‘全紅’楊PdHY5轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及功能分析

付妍妍，趙志明，徐立人，王進(jìn)茂*

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北保定 071000；2 北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083)

花青素是一類重要的而且天然存在的植物次生代謝產(chǎn)物，是廣泛存在于植物體中的一類水溶性色素，屬于黃酮類化合物[1]?；ㄇ嗨厣锖铣赏肥艿浇Y(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，結(jié)構(gòu)基因直接編碼花青素代謝生物合成途徑中所需要的酶，主要包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(F3H)、黃烷酮-3′-羥化酶(F3′H)、黃烷酮-3′5′-羥化酶(F3′5′H)、花色苷合成酶(ANS)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)和類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)等[2]。轉(zhuǎn)錄因子通過與結(jié)構(gòu)基因啟動子中相應(yīng)順勢元件結(jié)合，調(diào)控花青素的生物合成過程中一個或多個基因的表達(dá)[3]。HY5(ELONGATED HYPOCOTYL 5)轉(zhuǎn)錄因子主要通過3種方式在花青素的生物合成與積累中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。第一種方式為植物的光感受器在感受到光信號后，直接激活類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)花青素的積累；另一種方式為HY5通過結(jié)合 MYB 轉(zhuǎn)錄因子及 MYB-bHLH-WD40 (MBW) 三者復(fù)合體間接地影響花青素的合成與積累；第三種方式為通過與其他轉(zhuǎn)錄因子(如BBX)形成蛋白復(fù)合體共同調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，間接調(diào)控花青素的積累。蘋果MdHY5蛋白可以結(jié)合MdMYB10 基因啟動子區(qū)域的G-box(CACGTC) 元件，從而促進(jìn)其結(jié)構(gòu)基因MdDFR、MdUF3GT及MdF3H等表達(dá)， 進(jìn)而促進(jìn)了蘋果中花青素的積累[5]。相似地，在光誘導(dǎo)下，血橙中的CsHY5通過與一種MYB 轉(zhuǎn)錄因子Ruby的啟動子結(jié)合，間接促進(jìn)了其果皮中花青素的積累[6]。草莓FvHY5通過誘導(dǎo)bHLH 類轉(zhuǎn)錄因子FvbHLH9 的轉(zhuǎn)錄，同時FvHY5 也能與 FvbHLH9蛋白互作，共同激活結(jié)構(gòu)基因FvCHS及FvDFR的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[7]。

楊樹(Populus)屬于楊柳科(Salicaceae)，具有分布廣、適應(yīng)性強、品種多等特點，是世界人工林發(fā)展的三大速生樹種之一[8]。楊樹生長迅速、繁殖容易、適應(yīng)性強，有重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟(jì)價值?！t’楊(Populusdeltoides‘Quanhong’)是由美洲黑楊‘中林2025’(Populusdeltoidescv. ‘Zhonglin 2025’)芽變而成的紅葉品種，因其較高的觀賞價值而備受關(guān)注?！辛?025’葉片呈綠色，而‘全紅’楊的葉片隨季節(jié)由紫紅色-紫綠色-橙色逐漸變化，具有良好的觀賞特性[9-10]。研究紅葉楊的成色機理是林木葉色育種工作的重中之重，本研究在課題組前期對‘全紅’楊轉(zhuǎn)錄組的研究基礎(chǔ)上，篩選出了可能參與葉色調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PdHY5，構(gòu)建過表達(dá)載體pNP1302-35S-PdHY5并遺傳轉(zhuǎn)化煙草，對其進(jìn)行功能驗證。利用qRT-PCR進(jìn)一步分析了各過表達(dá)株系中外源PdHY5和內(nèi)源花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平，同時測定了各株系葉片中的花色素苷含量，為彩葉新樹種的創(chuàng)制及遺傳改良工作提供重要的理論依據(jù)及基因資源。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試的材料為栽植于河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗苗圃(38.83°N，115.45°E)的‘全紅’楊植株，于2018 年 7 月對‘全紅’楊品種進(jìn)行葉片采集和RNA的提取。

1.2 方 法

1.2.1 ‘全紅’楊PdHY5基因的生物信息學(xué)分析‘全紅’楊PdHY5基因CDS序列由載體構(gòu)建過程中測序結(jié)果獲得。利用DANMAN進(jìn)行序列比對，利用ExPASy對PdHY5蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，利用TMHMM預(yù)測蛋白是否具有跨膜區(qū)域；利用網(wǎng)站SOMPA分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。為預(yù)測PdHY5基因潛在的功能，利用在線網(wǎng)站STRING進(jìn)行PdHY5互作蛋白預(yù)測。

1.2.2 ‘全紅’楊PdHY5基因表達(dá)載體的構(gòu)建利用RNA提取試劑盒(張家口賽諾生物有限公司)提取‘全紅’楊總RNA，使用生物分析儀(Agilent 2100)測定 RNA 樣品的濃度和質(zhì)量。使用“哧溜”極速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京聚合美生物科技有限公司)合成cDNA。在NCBI網(wǎng)站上搜索毛果楊PtHY5基因序列，設(shè)計含NcoⅠ和PmlⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點的引物F(5′-CCATGGATGCAAGAACAA-GCAGCCAGTT-3′)和R(5′-CACGTGTCATGA-AGAGCCATCTGCATTAGCAC-3′)用于‘全紅’楊cDNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為模板5 μL，2×M5 Hiper plus Taq HiFi PCR mix 50 μL，正反引物各2.5 μL，ddH2O 40 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 25 s，58 ℃ 退火25 s，72 ℃延伸1 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。最后用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測并回收。

將回收的PCR產(chǎn)物連接pUCm-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR檢測，將條帶正確的菌液送至公司測序，測序結(jié)果與毛果楊PtHY5基因比對。提取比對結(jié)果正確的菌液質(zhì)粒和pCAMBIA1302質(zhì)粒，使用NcoⅠ和PmlⅠ限制性核酸內(nèi)切酶酶切兩種質(zhì)粒。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收條帶正確的酶切產(chǎn)物。用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取陽性單菌落進(jìn)行鑒定，并送至公司測序。將測序驗證正確的菌液提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落進(jìn)行 PCR 鑒定，并命名為pNP1302-35S-PdHY5。對于PCR檢測正確的菌液加入1/2體積的75%甘油置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 遺傳轉(zhuǎn)化和再生培養(yǎng)基的配制共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1 L)：MS+30 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂。

篩選培養(yǎng)基(1 L)：MS+0.3 mg/L 6-芐基腺嘌呤(6-BA)+0.1 mg/L吲哚丁酸(IBA)+ 10 mg/L潮霉素(Hyg)+ 300 mg/L特美汀(Tim)，調(diào)節(jié)pH至5.8～ 6.2。

生根培養(yǎng)基(1 L)：MS+0.3 mg/L IBA +10 mg/L Hyg + 300 mg/L Tim,調(diào)節(jié)pH至5.8～6.2。

農(nóng)桿菌培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基+50 mg/L卡那霉素(Kan)+50 mg/L利福平(Rif)。

1.2.4 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及PCR鑒定采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，將含有pNP1302-35S-PdHY5重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃活化培養(yǎng) 16～18 h 至OD600在0.4～0.6之間用于轉(zhuǎn)化。將剪好的煙草葉片在農(nóng)桿菌中侵染8 min，無菌濾紙吸干多余菌液，平鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上。置于黑暗條件下2～3 d后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上，待再生芽長至1 cm時剪下接入生根培養(yǎng)基中，待根系健壯移栽至溫室并進(jìn)行分子鑒定。

轉(zhuǎn)基因植株的DNA提取采用DNA 提取試劑盒(康為世紀(jì))，以引物35S-F、PdHY5-R檢測目的基因PdHY5，以引物HPTⅡ-F、HPTⅡ-R檢測標(biāo)記基因HPTⅡ，引物序列如表1所示。以pNP1302-35S-PdHY5重組質(zhì)粒作為陽性對照，野生型煙草葉片 DNA 作為陰性對照，對轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行PCR檢測。

表1 引物序列表

1.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的熒光定量qRT-PCR分析對PCR鑒定為陽性的植株，利用RNA提取試劑盒提取野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的葉片RNA，利用‘哧溜’反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以煙草β-actin為內(nèi)參基因，利用DNAMAN軟件設(shè)計PdHY5基因和花青素合成通路中關(guān)鍵酶基因的qRT-PCR引物如表1。配制體系如下：2×MagicSYBR Mixture 10 μL，前后引物各0.4 μL, Template cDNA 1 μL，ROX Reference Dye I 0.2 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。每個處理3次重復(fù)，利用公式2-ΔΔCt法計算野生型及轉(zhuǎn)基因煙草中PdHY5基因和花青素合成通路中關(guān)鍵酶基因的相對表達(dá)量。

1.2.6 花色素苷相對含量的測定選取野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草株系第一片成熟葉片，參照Rabino等[11]的方法，進(jìn)行葉片花青素相對含量的測定。首先用電子天平稱取剪碎的葉片0.1 g, 置于 15 mL離心管中，加入10 mL 1%鹽酸甲醇提取液，32 ℃恒溫箱中提取4～5 h。離心后取上清液，測定在530和657 nm的吸光值A(chǔ)530和A657，每個處理3個重復(fù)?；ㄉ剀障鄬坑嬎愎綖椋害=(A530-1/4A657)/W；式中，W表示葉片鮮重。

2 結(jié)果與分析

2.1 PdHY5轉(zhuǎn)錄因子序列分析

毛果楊PtHY5與‘全紅’楊PdHY5基因序列比對結(jié)果如圖1所示，PdHY5基因有3個單堿基突變(SNP位點)，分別位于5′端第151位、283位和289位。堿基的突變造成‘全紅’楊氨基酸序列第51位由A(丙氨酸)突變成T(蘇氨酸)，151位由R(精氨酸)突變成G(甘氨酸)。其余位置氨基酸一致。

圖中黑色表示完全保守的核苷酸序列，序列順序為5′到3′圖1 基因PtHY5(毛果楊)與PdHY5(‘全紅’楊)序列比對The black represents the completely conserved nucleotide sequence, the sequence order is 5′ to 3′.Fig.1 Sequence alignment of PtHY5 (Populus trichocarpa) and PdHY5 (Populus deltoides ‘Quanhong’) gene

2.2 PdHY5蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件ExPASy分析可知，PdHY5基因共編碼169個氨基酸，該蛋白分子式為C763H1278N252O271S4，蛋白分子量為18 446.31 Da，理論等電點為9.59，此蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為72.36，將其分類為不穩(wěn)定蛋白。親水性平均值(GRAVY)為-1.183，該蛋白為親水性蛋白。HY5蛋白的二級結(jié)構(gòu)由45.56% 的α-螺旋、2.37% 的β-折疊、52.07% 的無規(guī)則卷曲構(gòu)成，該蛋白不包含延伸鏈結(jié)構(gòu)。TMHMM分析該蛋白不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，表明PdHY5蛋白為膜內(nèi)蛋白。

2.3 PdHY5蛋白的多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

PdHY5蛋白的序列比對結(jié)果(圖2)顯示，篩選到與其相近的幾個物種的HY5蛋白序列，分別為毛果楊(Populustrichocarpa)、旱垂柳(Salixmatsudana)和芒果(Mangiferaindica)等，其中PdHY5蛋白與毛果楊PtHY5相似性最高(98.82%)。采用NJ法構(gòu)建PdHY5與其他物種HY5蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖3)表明，PdHY5蛋白與毛果楊(Populustrichocarpa)屬于同一分枝，親緣關(guān)系最為接近。

圖3 PdHY5蛋白與其他植物HY5蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of PdHY5 protein and HY5 protein in other plants

2.4 PdHY5基因功能預(yù)測

為了預(yù)測PdHY5基因潛在的功能，鑒于‘全紅’楊PdHY5蛋白與毛果楊PtHY5蛋白僅存在2個氨基酸殘基的差異及目前尚無‘全紅’楊參考基因組，因此將本研究獲得的PdHY5蛋白序列導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，以毛果楊為參考基因組，進(jìn)行互作蛋白預(yù)測。結(jié)果(圖4)表明，至少預(yù)測出了5個與PdHY5互作的蛋白。這些蛋白參與了花青素的合成代謝、形態(tài)發(fā)生及光合作用等生物過程，同時，與之互作的轉(zhuǎn)錄因子hy5樣異構(gòu)體、E3泛素蛋白連接酶RFWD2及光調(diào)節(jié)鋅指蛋白COP1均參與了花青素的合成代謝，這也進(jìn)一步提示，PdHY5蛋白可能確實具有直接或間接調(diào)控花青素的生物合成及代謝的功能。

節(jié)點之間的連線表示兩個蛋白有助于共同的功能，其中，藍(lán)色關(guān)聯(lián)線表示來自數(shù)據(jù)庫中的關(guān)聯(lián)；紫色關(guān)聯(lián)線為實驗確定；黃色關(guān)聯(lián)線為文本挖掘；黑色關(guān)聯(lián)線為共表達(dá)；灰色關(guān)聯(lián)線表示互作蛋白之間具有同源性圖4 以毛果楊蛋白數(shù)據(jù)庫為參考構(gòu)建的PdHY5蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖The lines between the nodes indicate that the two proteins contribute to a common function, where the blue lines represent the association from the database; the purple lines are experimentally determined; the yellow lines are text mining; the black association lines are co-expression and the grey lines indicate homology between interacting proteinsFig.4 Interaction network map of PdHY5 protein based on P. trichocarpa protein database

2.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以‘全紅’楊cDNA為模板，PCR擴(kuò)增后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測到510 bp的條帶，與目的條帶大小一致(圖5，A)。對重組過表達(dá)載體pNP1302-35S-PdHY5用NcoⅠ 和PmlⅠ 進(jìn)行酶切檢測，電泳結(jié)果(圖5，B)顯示，目的條帶位置準(zhǔn)確，過表達(dá)載體構(gòu)建成功。將重組表達(dá)載體 pNP1302-35S-PdHY5轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后挑取單個菌落搖菌，進(jìn)行PCR驗證。由圖5，C可以看出，在510 bp處有一條清晰的條帶，證明重組質(zhì)粒pNP1302-35S-PdHY5成功轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中。圖6為構(gòu)建成功的載體示意圖， 以PdHY5基因為目的基因，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hygromycin phosphotransferase gene；HPTⅡ)作為標(biāo)記基因。

A. PdHY5基因克?。籅. 過表達(dá)載體的酶切檢測；C. 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的檢測圖5 重組表達(dá)載體構(gòu)建過程A is the cloning of PdHY5 gene, B is the enzyme digestion detection of the overexpression vector, and C is the detection of Agrobacterium transformed by the overexpression vectorFig.5 Construction process of recombinant expression vector

RB. T-DNA 右邊界；35S. CaMV35S polyA；tNOS. 終止子；LB. T-DNA 左邊界圖6 植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建示意圖RB. T-DNA right border; 35S. CaMV35S polyA; tNOS. Nopaline synthase terminator; LB. T-DNA left border Fig.6 Schematic diagram of the construction of plant transformation vector

2.6 轉(zhuǎn)PdHY5基因煙草的獲得及鑒定

圖7為以未轉(zhuǎn)化葉片為對照，用含有pNP1302-35S-PdHY5重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染煙草葉片，經(jīng)過潮霉素篩選得到抗性植株及移栽到溫室的過程。

A和B分別為野生型煙草在不含Hyg和含10 mg/L Hyg的分化培養(yǎng)基上的結(jié)果；C為轉(zhuǎn)化葉片在含10 mg/L Hyg的篩選培養(yǎng)基上出芽；D為得到的轉(zhuǎn)基因植株；E為轉(zhuǎn)基因煙草在10 mg/L的生根培養(yǎng)基中生根；F為轉(zhuǎn)基因煙草移栽至溫室圖7 非轉(zhuǎn)化葉片為對照以及轉(zhuǎn)化葉片出芽到轉(zhuǎn)基因煙草的獲得A and B are the results of wild-type tobacco on differentiation medium without Hyg and with 10 mg/L Hyg, respectively; C is the result of transformed leaves sprout on the medium containing 10mg/L Hyg; D shows the obtained transgenic plants; E shows the transgenic tobacco rooting in 10 mg/L rooting medium; F shows the transgenic tobacco transplanted to the greenhouseFig.7 Non-transformed leaves as controls and transformed leaves sprouted into transgenic tobacco

對過表達(dá)煙草植株提取DNA，擴(kuò)增目的基因

PdHY5和標(biāo)記基因HPTⅡ，結(jié)果如圖8所示，共獲得4個過表達(dá)株系，均擴(kuò)增出與陽性對照一致的510 bp目的基因條帶(圖8，A)和1000 bp左右HPTⅡ 基因條帶(圖8，B)，表明目的基因插入煙草基因組中并穩(wěn)定存在，將它們分別命名為S1、S2、S3、S4。

將野生型煙草基因表達(dá)量定為“1”，對4個轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PdHY5基因和花青素合成通路中關(guān)鍵酶基因CHS、F3H及FLS的表達(dá)量檢測，如圖9所示，過表達(dá)PdHY5基因的煙草中花青素合成通路中的3個關(guān)鍵酶基因表達(dá)量較野生型均顯著上調(diào)，其中S4株系上調(diào)最多，PdHY5、CHS、F3H、FLS相對表達(dá)量分別為對照的109.57、25.41、18.53和12.94倍。這表明過表達(dá)‘全紅’楊PdHY5基因能調(diào)控?zé)煵荼旧砘ㄇ嗨睾铣赏分嘘P(guān)鍵酶基因的表達(dá)。本研究選擇PdHY5表達(dá)量較高的3個株系(S2、S3、S4)進(jìn)行花色素苷含量的測定。

M.DL2000；P.陽性質(zhì)粒；WT. 野生型煙草； S1、S2、S3、S4. 4個轉(zhuǎn)基因株系 圖8 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定M. DL2000； P. Positive plasmid； WT. Wild-type tobacco； S1, S2, S3,and S4. 4 transgenic tobacco linesFig.8 PCR identification of transgenic tobacco

柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖10同圖9 轉(zhuǎn)基因煙草外源PdHY5基因和內(nèi)源花青素合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)Different normal letters on the columns indicate significant differences (P<0.05), the same as Fig.10Fig.9 Expression analysis of exogenous PdHY5 gene and endogenous anthocyanin synthesis pathway key enzyme genes in transgenic tobacco

2.7 花色素苷含量的測定

進(jìn)一步對煙草進(jìn)行花色素苷含量進(jìn)行測定(圖10)。結(jié)果表明3個過表達(dá)株系S2、S3、S4的花色素苷含量分別比對照顯著增加了128.23%、97.36%和134.20%，表明異源過表達(dá)‘全紅’楊PdHY5基因?qū)煵荼旧砣~片中花色素苷含量具有明顯積累作用。

圖10 不同煙草株系花色素苷相對含量對比Fig.10 Comparison of the relative content of anthocyanins in different tobacco lines

3 討 論

HY5屬于bZIP家族，是第一個被發(fā)現(xiàn)的參與光形態(tài)建成的轉(zhuǎn)錄因子[12-13]，近年來被證實在其他方面也發(fā)揮著重要的作用。例如，花青素的合成調(diào)控[14]、響應(yīng)光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]等。本研究在‘全紅’楊中克隆的PdHY5基因CDS序列長510 bp，共編碼169個氨基酸。對PdHY5進(jìn)行蛋白序列比對，匹配到的均為木本植物，與同屬的毛果楊親緣關(guān)系最近，曹詩夢等[16]在對葡萄風(fēng)信子MaHY5蛋白與其他植物HY5蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析中也發(fā)現(xiàn)，HY5蛋白分為單子葉和雙子葉兩個進(jìn)化枝，同科屬植物首先聚為一類。這從進(jìn)化的角度驗證了不同科屬植物間的親緣關(guān)系以及HY5在進(jìn)化過程中的保守性。

本研究通過構(gòu)建過表達(dá)載體并遺傳轉(zhuǎn)化煙草，獲得的轉(zhuǎn)基因株系中花色素苷相對含量顯著高于野生型。這與HY5在其他植物中促進(jìn)花青素積累的研究結(jié)果一致。桃中 PpHY5 能夠激活花青素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因PpCHS1、PpCHS2、PpDFR1 的表達(dá)，最終促進(jìn)桃中花青素的積累[17]。B-box(BBX)家族是一組鋅指蛋白，毛果楊PtBBX23 對花青素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因CHS、F3H及 MYB 轉(zhuǎn)錄因子 MYB115、MYB119 具有轉(zhuǎn)錄激活的作用，HY5 通過 C 端 bZIP 結(jié)構(gòu)域與PtBBX23 基因 N 端的第二個 B-box 相互作用來增強對下游基因的激活活性，從而誘導(dǎo)花青素的合成[18]。CHS被廣泛認(rèn)為是花青素生物合成途徑中第一個重要的酶[19-21]，并且CHS的轉(zhuǎn)錄是通過HY5蛋白依賴的方式和光介導(dǎo)的[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PdHY5基因煙草在花青素合成通路中結(jié)構(gòu)基因CHS、F3H、FLS表達(dá)量顯著上調(diào)，說明異源過表達(dá)‘全紅’楊PdHY5基因，調(diào)控了煙草本身花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草中花青素的合成與積累。

雖然花色素苷的含量升高，但轉(zhuǎn)基因煙草未發(fā)現(xiàn)變紅的現(xiàn)象。推測其原因可能與外源基因整合的位點有關(guān)，當(dāng)整合到與生長發(fā)育有關(guān)的基因附近時，外源基因的表達(dá)就會受生長發(fā)育基因的調(diào)控，而轉(zhuǎn)基因煙草培育時間較短，導(dǎo)致其相關(guān)表型還未完全體現(xiàn)。此外，qRT-PCR結(jié)果顯示PdHY5基因雖然在轉(zhuǎn)基因株系中過表達(dá)，但可能是由于受到泛素化降解等某些途徑的抑制，導(dǎo)致其蛋白水平較低，還有待于通過Western Blot方法檢測蛋白含量來進(jìn)一步驗證。另外，可能是因為影響植物變色的因素有很多，許多植物在較低的溫度下才能呈現(xiàn)出彩葉效果。史寶勝研究表明，晝夜溫差大于15 ℃有利于美人梅、紫葉李表現(xiàn)出彩葉[25]。張少平等[26]研究表明在高溫和強光環(huán)境下，紫背天竺葉片會退變成綠色。土壤的酸堿度對葉片呈色也有一定的影響，一些植物在微堿性或中性土壤中促進(jìn)呈色，酸性土壤則會生長不良[27]。綜上，植物葉片呈色的過程可能是受生長發(fā)育調(diào)控和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果。

本研究對‘全紅’楊PdHY5基因在花青素合成調(diào)控過程中的功能進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)其在一定程度上能促進(jìn)花青素的合成，這也為今后分子手段培育林木彩葉植物提供了一定的理論參考。