.2 銀杏植物體內(nèi)前驅(qū)物的投入

在6 月4 日選取未完全木質(zhì)化的銀杏植株，在其頂部主干部位進行截取，獲得直徑15～25 mm、高度30 cm，并帶有20～25 片葉子的銀杏枝條。將每根植株浸泡在200 mL 配置好的溶液中，該溶液含有松伯醇葡萄糖苷-[α-13C]300 mg，D-葡萄糖-[6-2H2]200 mg，羧甲氧基胺半鹽酸鹽8 mg。每根植株每天約吸收50 mL 溶液，4 天后每天注入50 mL 的去離子水，使得上述化學(xué)藥品在一周內(nèi)吸收完畢。后期補加去離子水，在人工氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 周，保持溫度25 ℃，相對濕度50%。

1.3 銀杏木粉的硫酸鹽法蒸煮

將銀杏植株在人工氣候箱中培養(yǎng)1 個月，剝?nèi)ネ馄ぃ瑥男纬蓪酉蛩栊姆较蚯腥⌒律举|(zhì)部約1 mm，風(fēng)干后，用Wiley 粉碎機磨至40～60 目粉末。取銀杏木粉50 g（以絕干計），按照硫化度25%、用堿量30%（以Na2O 計）、固液比1∶10 的條件，在高溫反應(yīng)釜中蒸煮，溫度175 ℃，升溫1 h，保溫3 h，所得紙漿得率為50%，卡伯值為43。

1.4 未漂硫酸鹽漿中殘余木質(zhì)素的分離

采用酶解法提取紙漿中的殘余木質(zhì)素，先將上述同位素標(biāo)記的硫酸鹽漿用PFI 磨漿機進行打漿處理，最終測得加拿大游離度為270 mL 的紙漿。稱取1 g 纖維素酶和1 g半纖維素酶加入到400 mL乙酸/乙酸鈉緩沖溶液（pH 值=4.5）中進行溶解，通過G4 砂芯漏斗過濾，濾液低溫保存。稱取未漂硫酸鹽漿24 g，均分到4個碘量瓶中，每個碘量瓶加入酶溶液100 mL，再加150 mL 緩沖溶液，然后在45 ℃下振蕩48 h，每次酶解后將2 個碘量瓶內(nèi)的樣品合并，共酶解4 次，最后離心分離殘余物與溶液，殘余物用稀HCl（pH 值=2）充分洗滌，冷凍干燥。參考Lin等人[14]的方法進一步分離，將酶解后的殘余物1 用NaOH 進行抽提，用稀HCl（與水的體積比為1∶2）沉淀，再用稀HCl（pH值=2）充分洗滌，透析后分離得到堿溶性殘余酶解木質(zhì)素（CEL-Alk），實驗流程如圖1所示。

圖1 未漂硫酸鹽漿的制備及殘余木質(zhì)素的分離Fig.1 Preparation of unbleached kraft pulp and isolation of residual lignin

1.5 檢測方法

1.5.113C和2H豐度的測定

將培養(yǎng)完成后的銀杏木粉進行苯-醇（2/1，v/v）和熱水抽提，然后通過元素分析儀（FLASH 2000型）和同位素質(zhì)譜儀（Delta V 型）聯(lián)用測定13C 和2H 的豐度值。通過式(2)計算13Cα/12Cα的值，式(4)計算D6/H6的值。

式(1)和式(2)中13C/12C 為樣品中13C 與12C 豐度的比值；δ13C 為樣品的C 同位素值（δ13C(VPDB)，‰）；1.11802%為標(biāo)準(zhǔn)品的13C 同位素豐度；13Cα/12Cα為樣品中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元上Cα的13C 與12C 的同位素比值；1.0766%為不帶同位素標(biāo)記的銀杏植物體內(nèi)的13C 同位素豐度；0.3102為銀杏植物體內(nèi)木質(zhì)素的含量；10為木質(zhì)素（愈創(chuàng)木基單元）結(jié)構(gòu)中總C原子的個數(shù)與Cα位13C個數(shù)的比值。

式(3)和式(4)中D/H為樣品中D豐度與H豐度的比值；δD 為樣品中H 同位素值（δD(VSMOW)，‰）；0.015575%為標(biāo)準(zhǔn)品中D 的同位素豐度；D6/H6 為樣品中纖維素6 號位的D 與H 的同位素比值；0.013505%為銀杏植物體內(nèi)D 的同位素豐度；0.45 為銀杏中纖維素的含量；5 為纖維素（葡萄糖單元）中總H的個數(shù)與6號位H的個數(shù)比值。

1.5.2 高分辨率CP/MAS13C NMR檢測

在Bruker Avance Ⅲ型600 MHz 光譜儀上，使用交叉極化（CP）和魔角自旋（MAS）對培養(yǎng)后的銀杏植株粉末（200 目）進行固態(tài)13C NMR 光譜測定，溫度300 K，接觸時間3 ms，脈沖遲滯2 s，每個樣品累積掃描4000次。

1.5.3 CEL-Alk的13C和1H NMR檢測

硫酸鹽漿中殘余木質(zhì)素溶解在DMSO-d6中（c=130 mg/mL，用于1H 和13C NMR 實驗），在300 K 條件下，在Bruker Avance Ⅲ型600 MHz光譜儀上測定其核磁共振光譜，13C NMR 測定脈沖延遲2.5 s，采集時間0.95 s，累積掃描10000 次；1H NMR 測定循環(huán)延遲4.2 s，采集時間0.72 s，累積掃描400次?；瘜W(xué)位移參考溶劑信號δ(1H)=2.5，δ(13C)=39.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙同位素標(biāo)記的銀杏新生木質(zhì)部的13C/2H 豐度分析

13C 和2H 的同位素豐度如表1所示，經(jīng)13C/2H 標(biāo)記后的銀杏木質(zhì)部同位素比值都有較明顯的提高，其中13Cα/12Cα值為未標(biāo)記物的3.2 倍，D6/H6 值比未標(biāo)記高13倍，表明人工投入的13C和2H 標(biāo)記的前驅(qū)物在植物體內(nèi)成功得到了轉(zhuǎn)化，未影響植物的正常生長，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。

表1 銀杏木粉的13C/2H豐度Table 1 13C/2H abundance of ginkgo wood mill

2.213C/2H 雙同位素標(biāo)記的銀杏木粉的固態(tài)CP/MAS13C NMR分析

高分辨率CP/MAS13C NMR 核磁共振譜可以對難溶性大分子物質(zhì)進行全組分無損分析，對結(jié)構(gòu)研究具有一定的參考價值[15-17]。但是在核磁共振測定過程中，固體分子之間不能自由運動，自旋耦合較強，導(dǎo)致吸收峰較寬，掩蓋了一些信號。由13Cα標(biāo)記物與未標(biāo)記物得到Cα增強信號的差示譜圖（圖2，以δ=55.8 處甲氧基的吸收峰為基準(zhǔn)），能夠從很大程度上彌補CP/MAS13C NMR 譜的不足，同時也證實了松伯醇葡萄糖苷-[α-13C]在銀杏植物體內(nèi)的成功轉(zhuǎn)化。在差示譜圖中，盡管δ在50～110范圍內(nèi)不可避免地會有殘余的多糖信號，但在低場區(qū)域（δ＞160）和高場區(qū)域（δ＜50）均未發(fā)現(xiàn)明顯的吸收峰，基線較為平坦，認(rèn)為殘留的多糖信號對此貢獻很少。由圖2可以明顯看到有關(guān)Cα的增強信號，在δ=134.0 處（No.3）顯示的是松伯醇結(jié)構(gòu)中—Cα==C—的信號[18]。δ=105.6 處（No.4）是木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元與多糖類物質(zhì)以縮醛鍵連接的Cα信號[19]，原本裸子植物的木質(zhì)部中存在一定量的縮醛鍵LCC 結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)位移δ=90.1 處（No.5）Cα的信號歸屬于G 型木質(zhì)素單元間苯基香豆?jié)M結(jié)構(gòu)[20]。δ=84.2（No.6）信號是與多糖類物質(zhì)以苯甲醚鍵連接的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中的Cα[21]。δ=75.5（No.7）處的增強信號可能來自與苯甲酯鍵型LCC 結(jié)構(gòu)以及β—1 縮合型結(jié)構(gòu)的Cα信號。δ=72.9（No.8）處的增強信號最為明顯，表明原木質(zhì)素單元間存在大量的β—O—4結(jié)構(gòu)，證實了β—O—4結(jié)構(gòu)是木質(zhì)素單元間主要的連接結(jié)構(gòu)，這與前人的研究結(jié)果一致[19]。δ=63.0（No.10）處的增強信號表明天然銀杏植株中存在β—1 型木質(zhì)素單元間結(jié)構(gòu)[22]。

圖2 銀杏木粉的CP/MAS13C NMR譜圖及其差示譜圖Fig.2 CP/MAS13C NMR and difference spectra of ginkgo wood mill

2.3 CEL-Alk的13C NMR分析

使用纖維素酶和半纖維素酶對硫酸鹽法蒸煮后的漿料進行酶解處理，降解掉大部分多糖組分，減少糖組分在核磁共振測試中的信號。對硫酸鹽法蒸煮后CEL-Alk中堿溶木質(zhì)素部分進行了13C NMR 光譜表征，根據(jù)參考文獻[19]，將δ=55.8處甲氧基的信號峰作為基準(zhǔn)峰，對比結(jié)果如圖3所示。具體的13C化學(xué)位移歸屬見表3，主要的木質(zhì)素和LCC連接結(jié)構(gòu)如圖5所示。

表3 CEL-Alk的13C NMR化學(xué)位移及信號歸屬Table 3 13C NMR chemical shifts and signal assignments of CEL-Alk

圖3 銀杏CEL-Alk的13C NMR譜圖Fig.3 13C NMR spectra of ginkgo biloba CEL-Alk

通過圖3發(fā)現(xiàn)，在化學(xué)位移δ=147.4（No.7）處顯示的是愈創(chuàng)木基C4[23]以及肉桂酸中的Cα吸收峰[24]，α-13C標(biāo)記產(chǎn)物在此處有較明顯的增強，表明木質(zhì)素在硫酸鹽法蒸煮過程中部分碎解，產(chǎn)生了較多的肉桂酸結(jié)構(gòu)。在化學(xué)位移δ=129.8（No.8）處的振動信號是由愈創(chuàng)木基C1[24]，松伯醇中的Cα和Cβ[13]，以及少量對-香豆醇中的C2 和C6 引起的[12]，α-13C 標(biāo)記后有明顯的增強，表明在硫酸鹽法蒸煮過程中與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元α位碳原子連接的醚鍵、酯鍵發(fā)生了斷裂，形成了較多的—Cα==Cβ—，13C標(biāo)記的產(chǎn)物的Cα信號的增強較為明顯?；瘜W(xué)位移δ=102.1（No.13）處是與糖單元有縮醛鍵連接的Cα，聚木糖、甘露糖以及苯基糖苷上的C1 產(chǎn)生的吸收峰[25-26]，α-13C 標(biāo)記的殘余CEL-Alk 在此處信號有明顯增強，表明硫酸鹽漿殘余木質(zhì)素中有一小部分是木質(zhì)素Cα與多糖以縮醛鍵連接的，而連接的糖的類型很有可能是聚木糖[19]，說明具有縮醛鍵的LCC結(jié)構(gòu)在硫酸鹽法制漿過程中比較穩(wěn)定。在δ=97.1（No.14）處顯示的是苯基糖苷區(qū)域[27]，一般是木質(zhì)素的酚羥基與多糖還原端羥基形成苯基糖苷鍵[5,8]，而葡甘聚糖在堿性高溫條件下容易降解，聚木糖則相當(dāng)穩(wěn)定[28]，認(rèn)為此共振信號是木質(zhì)素與聚木糖連接形成的糖苷鍵?；瘜W(xué)位移δ=80.6（No.15）處的增強信號為木質(zhì)素單元Cα與碳水化合物形成的苯甲醚鍵結(jié)構(gòu)[29-30]，而硫酸鹽法蒸煮后紙漿中碳水化合物主要是甘露糖和木糖[31]，所以此位置可能是木質(zhì)素Cα與甘露糖C6位的連接，也可能是木質(zhì)素Cα與聚木糖C2或C3位的連接[32]。

化學(xué)位移δ=75.8（No.16）處，在未標(biāo)記的CELAlk核磁譜圖上未發(fā)現(xiàn)明顯的信號峰，而在α-13C標(biāo)記物中能看到明顯的增強信號，這就排除了木糖、甘露糖和葡萄糖對此信號的貢獻，確定是來自木質(zhì)素單元β—O—4（蘇型）結(jié)構(gòu)中Cα信號[26]，表明非酚型β—O—4 型木質(zhì)素在堿法制漿中具有一定的穩(wěn)定性，在硫酸鹽法蒸煮后仍然有部分存在。δ=72.5（No.17）處的共振信號是由β—O—4（赤型）結(jié)構(gòu)中的Cα[23-25]，甘露糖和β-葡萄糖上的C2、C3，以及聚木糖上的C2，β—β結(jié)構(gòu)中的Cγ也會在此處產(chǎn)生共振信號[33]，但在未標(biāo)記樣品的譜圖上沒有發(fā)現(xiàn)信號峰，證明是由蒸煮后殘余的非酚型β—O—4 結(jié)構(gòu)中的Cα共振引起的。在δ=67.3（No.18）處的信號峰是由Ar—CHOH—CH3結(jié)構(gòu)中的Cα引起的[25]，表明在硫酸鹽法蒸煮后，CEL-Alk殘留著部分帶α—OH的芳基片段，Cγ位產(chǎn)生甲基，而蒸煮及酶解過程會不同程度地破壞糖類結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致α,β-甘露糖C4，β-木糖C5 在此處的信號消失。在化學(xué)位移δ=63.16（No.20）處，帶α-13C標(biāo)記的CEL-Alk 與未標(biāo)記的CEL-Alk 相比，信號峰有較為明顯的提高，表明此信號是由硫酸鹽法蒸煮過程中β—1縮合型結(jié)構(gòu)Cα產(chǎn)生的[26,34]，說明β—1縮合型結(jié)構(gòu)在硫酸鹽法制漿過程中比較穩(wěn)定。在δ=25～50之間存在大量的甲基和亞甲基的碳信號，這是由于在硫酸鹽法制漿過程中酚型及非酚型的α-醚鍵、β-醚鍵的斷裂，導(dǎo)致木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元產(chǎn)生大量的甲基和亞甲基結(jié)構(gòu)。

2.4 CEL-Alk的1H NMR分析

1H NMR 的共振信號較寬且重疊，測出的譜圖較粗鈍[35]，六碳糖的C6 位經(jīng)過2H 同位素標(biāo)記后，相關(guān)的信號會減弱，采用差示譜圖進行處理，可以使減弱的信號顯露出來[21]。經(jīng)酶處理后漿料中沒有LCC 連接鍵的大量多糖類物質(zhì)被水解掉，通過差示譜圖可以更加清晰地看到木質(zhì)素與多糖之間的連接，以芳香質(zhì)子為基準(zhǔn)，2H 標(biāo)記的CEL-Alk 和未標(biāo)記的CEL-Alk 的差示譜圖如圖4所示。

圖4 銀杏CEL-Alk的1H NMR差示譜圖（未標(biāo)記的譜圖減去2H標(biāo)記的譜圖）Fig.4 1H NMR difference spectra of ginkgo CEL-Alk(unlabeled spectra minus2H labeled spectra)

由圖4 可知，除了乙?；屑谆墓舱裥盘柾?，幾乎所有的共振信號都出現(xiàn)在δ在3.0～5.5之間?；瘜W(xué)位移δ在4.78～4.70（No.2）和δ在4.68～4.53（No.3）處顯示的是葡萄糖單元C6 上的D 信號[21]，為木質(zhì)素單元Cα位與葡萄糖單元上伯羥基形成的苯甲醚鍵結(jié)構(gòu)，在No.3 處可能還存在甘露糖C6 上的D 信號，顯示為木質(zhì)素Cα與葡萄糖或甘露糖C6 的苯甲醚鍵連接[36-37]，說明硫酸鹽漿中殘留的木質(zhì)素-多糖復(fù)合體苯甲醚鍵結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，這與Taneda等人[38]的研究結(jié)果基本一致?；瘜W(xué)位移δ在3.82～3.72（No.4）吸收區(qū)域中有葡萄糖單元C6 上D 的貢獻，可能是纖維素（未取代）6-D 和6-D’的共振信號[21]，說明酶降解后的殘余木質(zhì)素中還含有少量的纖維素組分。由CEL-Alk的1H NMR 差示譜圖可以得出，硫酸鹽漿中木質(zhì)素與多糖之間存在苯甲醚鍵連接。詳細(xì)的1H NMR 信號歸屬如表4所示，殘余的木質(zhì)素及LCC結(jié)構(gòu)見圖5。

表4 CEL-Alk的1H NMR差示譜圖的化學(xué)位移及信號歸屬Table 4 Chemical shifts and signal assignments of1H NMR difference spectra of CEL-Alk

圖5 銀杏材硫酸鹽法制漿后殘余木質(zhì)素及LCC結(jié)構(gòu)Fig.5 Residual lignin and LCC structure of ginkgo wood after kraft pulping

3 結(jié)論

將松柏醇葡萄糖苷-[α-13C]和D-葡萄糖-[6-2H2]及阻詰劑AOA 投入生長的銀杏植株中。培養(yǎng)一個月后，新生木質(zhì)部的13C/2H 豐度顯示木質(zhì)素及聚糖分別被13C和2H 所標(biāo)記。對雙同位素標(biāo)記的木粉進行硫酸鹽法蒸煮，采用酶水解法分離得到漿中的纖維素酶解木質(zhì)素（CEL），再利用堿抽提從殘余木質(zhì)素中獲得堿溶性CEL（CEL-Alk）。

3.1 由13C/2H 雙同位素標(biāo)記的銀杏木粉的固態(tài)CP/MAS13C NMR 光譜可知，天然銀杏木質(zhì)部中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元間主要以β—1、β—5、β—O—4連接，少量木質(zhì)素單元Cα與多糖類物質(zhì)以苯甲醚鍵和縮醛鍵連接。

3.213C/2H 雙同位素標(biāo)記的CEL-Alk 的13C NMR 分析結(jié)果表明，銀杏木粉經(jīng)硫酸鹽法蒸煮后殘余木質(zhì)素主要是β—5、β—1 等縮合結(jié)構(gòu)，部分木質(zhì)素通過縮醛鍵與多糖類物質(zhì)相連。

3.313C/2H 雙同位素標(biāo)記的CEL-Alk 的1H NMR 差示譜圖顯示出木質(zhì)素單元Cα與葡萄糖或甘露糖形成的苯甲醚鍵結(jié)構(gòu)，表明苯甲醚鍵結(jié)構(gòu)在硫酸鹽法蒸煮過程中較穩(wěn)定。