辣椒堿對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌作用效果研究

朱蓮英， 李成會， 許夢姣

（1.唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系，河北唐山 063000；2.河北大學(xué)生命科學(xué)院，河北保定 071000）

辣椒堿又稱辣椒辣素，化學(xué)名稱為反-8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺，是辣椒中含有的極度辛辣的香草酰胺類生物堿，為白色結(jié)晶粉末。具有殺菌、美白、抑制腫瘤和消除炎癥、鎮(zhèn)痛等多種生理作用（陳明杰等，2009；李延紅等，2006；景作亮等，2004）。辣椒堿在食品添加劑、醫(yī)藥保健、生物農(nóng)藥、飼料添加劑等領(lǐng)域均有應(yīng)用（丁宏標(biāo)等，2018；朱亦赤等，2007；鄒華嬌，2002）。近年來，隨著人們對食品安全要求的提高，以及國家對無抗、減抗養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的要求提出，新型替抗添加劑的開發(fā)成為熱門，辣椒堿因具有較好的抑菌、殺菌作用而被進(jìn)一步重視。

枯草芽孢桿菌作為畜禽腸道有益菌、大腸桿菌作為畜禽腸道有害菌均為腸道常駐菌，其菌群數(shù)量多少直接關(guān)系到畜禽腸道健康狀況，進(jìn)而影響畜禽健康和畜禽產(chǎn)品品質(zhì)。本試驗利用不同濃度梯度的辣椒堿對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌進(jìn)行體外作用效果研究，以便為辣椒堿在畜禽上深入開發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 辣椒堿：由唐山市動物營養(yǎng)與飼料工程重點實驗室提供，含量為2%；細(xì)菌：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌由家禽腸道分離提取純化獲得。

1.2 培養(yǎng)基制備 枯草芽孢桿菌和大腸桿菌培養(yǎng)基配制配方見表1。

表1 細(xì)菌培養(yǎng)及配制配方

固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基配好后于121℃濕熱滅菌3 h備用。液體培養(yǎng)基用于枯草芽孢桿菌和大腸桿菌菌懸液制備；固體培養(yǎng)基用于試驗檢驗。

1.3 菌懸液的制備 將已純化的枯草芽孢桿菌和大腸桿菌在超凈工作臺上用接種環(huán)挑取一環(huán)，接種于液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，在搖床中37℃培養(yǎng)18 h。

1.4 辣椒堿稀釋液的制備 用75%乙醇將2%含量的辣椒堿分別溶解成0.125、0.25、0.5、1、2、3 mg/mL的溶液備用。

1.5 試驗用濾紙片的制備 用10 mm的打孔器打出若干直徑10 mm的濾紙片，放入滅菌鍋中121℃滅菌3 h，取出無菌干燥?？瞻讓φ战M為將濾紙片浸置于75%乙醇中一定時間后取出干燥后備用；試驗組濾紙片為將濾紙片浸置于一定濃度辣椒堿溶液中一定時間取出后淋干備用。辣椒堿濃度及浸置時間見表2。

表2 浸置用辣椒堿濃度及浸置時間

1.6 抑菌試驗 將滅菌冷卻到50～60℃的培養(yǎng)基倒入滅菌干燥后的培養(yǎng)皿中冷卻至室溫，按試驗設(shè)計在無菌條件下用移液器分別吸取0.2 mL枯草芽孢桿菌和大腸桿菌菌懸液滴于不同培養(yǎng)基上，并用涂布棒涂布均勻。將浸有不同濃度辣椒堿的濾紙片按圖1樣式進(jìn)行排布好后，將培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，取出進(jìn)行觀察和結(jié)果測定。

圖1 濾紙片放置樣式

1.7 測定指標(biāo)及方法 抑菌圈直徑（mm）：直接測量法，用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量，測量結(jié)果精確到小數(shù)點后1位。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析 測得數(shù)據(jù)Excel進(jìn)行處理與顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 相同浸泡時間內(nèi)不同濃度辣椒堿對枯草桿菌和大腸芽孢桿菌的作用效果 在0.125～3 mg/mL 6個辣椒堿濃度下浸置3 h，對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌作用效果見表3。

由表3可見，不同濃度辣椒堿對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均有抑制作用。對于枯草芽孢桿菌而言辣椒堿的抑制效果隨濃度增加而增強(qiáng)，在1 mg/mL時達(dá)到最大，抑菌圈直徑達(dá)到13.5 mm，而后隨辣椒堿濃度升高抑制效果降低；與其他辣椒堿濃度相比，1 mg/mL辣椒堿濃度抑菌效果達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。對于大腸桿菌而言，隨辣椒堿濃度升高，抑制作用在增強(qiáng)，抑菌圈直徑在3 mg/kg時達(dá)到最大，為15.3 mm；各濃度間差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

表3 浸置3 h不同濃度辣椒堿對不同枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的作用效果mm

2.2 不同浸置時間不同辣椒堿濃度對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌作用效果

2.2.1 不同浸置時間不同濃度辣椒堿對枯草芽孢桿菌的作用效果 在1、2 mg/kg和3 mg/kg濃度下浸置3、6、12、18 h對枯草芽孢桿菌作用效果見表4。

表4 不同浸置時間不同辣椒堿濃度對枯草芽孢桿菌的作用效果mm

由表4可見,辣椒堿對枯草芽孢桿菌有抑制作用。對于同一浸置時間而言，隨濃度增加而抑菌效果呈降低趨勢，在1、2、3 mg/mL三個濃度中以1 mg/mL的抑菌效果最好。對于同一濃度的不同浸置時間而言，各濃度辣椒堿抑菌效果均出現(xiàn)先降低后升高趨勢。

2.2.2 不同浸置時間不同濃度辣椒堿對大腸桿菌的作用效果 在1、2 mg/kg和3 mg/kg濃度下浸置3、6、12、18 h對大腸桿菌作用效果見表5。

表5 不同浸置時間不同濃度辣椒堿對大腸桿菌的作用效果mm

由表5可見，辣椒堿對大腸桿菌有明顯的抑菌作用。對于同一浸置時間的不同濃度辣椒堿而言，出現(xiàn)隨濃度增加抑菌作用增強(qiáng)趨勢。且無論哪個浸置時間，2 mg/mL辣椒堿的抑菌效果均顯著高于1 mg/mL辣椒堿的抑菌作用。對于同一濃度辣椒堿的不同浸置時間對大腸桿菌的抑制效果而言，隨浸置時間的延長，抑制作用呈增強(qiáng)趨勢。且在浸置12、18 h時的抑菌效果均顯著高于3 h的抑菌效果（P＜0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，辣椒堿對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均具有一定的抑制作用。對于枯草芽孢桿菌的抑制作用最佳濃度為1 mg/mL時，且浸置時間對抑制效果影響不明顯。當(dāng)濃度大于3 mg/mL時，對枯草芽孢桿菌的抑制效果隨濃度的增加反而出現(xiàn)下降趨勢。吳影等（2007）報道，辣椒堿對枯草芽孢桿菌有抑制作用，在濃度低于1 mg/mL時，抑菌圈直徑隨濃度增加而增加，與本研究試驗的結(jié)果相反。張祖嬌等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿對枯草芽孢桿菌最低抑菌濃度為0.115 mg/mL。而唐小平（2009）報道，辣椒堿對枯草芽孢桿菌無抑制作用，與本研究結(jié)果不一致。

對于大腸桿菌而言，本研究試驗結(jié)果顯示辣椒堿在試驗濃度（0.125～3 mg/mL）范圍內(nèi)對大腸桿菌的抑菌效果隨濃度增加而顯著增強(qiáng)，且在同一濃度下隨浸置時間延長，抑菌效果有所增加。楊海燕等（2002）研究發(fā)現(xiàn),辣椒堿對大腸桿菌具有抑制作用。劉可春等（2007）報道，辣椒堿在濃度大于0.125 mg/mL時，對大腸桿菌出現(xiàn)抑菌效果，與本研究結(jié)果相一致。而吳影等（2007）報道，辣椒堿濃度為0.063 mg/mL時即對大腸桿菌產(chǎn)生抑菌作用。

枯草芽孢桿菌作為腸道益生菌而存在，大腸桿菌作為腸道有害菌而存在。該研究結(jié)果顯示出的辣椒堿對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制效果對實際生產(chǎn)中辣椒堿的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義，在增加辣椒堿用量時可有效抑制大腸桿菌，而對枯草芽孢桿菌抑制作用無增強(qiáng)。該研究中不同浸置時間的試驗結(jié)果顯示，辣椒堿對枯草芽孢桿菌的作用效果可能會隨食糜在腸道中停留時間延長而下降，而對于大腸桿菌而言，則可能會隨食糜在腸道停留時間延長作用效果而增強(qiáng)。

本試驗所用pH為7.2～7.4，正好在腸道pH范圍內(nèi)。吳影等（2007）報道，辣椒堿對大腸桿菌的抑菌效果較好時pH為6～8，此pH為腸道pH范圍，更有利于抑制大腸桿菌，保護(hù)腸道健康。

4 結(jié)論

辣椒堿對枯草芽孢桿菌有一定的抑制作用，在濃度低于1 mg/mL時，隨濃度增加而增強(qiáng)；濃度大于1 mg/mL時，出現(xiàn)減弱趨勢。辣椒堿對大腸桿菌有很好的抑制效果，抑菌效果在濃度為0.125～3 mg/mL時隨濃度增加而增強(qiáng)。