聚焦超聲開放血腦屏障聯(lián)合納米藥物遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展

趙鎏丹 楊貴君 邵祺暉 周志璇 金安辰 劉昕奕 崔德榮

過去20年，納米技術(shù)得到深入研究并被廣泛應(yīng)用于多種疾病的診斷和治療。目前已構(gòu)建多種可用于體內(nèi)藥物遞送的納米粒子(nanoparticle，NP)，包括脂質(zhì)體、樹狀聚合物、膠束、聚合物納米顆粒和無機(jī)納米顆粒等[1]，這些NP可裝載治療藥物或成像探針，并精準(zhǔn)地投遞至靶組織或細(xì)胞。NP具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如提高藥物溶解度，保護(hù)所載藥物免于酶消化，提高靶向效率，增強(qiáng)細(xì)胞同化等。此外，由兩親性聚合物與藥物偶聯(lián)(簡稱聚合物-藥物偶聯(lián)物)的納米藥物遞送系統(tǒng)(nanoparticles drug delivery system, NPDDS)亦具有其他一些特性，如增加藥物載量，減少爆裂式釋放，實(shí)現(xiàn)雙藥或多藥的共載等[2-3]?；贜PDDS的聚合物膠束已被研發(fā)，作為一種靶向癌癥治療的傳遞系統(tǒng)，其中一些聚合物膠束已進(jìn)入臨床試驗(yàn)[4-5]。

NPDDS在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)疾病中的作用與血腦屏障(blood brain barrier，BBB)對相關(guān)NP的通透性密切相關(guān)。研究[6]結(jié)果表明，BBB可有效阻擋約98%的小分子物質(zhì)和幾乎所有的外源性大分子物質(zhì)，致使多數(shù)藥物無法在CNS內(nèi)達(dá)到應(yīng)有的治療濃度，這嚴(yán)重影響了諸如新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)等CNS疾病的治療效果。因此，找到一種能有效透過BBB達(dá)到靶區(qū)腦組織的藥物遞送系統(tǒng)，已成為當(dāng)前腦科學(xué)研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

聚焦超聲(focused ultrasound，F(xiàn)US)聯(lián)合微泡(microbubbles，MBs)技術(shù)已被證實(shí)能夠瞬時、可逆、無創(chuàng)地開放BBB[7]，通過增加BBB通透性，促進(jìn)藥物、抗體、基因、細(xì)胞等在靶區(qū)腦組織的高效釋放，增加局部藥物濃度，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。FUS聯(lián)合MBs已顯示出較好的臨床應(yīng)用前景。

本文結(jié)合BBB的生物學(xué)理論知識，梳理了基于NP的腦組織靶向藥物遞送系統(tǒng)和FUS聯(lián)合MBs技術(shù)的最新研究進(jìn)展，同時探討存在的局限，以期為各位同仁深入研究NPDDS靶向治療CNS疾病，突破NP技術(shù)瓶頸提供思路。

1 BBB對藥物進(jìn)入腦組織的影響

BBB是CNS獨(dú)有的物質(zhì)交換調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，由腦組織的連續(xù)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(blood capillary endothelial cell，BCEC)及細(xì)胞間緊密連接(tight junction，TJ)、完整的基膜、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞腳板組成的神經(jīng)膠質(zhì)膜所構(gòu)成；作為代謝屏障，其能夠代謝和滅活多種藥物，以及對神經(jīng)活性有毒害作用的化合物和酶[8-9]。TJ是BBB發(fā)揮作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。TJ連同BCEC形成一個擴(kuò)散屏障，選擇性地阻止大多數(shù)血液播散物質(zhì)進(jìn)入大腦。星形膠質(zhì)細(xì)胞主要參與TJ屏障的誘導(dǎo)和維持，但不參與BBB的屏障作用[9-10]。正是在這些結(jié)構(gòu)的配合下，某些大分子、水溶性或解離型藥物難以進(jìn)入腦組織，只有脂溶性較高的藥物才能以被動擴(kuò)散的方式透過BBB。這在一定程度上維持了CNS內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但同時也為CNS相關(guān)疾病的治療帶來了諸多限制。

2 藥物透過BBB的研究進(jìn)展

2.1 NPDDS NPDDS呈高比表面積特性，具備親和性、極性等一些特殊的表面性能。由于NP能保護(hù)藥物及促進(jìn)其被機(jī)體吸收，故NPDDS有助于解決小分子被代謝和大分子毒性等問題，即維持藥物有效劑量下的藥理學(xué)活性。但目前，NPDDS尚面臨如何降低網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬NP的比例，提高藥物透過率，增強(qiáng)藥物靶向性，提高藥物生物利用率，以及延長藥物體循環(huán)時間等問題。對載體的篩選與優(yōu)化，以及利用不同基團(tuán)或配體[如表面活性劑、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、特異性靶向基團(tuán)和外部靶向信號]對納米載體進(jìn)行修飾是當(dāng)前主要的研究方向[11]。Zheng等[12]研發(fā)了一種納米激動劑(nanoagonist，NA)，在腦缺血時使用可增加BBB的通透性，以促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)劑的吸收，其原理為通過激活腺苷2A受體以暫時性地開放BBB。研究結(jié)果顯示，NA與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)聯(lián)用，可使鼠腦缺血體積比單用SOD縮小80%左右。

由于腫瘤組織的血液灌注較其他組織略低，因此，NPDDS存在對腫瘤部位藥物遞送不充分的問題。鑒于腫瘤組織中內(nèi)皮素-1 (endothelin-1，ET1)-內(nèi)皮素A型(endothelinreceptor A，ETA)受體信號通路在維持腫瘤血管肌原性張力中的重要作用，Zhang等[13]認(rèn)為抑制ET1-ETA受體信號通路或可選擇性地改善腫瘤組織的灌注，協(xié)助納米藥物向腫瘤的遞送。該研究團(tuán)隊(duì)通過免疫熒光染色檢查發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，ETA受體在U87 MG膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中過表達(dá)；進(jìn)一步經(jīng)體內(nèi)光聲成像檢查證實(shí)，采用 0.5 mg/kg ETA受體拮抗劑(BQ123)單次給藥可有效改善腫瘤組織灌注。此外，通過體外的聲光成像證實(shí)，BQ123的單一治療可顯著改善腫瘤組織內(nèi)115 nm大小NP的聚集度和分布的均勻性；BQ123還可增加負(fù)載紫杉醇NP的治療效果，顯著延長原位移植瘤型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠的生存時間。

鑒于含有烷氧側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的氰基丙烯酸酯具有良好的親水性，李云鳳[14]設(shè)想如果以此種材料制備納米微球(nanospheres，NS)，在側(cè)鏈烷氧基團(tuán)的影響下，NS可以呈現(xiàn)出較好的親水性，同時通過Tween-80的修飾，可產(chǎn)生疊加效果，以提高其網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞(BBB的組成細(xì)胞)的藥物透過率。實(shí)驗(yàn)中，該研究團(tuán)隊(duì)以靶向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子-β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASON)為模型藥物，分別合成了兩種含有烷氧側(cè)鏈的氰基丙烯酸酯，并以不含烷氧側(cè)鏈的氰基丙烯酸正丁酯為對照組，合成了共聚或均聚的NP各3種。分別觀察這6種NP對ASON的保護(hù)效應(yīng)及遞送能力，以及透過BBB向靶部位遞送藥物能力的差異。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，含有烷氧側(cè)鏈的氰基丙烯酸酯能夠增加NP透過BBB的數(shù)量；并且起到緩釋ASON的效果，提高其生物利用率。該實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的新型腦靶向載體在未來具有運(yùn)輸核酸藥物的潛力。

蘇州大學(xué)的歐陽佳等[15]根據(jù)含硫五元環(huán)的環(huán)狀碳酸酯單體(dimethyl-trimethylene carbonate, DTC)和三亞甲基碳酸酯(trimethylene carbonate, TMC)的新型共聚物PEG-P具有較好的還原響應(yīng)性及生物相容性的特征，推測這種共聚物可作為一種良好的藥物運(yùn)輸載體。實(shí)驗(yàn)中，該研究團(tuán)隊(duì)選取載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)作為藥物靶向分子，因?yàn)樵摲肿涌筛玫匕邢蚰z質(zhì)瘤與BBB共表達(dá)的LRP1受體。研究結(jié)果表明，以共聚物PEG-P作為藥物阿霉素(doxorubicin, DOX)的載體，能夠提高DOX在BBB中的透過率，釋放于膠質(zhì)瘤部位，增強(qiáng)治療效果。

八聚精氨酸(octa arginine, R8)具有較強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透特性及陽離子特性，轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin, Tf)修飾能夠賦予該脂質(zhì)體靶向腦腫瘤的能力。據(jù)此，王曦[16]構(gòu)建了細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPP)和Tf共修飾的DOX脂質(zhì)體模型，賦予其主動靶向BBB和腫瘤細(xì)胞的高效穿膜能力。首先利用Tf介導(dǎo)脂質(zhì)體主動靶向BBB，其次利用CPP介導(dǎo)脂質(zhì)體高效穿過BBB；進(jìn)入腦組織后，再利用Tf介導(dǎo)脂質(zhì)體靶向腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，利用CPP介導(dǎo)脂質(zhì)體穿過細(xì)胞膜；最終將DOX送達(dá)腫瘤細(xì)胞質(zhì)。研究者進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Tf-R8PLP[Tf和油酸連接的R8(oleic acid-R8，OA-R8)共修飾脂質(zhì)體遞送DOX系統(tǒng)]組的小鼠生存時間較陰性對照組、DOX組和R8PLP組(OA-R8修飾脂質(zhì)體遞送DOX系統(tǒng))均顯著延長(25 d比20、22、24 d)。證實(shí)Tf-R8PLP對腦膠質(zhì)瘤具有良好的治療效果。

Alawdi等[17]研究證實(shí)納米金剛石顆?？沙晒ω?fù)載氨氯地平，表明金剛石NP作為載體運(yùn)輸化學(xué)藥物透過BBB具有一定的臨床應(yīng)用潛力。Shi等[18]在設(shè)計(jì)了靶向Angiopep-2(ANG)共軛聚(乙二醇)-b-聚(ε-己內(nèi)酯)(APP)的NP，遞送DOX以治療原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma，PCNSL)。相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，與對照組NP相比，靶向APP的NP被腦組織BCEC的攝取率顯著增高。

2.2 FUS與MBs技術(shù)

2.2.1 FUS FUS可無創(chuàng)性地開放BBB。BBB通透性在一定范圍內(nèi)可被超聲強(qiáng)度所影響，且高機(jī)械指數(shù)的體表超聲會使其通透性提高。若超聲強(qiáng)度適當(dāng)，則可僅在超聲輻照范圍內(nèi)開放BBB，而不影響腦穩(wěn)態(tài)。研究[19]結(jié)果表明，F(xiàn)US作為一種新型的功能性神經(jīng)調(diào)節(jié)技術(shù)，具有腦組織靶向性，已被用于CNS疾病的評估和治療。因FUS具有無創(chuàng)的優(yōu)勢，F(xiàn)ishman等[20]予特發(fā)性震顫患者行FUS消融治療，效果優(yōu)于有創(chuàng)的丘腦腹側(cè)中核深部腦刺激療法。美國FDA與歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)也已批準(zhǔn)使用此項(xiàng)技術(shù)。

2.2.2 FUS聯(lián)合MBs技術(shù) FUS可通過空化效應(yīng)、微環(huán)境的紊流剪切、聲輻射力等作用暫時性地開放BBB[21-22]。其中，空化效應(yīng)是指當(dāng)FUS作用于液體中MBs時，MBs所產(chǎn)生的一系列動力學(xué)過程，包括振蕩、膨脹、收縮，甚至內(nèi)爆等。除此以外，聲輻射力可使MBs移動、貼近血管內(nèi)皮細(xì)胞表面并產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。雖然FUS聯(lián)合MBs技術(shù)開放BBB已經(jīng)得到實(shí)現(xiàn)，但其機(jī)制尚未明確。

Hynynen等[23]使用MBs造影劑來加強(qiáng)FUS無創(chuàng)性開放BBB的效果，結(jié)果表明，聯(lián)合使用MBs與FUS技術(shù)，可使無創(chuàng)性開放BBB所需的超聲強(qiáng)度大幅度降低，且在藥物干預(yù)的24 h后BBB可以完全恢復(fù)正常。

張麗等[24]設(shè)立了多個對照組，研究不同MBs劑量和超聲輻照參數(shù)對小鼠BBB的影響。通過優(yōu)化參數(shù)、增加小鼠BBB的通透性，減輕對小鼠腦組織的損傷程度后發(fā)現(xiàn)，在合適的MBs劑量和超聲輻照參數(shù)(MBs劑量1.0×107MBs，超聲輻照參數(shù)0.8)條件下，診斷超聲聯(lián)合MBs能夠無創(chuàng)、靶向地開放小鼠BBB。由此可見，F(xiàn)US聯(lián)合MBs技術(shù)開放BBB具備靶向性和可逆性的特點(diǎn)。

2.2.3 FUS聯(lián)合MBs開放BBB的動物研究現(xiàn)狀 由于FUS聯(lián)合MBs可以靶向、無創(chuàng)、局部、可逆地開放BBB，因此目前已被應(yīng)用于化學(xué)治療、免疫治療、基因治療、干細(xì)胞治療及提高相關(guān)組織藥物濃度的動物研究中。

Treat等[25]以腦部接種了神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞的大鼠為模型，研究FUS對DOX的增效作用。研究結(jié)果證明，F(xiàn)US可以增強(qiáng)顱內(nèi)腫瘤的化學(xué)治療效果。同時，該研究團(tuán)隊(duì)將另一種藥物——氯化亞硝脲封裝入MBs并進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MBs不僅有效促進(jìn)FUS誘導(dǎo)的BBB開放，同時可作為藥物運(yùn)輸載體，保護(hù)藥物免于快速降解。

張文競等[26]應(yīng)用低頻FUS協(xié)同MBs促進(jìn)人源性膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(human glial cell line-derived neurotrophic factor, hGDNF)跨小鼠BBB，并建立其優(yōu)化參數(shù)，評估技術(shù)優(yōu)化后hGDNF經(jīng)靜脈注射跨小鼠BBB的可行性及安全性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)低頻FUS Flash程序?yàn)檩椪諘r長3 min、輻照時間間隔2s，造影劑Sonovue最適劑量為0.2 mL/25 g。最終證明應(yīng)用低頻FUS聯(lián)合超聲造影劑Sonovue可無創(chuàng)、定向、可逆、安全性地開放小鼠BBB，并實(shí)現(xiàn)和促進(jìn)hGDNF跨越BBB。

亦有研究[27]結(jié)果顯示，F(xiàn)US聯(lián)合MBs開放BBB可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)發(fā)生，該發(fā)現(xiàn)有利于抑郁癥的治療。對模型大鼠進(jìn)行每周1～3次不等的磁共振引導(dǎo)FUS開放BBB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未干預(yù)組比，接受每周2次治療的大鼠顯示出抗抑郁樣作用，表明FUS有誘導(dǎo)短期抗抑郁的功效。這為情緒障礙治療方法提供了新的選擇。

2.2.4 FUS聯(lián)合MBs開放BBB的局限 MBs的使用存在一定的局限性。首先，傳統(tǒng)MBs直徑為1～5 μm，大于細(xì)胞間隙(100～750 nm)，因而無法通過細(xì)胞間隙進(jìn)入組織間質(zhì)[28]。即使MBs體積能夠小到通過彌散方式透過內(nèi)皮間隙，MBs在體內(nèi)的半衰期僅數(shù)分鐘[29]，故聚集在靶區(qū)域的MBs數(shù)量將十分有限。此外，MBs過短的有效時間，加大了實(shí)驗(yàn)難度，提高了對操作者技術(shù)熟練度的要求。因此，有學(xué)者建議將NPDDS與FUS聯(lián)合MBs技術(shù)相結(jié)合，以突破相關(guān)局限，促進(jìn)藥物透過BBB。

2.3 液氣相變型納米級載藥體系 液氣相變型納米級載藥體系(即相變型納米粒)的出現(xiàn)給相關(guān)研究帶來了轉(zhuǎn)機(jī)，在一定程度上解決了FUS聯(lián)合MBs的弊端。

全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)是一種彌散度大、相對分子質(zhì)量小、無毒、有生物化學(xué)惰性、高密度、高氧溶解能力的物質(zhì)，在一定溫度下呈液態(tài)，當(dāng)達(dá)到一定溫度或存在其他刺激時，會由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài), 即液氣相變(phase change/phase shift)。經(jīng)足夠能量的超聲輻照后，PFC可在超聲的空化效應(yīng)與熱效應(yīng)作用下實(shí)現(xiàn)液氣相變，即聲學(xué)氣化作用(acoustic droplet vaporization，ADV)。相變型NP便是一類以ADV為理論依據(jù)，以納米級PFC液滴為內(nèi)核，附以殼層材料的新型載藥體系。研究[30-32]結(jié)果表明，相變型NP在血管外腫瘤顯像、聲控性釋藥等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。研究者通過高速顯微鏡評估含八氟丙烷和十氟丁烷的納米液滴在體外的相對蒸發(fā)效率，并利用其遞送大小與蛋白質(zhì)類似的分子(相對分子質(zhì)量為40 000的葡聚糖)至C57BL/6小鼠腦組織后發(fā)現(xiàn)，納米液滴的蒸發(fā)效率與穿過BBB的分子數(shù)量呈正相關(guān)。與十氟丁烷液滴相比，有更高蒸發(fā)效率的八氟丙烷液滴充當(dāng)了更好的聲學(xué)劑，可更有效地將大分子物質(zhì)遞送至大腦[33]。

就理論層面而言，在FUS的持續(xù)作用下，通過ADV形成的MBs仍然可以開放BBB。同時，NP因直徑足夠小而有機(jī)會通過開放的BBB進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，而腦實(shí)質(zhì)的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)能進(jìn)一步促進(jìn)NP在腦組織內(nèi)的聚積[34-35]。以神經(jīng)保護(hù)藥物為例，若將其鑲嵌在NP的殼層材料中，將具有生物靶向能力的配體修飾在NP殼層表面，那么NP便能在接觸神經(jīng)細(xì)胞時被特異性識別、吞噬。神經(jīng)保護(hù)藥物可隨殼層材料的不斷降解而被不斷釋放，從而實(shí)現(xiàn)在局部組織內(nèi)持續(xù)釋藥，靶向保護(hù)受損的神經(jīng)細(xì)胞。

3 總結(jié)與展望

BBB的存在給CNS相關(guān)疾病的治療帶來了諸多困難與限制。近幾年，納米材料的問世，為解決這一問題提供了技術(shù)突破。納米材料的微體積特性使其具有穿過被短暫開放的BBB的能力，而構(gòu)造兩親性的NPDDS為解決藥物穿透BBB到達(dá)CNS，以及藥物的緩釋創(chuàng)造了條件。但截至目前，納米材料在生物學(xué)方面的應(yīng)用大多處于基礎(chǔ)研究階段， NPDDS的安全性、靶向性、有效性和可行性等問題仍缺乏一個衡量的金標(biāo)準(zhǔn)。同時，對于NPDDS在腦內(nèi)的具體分布，其在循環(huán)系統(tǒng)中的代謝性能與毒性都尚未明確[36]。故納米材料進(jìn)入臨床應(yīng)用還有一段很長的路要走。因此，在基礎(chǔ)研究水平進(jìn)行NPDDS遞藥效率和生物安全性的研究就顯得尤為迫切。

BBB對納米材料制劑直徑的要求較高[37]。FUS則為有效開放BBB創(chuàng)造了條件，協(xié)同MBs技術(shù)有效促進(jìn)藥物進(jìn)入BBB，抵達(dá)CNS發(fā)揮作用。然而，隨著研究的深入，MBs的局限性也逐漸顯現(xiàn)，如傳統(tǒng)MBs不具備跨細(xì)胞間隙進(jìn)入組織間質(zhì)的能力，在體內(nèi)的半衰期時間短等。因此，當(dāng)務(wù)之急就是尋找合適的納米材料聯(lián)合FUS，利用生物靶向(特異性結(jié)合LRP)和聲控靶向(局部開放BBB)的雙重效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)CNS相關(guān)藥物在靶組織的有效釋放，為CNS相關(guān)疾病的治療提供新思路。