雞毒支原體病及其防治技術(shù)

黃惠興，陳明望，莊曉娜，鄭嘉瑩，李逸飛，李天宇通信作者

(1.中山市黃圃鎮(zhèn)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 中山 528400；2.中山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 中山 528400；3.廣西大學(xué)，廣西 南寧 530004)

0 引言

雞毒支原體(mycoplasma gallisepticum，MG)又稱為雞敗血支原體，可以通過(guò)飛沫或垂直傳播進(jìn)入家禽體內(nèi)，引起家禽產(chǎn)生呼吸道疾病[1]，并可使家禽淋巴細(xì)胞萎縮壞死，免疫器官受損，產(chǎn)生免疫抑制，容易與其他病原進(jìn)行混合感染，導(dǎo)致死亡率增高，給全球家禽業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。由于MG特殊的免疫逃逸機(jī)制，可在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活，導(dǎo)致病禽終身帶毒，且存在散毒風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)階段MG滅活疫苗和弱毒疫苗都存在一定的免疫缺陷，滅活疫苗免疫保護(hù)效果較弱；弱毒疫苗免疫存在散毒和毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。在藥物治療方面，MG臨床常用抗生素，但容易產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)一步加劇了MG防控難度。本文針對(duì)MG病原學(xué)特點(diǎn)和流行特點(diǎn)，建議家禽養(yǎng)殖業(yè)優(yōu)化管理模式，做好生物安全防控，培育優(yōu)質(zhì)MG凈化雞群。

1 病原學(xué)特點(diǎn)

雞毒支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間的原核生物，無(wú)細(xì)胞壁，僅細(xì)胞膜包裹，唯一的細(xì)胞器是核糖體，雞毒支原體細(xì)胞長(zhǎng)度為250～500 nm。在電子顯微鏡下可觀察到其呈現(xiàn)多種形態(tài)，常見(jiàn)的3種形態(tài)主要是球狀、絲狀和桿狀。雞毒支原體采用革蘭氏染色著色效果較差，呈弱陰性，經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色液染色著色效果較好，呈淡紫色。雞毒支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類以及四環(huán)素類藥物敏感，但易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)作用于細(xì)胞壁的抗菌藥物(磷霉素、糖肽或β-內(nèi)酰胺類抗生素)以及第一代喹諾酮類藥物、磺胺類藥物、多黏菌素、甲氧芐啶和利福平耐受力較強(qiáng)。對(duì)紫外線敏感，陽(yáng)光直射就能使其迅速喪失活力，一般常用的化學(xué)消毒劑(含氯溶液、乙醇、乙醚、過(guò)氧乙酸等)能將其迅速殺死，50℃條件下加熱20 min也能將其滅活。雞毒支原體對(duì)雞血紅細(xì)胞具有很強(qiáng)的吸附性，這一特性常用于與非致病性禽源支原體鑒別診斷。

2 致病機(jī)制

2.1 病理?yè)p傷

雞毒支原體進(jìn)入雞體后通過(guò)其單極末端的泡狀結(jié)構(gòu)釋放出細(xì)胞黏附素GapA、CrmA蛋白使其吸附到宿主氣管黏膜上，同時(shí)利用微管透過(guò)黏膜將自身DNA、核酸酶注入到宿主細(xì)胞內(nèi)，再利用宿主細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行大量繁殖，使氣管纖毛細(xì)胞病變，纖毛運(yùn)動(dòng)能力逐漸喪失，氣管內(nèi)的異物以及黏性分泌物無(wú)法排出體外，會(huì)殘留在肺泡和細(xì)支氣管末端，逐漸導(dǎo)致肺小葉細(xì)胞壞死，肺部出現(xiàn)組織肉病變，造成雞出現(xiàn)呼吸困難。并逐漸由呼吸道轉(zhuǎn)移侵入到全身各個(gè)組織器官，病禽其他臟器也可見(jiàn)肝周炎、氣囊炎和腹膜炎等。

2.2 免疫損傷

雞毒支原體粘附在氣管黏膜表面時(shí)其細(xì)胞膜表面的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid-associated membrane proteins，LAMPs)與宿主細(xì)胞上Toll樣受體(Toll like receptor ，TLRs)相結(jié)合，其中TLR2主要是介導(dǎo)誘導(dǎo)炎性因子釋放、促凋亡和抗凋亡等[3]。雞毒支原體能與TLR2受體結(jié)合通過(guò)膜通道蛋白將信號(hào)傳遞至宿主細(xì)胞膜內(nèi)，引起免疫應(yīng)答，使B細(xì)胞、T細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞大量增殖，同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation factor，MyD88)和TIRAP(TLR containing adapter protein)依賴途徑，使下游分子磷酸化，從而激活NF-κB(nuclear factor-KB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路，這2類通路可調(diào)控許多炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，并可影響炎癥和免疫反應(yīng)。NF-κB信號(hào)通路中激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)激酶(NIK)，進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)，NF-κB由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的細(xì)胞核中，誘導(dǎo)下游炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL1β)、白細(xì)胞介素6(IL6)以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子加速凋亡造成組織炎性損傷(見(jiàn)圖1)。

圖1 Toll-like receptor，NF-κB，MAPK 信號(hào)通路[4]

2.3 免疫抑制

當(dāng)雞毒支原體透過(guò)黏膜屏障后開(kāi)始侵入非吞噬細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞HD11，雞毒支原體在感染HD11后雞體抗氧化能力降低，引起細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，破壞線粒體，釋放線粒體DNA，并產(chǎn)生活性氧(ROS)，過(guò)量的ROS積累引發(fā)雞體的氧化應(yīng)激和異常的細(xì)胞凋亡[5]。吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量改變以及結(jié)構(gòu)破壞都會(huì)嚴(yán)重影響免疫器官的功能，在雞毒支原體感染雞體期間，會(huì)造成淋巴細(xì)胞的萎縮以及壞死，導(dǎo)致免疫失調(diào)，造成法氏囊、胸腺和脾臟等免疫器官受損，破壞了雞的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫抑制。

2.4 免疫逃逸

雞毒支原體的基因中涉及表面抗原多樣化的數(shù)量非常多，使得LAMPs可以以較高頻率發(fā)生變異，特別是細(xì)胞粘附素可產(chǎn)生高度突變，使支原體可以逃避宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，所以禽類一旦感染雞毒支原體，將長(zhǎng)期處于慢性應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致雞體的免疫功能遭到抑制，使雞毒支原體更容易達(dá)到免疫逃逸。

3 流行特點(diǎn)

3.1 易感動(dòng)物

雞毒支原體可感染不同日齡的禽類，尤其雞和火雞最易感，其中幼齡雞和純種雞的發(fā)病率和死亡率最高。MG感染成年雞通常不表現(xiàn)出臨床癥狀，呈隱性感染。然而幼齡雞感染后通常表現(xiàn)為呼吸困難甚至肺炎等癥狀，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡，死亡率高達(dá)30%。MG一年四季均可發(fā)生，尤其寒冷季節(jié)感染率最高。

3.2 傳播方式

MG的傳播途徑有兩種方式，即水平傳播和垂直傳播，以后者傳播方式為主。水平傳播是指病原通過(guò)飛沫的方式進(jìn)行空氣傳播，如咳嗽和噴嚏。此外，健康禽類接觸污染的飼料、水及土壤也可感染。垂直傳播是指帶菌母雞經(jīng)蛋傳播給雛雞，或者帶菌公雞在交配時(shí)通過(guò)精液傳播給母雞從而使母雞感染。

3.3 流行情況

1976年，雞毒支原體首次在我國(guó)分離出來(lái)。1986年，冀錫霖等[6]對(duì)全國(guó)20個(gè)省(區(qū))雞場(chǎng)開(kāi)展MG的流行病學(xué)調(diào)查研究，試驗(yàn)結(jié)果顯示雞群中MG的平均陽(yáng)性率高達(dá)78.5%，表明MG在我國(guó)多個(gè)省份已經(jīng)迅速傳播，將嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。2018—2019年，謝昊晉[7]采集江蘇省未免疫雞毒支原體疫苗的規(guī)?；u場(chǎng)血清樣本3 112份血樣，陽(yáng)性率為55.27%。與此同時(shí)，2018—2019年，上海市連續(xù)監(jiān)測(cè)2年養(yǎng)殖戶專業(yè)戶和散養(yǎng)戶的雞群MG血清抗體陽(yáng)性率的感染情況，其中養(yǎng)殖戶專業(yè)戶MG抗體陽(yáng)性率分別為79.46%(2018年)和81.65%(2019年)，而散養(yǎng)戶MG抗體陽(yáng)性率分別為50%(2018年)和59.49%(2019年)，由此看出養(yǎng)殖專業(yè)戶的雞群MG感染情況比散養(yǎng)戶嚴(yán)重。

4 臨床癥狀

雛雞感染MG后的主要臨床癥狀為呼吸啰音、打噴嚏和咳嗽，鼻腔內(nèi)有黏液性鼻液，往往會(huì)堵塞鼻孔影響呼吸。眼結(jié)膜潮紅、流淚增多、眼瞼腫脹。另外，病雞食欲減退、精神萎靡、生長(zhǎng)速度慢、體重減輕。

成年雞感染MG后，臨床癥狀類似于雛雞，但相比雛雞較為緩和。產(chǎn)蛋病雞產(chǎn)蛋率下降，產(chǎn)軟殼蛋，種蛋受精率、孵化率降低，孵化出來(lái)的雛雞往往體質(zhì)較弱。感染嚴(yán)重則還會(huì)出現(xiàn)肺炎、心包炎、肝被膜炎等[1]。

當(dāng)MG感染雞群后，容易引起雞群繼發(fā)大腸桿菌、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒混合感染，導(dǎo)致呼吸道癥狀加重，產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，導(dǎo)致雞群死亡率增高，給養(yǎng)殖場(chǎng)戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

剖檢發(fā)現(xiàn)雞只的鼻孔、氣囊、氣管以及支氣管中存在較多黏性液體或者卡他性分泌物，氣管壁發(fā)生水腫，感染前期氣囊膜變厚且呈灰白色不透明狀，感染后期可見(jiàn)氣囊壁上存在干酪樣滲出物。蛋雞剖檢時(shí)可見(jiàn)輸卵管炎癥，與大腸桿菌混合感染時(shí)，可見(jiàn)纖維性心包炎和肝周炎。

5 診斷檢測(cè)

5.1 病原分離

MG病原分離鑒定常用人工培養(yǎng)基(FM-4培養(yǎng)基、改良Frey液體培養(yǎng)基和PPLO培養(yǎng)基)、雞胚、雞組織培養(yǎng)物分離病原體。選用疑似感染雞只的上呼吸道滲出液(氣管、氣囊或鼻竇滲出液等)，接種到改良Frey液體培養(yǎng)基中進(jìn)行初步分離培養(yǎng)。待液體培養(yǎng)基顏色從玫瑰紅初變?yōu)辄S色時(shí)，用接種環(huán)接種到固體培養(yǎng)板上，待其成長(zhǎng)為典型的“煎蛋”狀菌落，挑起單個(gè)菌落再次接種到改良Frey液體培養(yǎng)基中并重復(fù)以上過(guò)程3次以上即可認(rèn)為得到一株MG純培養(yǎng)物。

將分離純化后的待檢培養(yǎng)液離心，取其沉淀物涂片，用瑞氏-姬姆薩染色液染色后，進(jìn)行鏡檢。

MG的病原分離鑒定是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但工作量大，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，不適合應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐上的快速診斷和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

5.2 血清學(xué)檢測(cè)

平板凝集試驗(yàn)(SPA)是應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法。其優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)結(jié)果清晰、簡(jiǎn)便快速、成本低等，但會(huì)出現(xiàn)一些非特異性凝集反應(yīng)，假陽(yáng)性的概率較高。

血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢驗(yàn)血清中IgG抗體具有特異準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可以進(jìn)一步證實(shí)SPA的檢測(cè)結(jié)果。但HI的靈敏度較差，操作繁瑣，試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，并且IgG抗體在病雞感染后3周才能通過(guò)HI檢測(cè)出陽(yáng)性，因此HI診斷方法在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用較少。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)與SPA相比，特異性強(qiáng)、結(jié)果易判斷，適合大規(guī)模血清樣品的檢測(cè)；與HI相比，敏感性雖然稍低，但特異性強(qiáng)。因此在當(dāng)前推廣規(guī)?；B(yǎng)殖、大批量樣品檢測(cè)的情況下，多通過(guò)ELISA進(jìn)行檢測(cè)。

5.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)與血清學(xué)診斷方法相比，靈敏度和特異性較高。

楊美等[8]根據(jù)MG和MS基因的特點(diǎn)設(shè)計(jì)合成特異性引物，優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，建立能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)MG和MS的雙重PCR方法。趙杰等[9]從常用引物中選出靈敏度最高的mgc2基因設(shè)計(jì)的引物建立MG套式PCR檢測(cè)方法，擴(kuò)增基因片段與GenBank中收錄的相關(guān)序列同源性為98%，并且與大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、雞滑液囊支原體均無(wú)交叉反應(yīng)。周云雷等[10]建立了基于MG中特異性粘附蛋白編碼基因pvpA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。

6 疫苗防疫

6.1 滅活疫苗

雞毒支原體滅活疫苗的研制一般采用油乳劑作為佐劑，其具有安全、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但免疫保護(hù)存在缺陷。研究表明，蛋雞在開(kāi)產(chǎn)前8周免疫β-丙內(nèi)酯滅活疫苗可以有效緩解雞毒支原體感染引起的產(chǎn)蛋量下降的問(wèn)題，同時(shí)可以降低垂直傳播風(fēng)險(xiǎn)；但感染后再免疫，對(duì)雞毒支原體垂直傳播沒(méi)有抑制作用。

6.2 弱毒疫苗

常用的弱毒活疫苗主要有F株、TS-11株和MG6/85株疫苗。F株免疫保護(hù)效力強(qiáng)、時(shí)間久，可通過(guò)滴眼接種，不影響增重；蛋雞開(kāi)產(chǎn)前8周提前接種F株疫苗，可以有效減少感染后氣囊損傷和產(chǎn)蛋損失，降低垂直傳播現(xiàn)象；但F株毒力較野毒株弱，仍有一定反強(qiáng)致病風(fēng)險(xiǎn)，尤其商品火雞易引起感染。TS-11株和MG6/85株疫苗的毒力相對(duì)F株較弱，但對(duì)已感染雞的免疫效果不如F株；同時(shí)TS-11株和MG6/85株的致病力較弱，分別通過(guò)滴眼和噴霧接種未感染雞只，可較好地提供免疫保護(hù)，抵抗強(qiáng)毒株攻擊；蛋雞開(kāi)產(chǎn)前接種TS-11株和MG6/85株疫苗不會(huì)影響雞的產(chǎn)蛋量。

6.3 生物技術(shù)

鑒于滅活疫苗免疫效果不佳，而活疫苗存在散毒和毒力返強(qiáng)等缺陷，在這樣的背景下，生物技術(shù)苗應(yīng)運(yùn)而生。生物技術(shù)苗包括活載體疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、亞單位疫苗和基因缺失疫苗等。多價(jià)疫苗聯(lián)合開(kāi)發(fā)不僅降低疫苗成本，同時(shí)解決了單一雞毒支原體基因載體疫苗免疫原性差等缺陷，具有較大的應(yīng)用前景。

7 藥物治療

7.1 抗生素治療

除了接種疫苗，藥物防治也是防控雞毒支原體的有效途徑。雞毒支原體臨床治療主要是抗生素類藥物，例如四環(huán)素、土霉素、泰樂(lè)菌素、慶大霉素、達(dá)氟沙星等均對(duì)雞毒支原體均有一定治療效果。臨床上使用抗生素進(jìn)行雞毒支原體治療需要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感性高的抗菌藥，并且避免長(zhǎng)時(shí)間使用同種抗生素。

7.2 中草藥治療

由于常用抗菌藥普遍的耐藥性，不利于雞毒支原體的臨床治療，因此，越來(lái)越多研究開(kāi)始關(guān)注中草藥在雞毒支原體治療中的應(yīng)用。黃連、沒(méi)藥、桔梗等中草藥由于具有天然、安全、無(wú)毒等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)在抗炎和提高免疫力等方面有顯著效果，目前已成為治療和預(yù)防家禽雞毒支原體感染的重要材料。有學(xué)者將虎杖、山藥、三七等中藥復(fù)方提取物應(yīng)用于雞毒支原體治療上，有效緩解了感染后氣囊損傷、減重等臨床癥狀，其治療效果優(yōu)于泰樂(lè)菌素。有研究表明，以黃芪、明黨參、麻黃等中藥制成的復(fù)方中藥粉可以減輕雞毒支原體感染導(dǎo)致的氣囊損傷，同時(shí)對(duì)雞只有促進(jìn)增重的效果。

8 防控技術(shù)

8.1 優(yōu)化管理模式

8.1.1 全進(jìn)全出制

針對(duì)MG對(duì)外界環(huán)境抵抗力弱的特點(diǎn)，對(duì)每批次出欄的雞舍開(kāi)展清潔、消毒、干燥、空舍等一系列凈化病原措施，可以有效防止新引進(jìn)的雞群感染，為場(chǎng)內(nèi)和雞群MG凈化奠定了基礎(chǔ)。

8.1.2 加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)貫徹“養(yǎng)大于防，防大于治”的理念，加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理工作。例如常為雞群提供營(yíng)養(yǎng)均衡的全價(jià)飼料，定期清理料管、料槽中的發(fā)霉飼料；飼養(yǎng)密度合理；夏季防暑，冬季保溫；雞舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生保持整潔，降低舍內(nèi)粉塵和顆粒物含量，對(duì)MG病等一些呼吸道疾病的預(yù)防和治療具有一定的輔助作用；定期清理雞舍排泄物以降低NH3濃度，避免因NH3濃度過(guò)高導(dǎo)致雞群免疫力下降；控制進(jìn)出雞舍人員數(shù)量，拒絕閑雜人員入舍，做好人員和器械進(jìn)出雞舍的消毒和清潔；在免疫、轉(zhuǎn)群等群體操作前7天，可在飲水中添加復(fù)合維生素等抗應(yīng)激藥物。

8.2 生物安全防控

8.2.1 合理選址

養(yǎng)殖場(chǎng)選址應(yīng)滿足以下條件：距離動(dòng)物產(chǎn)品集貿(mào)市場(chǎng)500 m以上；距離動(dòng)物診療場(chǎng)所200 m以上；養(yǎng)殖小區(qū)之間距離不低于500 m；距離動(dòng)物無(wú)害化處理場(chǎng)所3 000 m以上；距離居民區(qū)等人口集中區(qū)域和主要公路、鐵路等主要交通干道500 m以上。

8.2.2 疫苗免疫

目前，用于MG預(yù)防的疫苗主要分為弱毒苗和滅活苗。養(yǎng)殖場(chǎng)在使用弱毒疫苗進(jìn)行滴眼等方法接種時(shí)，免疫時(shí)應(yīng)注意疫苗是否均進(jìn)入雞群體內(nèi)，接種完成后將疫苗空瓶和所有稀釋并未用完的疫苗應(yīng)進(jìn)行滅活處理，同時(shí)消毒和清洗好免疫用具，以免發(fā)生污染和散毒。

8.2.3 疫病凈化

要培育優(yōu)質(zhì)MG凈化雞群，關(guān)鍵在于引種時(shí)做好檢疫工作，不從MG疫區(qū)或支原體感染嚴(yán)重的地方引種，從源頭做好疫病凈化工作，保證均為健康雞群。此外，在日常的飼養(yǎng)管理過(guò)程中做好嚴(yán)格的生物安全措施，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和定期檢查場(chǎng)內(nèi)是否存在陽(yáng)性雞，并針對(duì)陽(yáng)性雞進(jìn)行淘汰、免疫或用藥等處理。種禽場(chǎng)在種蛋孵化前應(yīng)進(jìn)行MG的專項(xiàng)檢測(cè)，并對(duì)種蛋進(jìn)行消毒處理，避免支原體通過(guò)雞胚代代相傳。

9 展望

雞毒支原體的預(yù)防和治療至關(guān)重要。結(jié)合當(dāng)前實(shí)際，疫苗接種仍是防治雞毒支原體最有效的措施，針對(duì)滅活苗和弱毒疫苗現(xiàn)存的免疫局限性，可以考慮兩種疫苗聯(lián)合使用的方法，采取安全有效的接種程序，同時(shí)應(yīng)加大對(duì)新型生物技術(shù)疫苗的研發(fā)力度，為雞群健康保駕護(hù)航。藥物方面，目前的抗生素耐藥性和藥殘問(wèn)題普遍存在，臨床上除了要選擇藥敏性強(qiáng)的抗生素，還可以考慮聯(lián)合用藥的方法，如多種抗生素聯(lián)合使用，防止加劇耐藥性，預(yù)防繼發(fā)感染。另一方面，應(yīng)積極尋找替抗產(chǎn)品，逐步減少抗生素的使用，目前中草藥治療雞毒支原體病的研究已取得一定進(jìn)展，可進(jìn)一步推廣應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際。最后，廣大養(yǎng)殖人員要秉持“養(yǎng)大于防，防大于治”的理念，切實(shí)提高飼養(yǎng)管理水平，嚴(yán)格落實(shí)生物安全防控措施，將雞毒支原體的危害降到最低。