乳酸菌菌劑對(duì)玉米幼苗的促生作用研究

陳思沅，茍 展，林文槿，彭 鵬，尹少坤，楊 昆，周 佳，賈 峰，李海峰

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

玉米是重要的主糧作物，2018年的播種面積在我國(guó)達(dá)到0.421億hm2左右（王向博，2021）。玉米等作物需要通過(guò)根系從土壤中吸收氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)元素維持生長(zhǎng)發(fā)育，但土壤中可供植物利用的溶解態(tài)無(wú)機(jī)元素濃度偏低，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足植物的需求，因此需要通過(guò)施肥補(bǔ)充（尹煥麗，2020；郭永召等，2020）。化肥的生產(chǎn)過(guò)程中存在能耗高、環(huán)境污染嚴(yán)重等問(wèn)題，而且過(guò)度使用化肥也會(huì)導(dǎo)致土壤板結(jié)、酸化、地下水污染和磷素流失等問(wèn)題出現(xiàn)（Liu等，2021；何為媛等，2020；宦月慶，2019）。因此，開(kāi)發(fā)出既利于節(jié)能環(huán)保與食品安全，又可以提高土壤肥力的微生物肥料是當(dāng)前的重要任務(wù)。

目前，對(duì)微生物肥料中發(fā)揮作用的功能菌種研究主要集中在解磷菌、解鉀菌及固氮菌，這些菌種能溶解土壤中難溶的鉀、磷等化合物并將大氣中的分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為植物容易吸收的形態(tài)，從而能提高作物對(duì)礦物質(zhì)元素的利用率，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，減少化肥的使用與自然水體的污染（周璇等，2020）。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌廣泛存在于乳制品和發(fā)酵食品中，能夠發(fā)酵糖類(lèi)產(chǎn)生乳酸、草酸、檸檬酸等有機(jī)酸（謝玉鋒等，2021；馬媛等，2019）。其中有機(jī)酸的分泌能促進(jìn)土壤中鉀、磷等營(yíng)養(yǎng)元素的活化，供作物的根系吸收（Yang等，2020）。侯景清（2019）的研究結(jié)果表明，乳酸菌菌劑能改良鹽堿地并提高土壤中氨態(tài)氮、硝態(tài)氮和有效磷的含量。王小杰（2019）將小麥種子浸泡在植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的菌懸液中，能顯著提高小麥種子的發(fā)芽率；周游等（2017）向草莓的根際土壤中施加乳酸菌制劑發(fā)現(xiàn)，該制劑能明顯地提高草莓的株高、莖粗等生長(zhǎng)指標(biāo)。

因此，乳酸菌是除了解磷菌、解鉀菌及固氮菌等功能菌株外對(duì)植物的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用的菌株，但是目前對(duì)乳酸菌菌劑研究的菌種比較單一，主要以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）兩種菌種為主（Lamont等，2017）。本研究以不加菌劑處理組為對(duì)照，分析以發(fā)酵乳桿菌所制備的菌劑對(duì)玉米種子萌芽及幼苗的部分生長(zhǎng)特性、根系活力與磷含量的影響，以及在幼苗根際土壤中分泌有機(jī)酸的種類(lèi)與含量，為開(kāi)發(fā)乳酸菌作為節(jié)能環(huán)保的新型微生物肥料提供菌種資源與理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料2020年11月在河南金苑種業(yè)有限公司采購(gòu)品種為偉科702的玉米種子；發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）是分離自河南商丘市酵子中的一株乳酸菌，用作本研究的試驗(yàn)菌株。

1.2 培養(yǎng)基MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母粉5 g、吐溫80 1 mL、檸 檬 酸 銨2 g、CH3COONa 5 g、K2HPO42 g、Mg-SO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g，加蒸餾水定容至1 L，調(diào)pH至6.2，115℃滅菌30 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌菌劑的制備 將發(fā)酵乳桿菌接種于液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵乳桿菌菌株的液體培養(yǎng)基在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使菌株達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵液，測(cè)定其OD600為1.90；取其發(fā)酵液5 mL，于8000 r/min離心5 min，去除上清液后用蒸餾水洗滌兩遍再加入5 mL蒸餾水，制成菌劑LF，其含有發(fā)酵乳桿菌的活菌量為3.1×107CFU/mL。本次玉米種子萌芽與盆栽試驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)不同的處理組：LF組取LF菌劑5 mL，再加蒸餾水補(bǔ)充至20 mL，CK組則單獨(dú)施加蒸餾水作為對(duì)照。

1.3.2 乳酸菌菌劑對(duì)玉米種子發(fā)芽的影響 挑選形態(tài)完整、飽滿(mǎn)、無(wú)霉變、無(wú)病蟲(chóng)的玉米種子，對(duì)玉米種子進(jìn)行滅菌處理，置于兩層濕濾紙的培養(yǎng)皿中，用濕紗布鋪蓋（黃詩(shī)宸等，2018）。于（25±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h黑暗條件下培養(yǎng)，每隔12 h觀察種子發(fā)芽情況，玉米種子發(fā)芽后48 h內(nèi)計(jì)算發(fā)芽率，72 h計(jì)算發(fā)芽勢(shì)。發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的計(jì)算公式（畢春竹等，2021）如下：

1.3.3 乳酸菌菌劑對(duì)玉米幼苗的影響 用口徑為7 cm，高為7.3 cm的塑料花盆，分別稱(chēng)取190 g的土壤并施加液態(tài)菌劑，再挑選發(fā)芽情況相似的種子種植。每個(gè)處理組各4盆，每盆種植4粒玉米，培養(yǎng)條件參考康偉?。?017）。適當(dāng)澆水并保障光照均勻，培養(yǎng)14 d后測(cè)定玉米幼苗的生長(zhǎng)特性：?jiǎn)沃甑厣现旮?、根長(zhǎng)、鮮重與干重；采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測(cè)定植株的根系活力（李小方等，2016）；采用過(guò)硫酸鉀消解法對(duì)玉米幼苗的葉片和根部總磷素進(jìn)行消解，之后與土壤有效磷含量的測(cè)定均采用鉬酸銨分光光度法進(jìn)行（GB/T 11893-89，1990）。

1.3.4 乳酸菌菌劑促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng)機(jī)理探究樣品前處理：稱(chēng)取LF處理組的土壤0.5 g，加入1 mL提取液（甲醇：氯仿=7:3），混勻后在冰上提取30 min，加入600 μL H2O搖勻，4℃下12000 r/min離心10 min，取上清，重復(fù)提取一次；冷凍干燥，加入200 μL甲醇進(jìn)行復(fù)溶，4℃下12000 r/min離心10 min，取上清。樣品衍生化：取40 μL樣品，加入10 μL 0.1 mol/L 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺與10 μL 0.1 mol/L 3-硝基苯肼；40℃孵育反應(yīng)30 min。利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)，測(cè)定LF菌劑下玉米幼苗根系土壤中有機(jī)酸種類(lèi)與含量，液相與色譜條件參考郭山（2018），使用軟件TraceFinder處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。1.4數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2019和SAS 9.2軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，采用origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌菌劑對(duì)玉米種子發(fā)芽的影響 由表1可知，經(jīng)LF菌劑浸泡48 h（發(fā)芽后開(kāi)始計(jì)時(shí)）后，玉米種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但與空白對(duì)照（CK）相比，LF處理組中玉米種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)分別提高25.1%與11.5%。Limanska等（2013）使用不同來(lái)源的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）懸浮液分別浸泡番茄種子發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌ONU991、ONU313與ONU316的懸浮液分別使番茄種子的發(fā)芽率提高15.1%、14.4%和13.6%。黃詩(shī)宸等（2018）的研究結(jié)果表明，經(jīng)產(chǎn)自乳酸菌的多糖浸泡水稻種子對(duì)提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)無(wú)顯著作用，但能促進(jìn)水稻幼苗的根長(zhǎng)。本文的結(jié)果表明，使用LF菌劑浸泡后，能明顯地促進(jìn)玉米種子的萌芽，這可能是由于LF菌劑中的有效菌株分泌了植物激素，能釋放出有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物，或者生物酶的種類(lèi)豐富，進(jìn)而促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。對(duì)此，可以進(jìn)一步探究乳酸菌菌劑的代謝產(chǎn)物等活性物質(zhì)對(duì)種子促萌芽的作用機(jī)制。

表1 不同菌劑對(duì)玉米種子的發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)的影響%

2.2 乳酸菌菌劑對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)特性的影響由表2可知，經(jīng)過(guò)LF菌劑處理之后，玉米幼苗的株高、鮮重與干重均有顯著的提高（P＜0.05），與CK組相比，分別增加41.1%、48.9%、44.4%；LF處理對(duì)根長(zhǎng)不存在顯著性影響（P＞0.05），但比CK組幼苗的根長(zhǎng)提高2.4%。Amaresan等（2021）將微生物菌劑分別接種到番茄與辣椒的根際，均能促進(jìn)番茄和辣椒的生長(zhǎng)，株高分別提高24.8%與43.6%。據(jù)報(bào)道，在白楊樹(shù)幼苗的根際土壤施加SK1-7芽孢桿菌菌劑能使白楊樹(shù)幼苗的鮮重與干重分別提高38.3%與22.7%（Chen等，2020）。本文的結(jié)果表明，向玉米幼苗的根際土壤中施加LF菌劑，能明顯促進(jìn)玉米幼苗的株高、根長(zhǎng)、鮮重與干重等生長(zhǎng)指標(biāo)增加。可能是由于LF菌劑促進(jìn)土壤中難溶性磷、鉀等元素的溶解，提高土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的含量，供玉米植株的吸收，因此需進(jìn)行下一步的探究。

表2 不同菌劑對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)特性的影響

2.3 乳酸菌菌劑對(duì)玉米幼苗根系活力的影響由圖1可知，經(jīng)LF菌劑處理后，玉米幼苗的根系活力均顯著高于對(duì)照處理的數(shù)值（P＜0.01），其根系活力可達(dá)60.05 μg/g·h，CK組的根系活力為18.01 μg/g·h，根系活力大小為L(zhǎng)F組＞CK組。植物通過(guò)根系來(lái)吸收土壤中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并且運(yùn)輸?shù)街参锏钠渌课唬祷盍Ψ从掣祵?duì)水分和營(yíng)養(yǎng)元素的吸收能力（徐晴等，2016）。Chen等（2020）的研究結(jié)果表明，往白楊樹(shù)幼苗的根際土壤添加SK1-7芽孢桿菌菌劑后，幼苗的根系活力提高31.7%。

圖1 不同菌劑對(duì)玉米幼苗根系活力的影響

2.4 乳酸菌菌劑對(duì)玉米幼苗及土壤中磷含量的影響 由圖2可知，LF處理組的玉米幼苗葉片與根部的總磷含量均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），與CK組相比，LF組的玉米幼苗葉片中總磷含量提高19.1%，根部的總磷含量提高4%。此外，經(jīng)LF菌劑處理能極顯著促進(jìn)土壤中有效磷的釋放（P＜0.01），CK組的有效磷含量為0.03 mg/g，而LF組的有效磷含量為0.07 mg/g。植物通過(guò)根系吸收土壤中的磷、鉀等礦物元素，但這些礦物元素通常以礦石等不溶性化合物形式存在，土壤微生物能通過(guò)生物降解將礦物轉(zhuǎn)化成可溶性礦物質(zhì)。例如，土壤中的解磷菌能把土壤中難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化成有效磷，供植物吸收（安車(chē)等，2019）。Lacerda等（2016）從立比草中分離出8株能溶解磷酸鹽的乳酸菌，本文所研究的發(fā)酵乳桿菌也具有類(lèi)似的解磷能力。Chen等（2021）發(fā)現(xiàn)，在杉木幼苗的根際土壤添加解磷菌菌劑能促使杉木幼苗葉片的總磷含量提高20.0%。Emami等（2020）把小麥內(nèi)生菌菌劑與根際解磷菌菌劑分別施加于小麥的根際土壤，小麥根際土壤的有效磷含量分別提高24.7%和22.5%，并推測(cè)是小麥的根系與菌劑之間相互作用，釋放有機(jī)酸而導(dǎo)致根際磷利用率的變化。為探明乳酸菌進(jìn)行解磷的作用機(jī)理，本文還進(jìn)一步對(duì)LF菌劑在玉米幼苗根際土壤釋放的有機(jī)酸種類(lèi)與含量進(jìn)行了測(cè)定。

圖2 不同菌劑對(duì)玉米幼苗及土壤中磷含量的影響

2.5 乳酸菌菌劑促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng)機(jī)理探究由表3可知，玉米幼苗根系土壤的有機(jī)酸種類(lèi)主要含有異戊酸、己酸、草酸、乳酸與辛酸等有機(jī)酸，含 量 分 別 為2.40、1.73、1.72、1.61、1.15 ng/mg，其余有機(jī)酸的含量小于1.00 ng/mg。微生物菌劑中的有益菌可以通過(guò)代謝活動(dòng)產(chǎn)生有機(jī)酸，并與土壤中的金屬離子形成絡(luò)合物，促進(jìn)磷酸鹽的釋放供作物吸收，還能與礦物表面的陽(yáng)離子形成復(fù)合物從而提高有效磷的含量（池景良等，2021）。據(jù)報(bào)道，草酸青霉（Penicillium oxalicum）能通過(guò)分泌草酸、檸檬酸、甲酸、乳酸和乙酸等有機(jī)酸來(lái)提高對(duì)土壤中磷酸鹽的溶解能力（Jiang等，2020）。韓雪嬌（2020）的結(jié)果表明，西地西菌（Cedecea sp.）能通過(guò)分泌α-酮戊二酸、酒石酸等大量有機(jī)酸，降低土壤的pH，從而溶解土壤中的磷酸鹽。本研究結(jié)果表明，LF菌劑在玉米根際發(fā)揮作用后，釋放的有機(jī)酸種類(lèi)豐富，且含量比較高。因此，乳酸菌與解磷菌等功能菌種一樣可以作為植物促生菌，并且具有相似的解磷機(jī)理，均能夠通過(guò)產(chǎn)生高含量的有機(jī)酸溶解土壤中難溶性磷酸鹽，提高土壤中有效磷的含量，從而對(duì)玉米幼苗發(fā)揮促生作用。

表3 有機(jī)酸的種類(lèi)及含量

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵乳桿菌菌劑（LF）處理對(duì)玉米種子萌芽和玉米幼苗的部分生長(zhǎng)特性和生理指標(biāo)均具有顯著的促進(jìn)作用，能有效地提高玉米幼苗的株高、鮮重、干重、根系活力及土壤中有效磷的含量，玉米幼苗根際土壤中有機(jī)酸以異戊酸、己酸、草酸、乳酸與辛酸為主，且含量超過(guò)1.00 ng/mg。說(shuō)明乳酸菌具有作為新型功能菌種研制微生物菌肥的潛力，但乳酸菌菌劑對(duì)玉米的整個(gè)生育期及玉米產(chǎn)量的影響以及促生的作用機(jī)制等內(nèi)容，還需進(jìn)一步系統(tǒng)的研究。