氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草果24種禁用農(nóng)藥殘留*

楊光梅，黃 燕，楊麗英，陳 健，李浩成，范銀英，郭利群，2△

(1.云南現(xiàn)代民族藥工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650217；2.云南省科學(xué)技術(shù)院，云南 昆明 650228)

草果屬于多年生姜科豆蔻屬常綠草本植物，主產(chǎn)于我國云南、廣西、貴州等省，其中云南是國內(nèi)最大的主產(chǎn)區(qū)。草果是一種重要的香料和藥材。又稱草果仁、草果子、老蔻，其香辛成粉主要為揮發(fā)油中的反-S-烯醛(Trans-s-undecenal)。此外尚含有香葉醇(Geraniol)和草果酮(Tsao kone)等成分。草果的功效和作用為燥濕化痰、避解瘟疫、截瘧祛痰、祛寒止痛、調(diào)氣消食、溫中止嘔……是中藥方劑(散劑、丸劑、酒劑)、片劑、草果配方顆粒等制劑主要原材料，同時也香料、食品添加劑的重要成分。種植期間會受到病蟲害的影響，主要病蟲害有立枯病、鉆心蟲、草果疫霉菌、草果炭疽病、草果葉斑病。雖然草果在投料使用前經(jīng)過了適當(dāng)?shù)牧罆瘛⒏稍锏忍幚?，但作為藥材或香料直接投入使用，非常有必要對其所含的農(nóng)藥殘留成分，尤其是國家農(nóng)業(yè)部及相關(guān)部門已明令禁止使用的高毒、劇毒、高殘留、致癌、致畸、致突變的農(nóng)藥組分及《中國藥典》2020版四部農(nóng)藥殘留的規(guī)定進行控制和考察，保證患者用藥安全，建立適用于藥食同源草果的農(nóng)藥殘留測定方法[1]。近年來，QuEChERs(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)發(fā)展較快已成為國際上廣泛并得認(rèn)可的一種用于中藥材、農(nóng)副產(chǎn)品等殘留檢測的快速樣品前處理技術(shù)，本法有高效、快速、簡單、科學(xué)、高回收率等特點，在農(nóng)藥殘留檢測中得到普遍應(yīng)用[2-3]。本實驗采用 QuEChERs-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草果24種禁用農(nóng)藥殘留[4]。

1 材料與儀器

1.1 儀器 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilengt 7890B+7000C 15 GC/MS美國安捷倫公司)、電子天平(BSA-224S-CW賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、純水機(Milli-Q Integral 15密理博中國有限公司)分液漏斗震蕩器(MMW-1000W 東京理化器械株式會社)、多功能冷凍離心機(Rotina 380R上海凌儀生物科技有限公司)、震蕩器(VORTEX 海門市其林貝爾儀器制遠(yuǎn)有限公司)。

1.2 試劑 乙腈﹝GR，fisher賽默飛世爾科技(中國)﹞、冰醋酸(AR國藥集團試劑有限公司)、鹽包(批號：5928-0755)QuEChERs SPE凈化管(批號：6559539-01北京迪馬科技公司)

1.3 對照品 禁用農(nóng)藥混合對照溶液(批號：610020-202001中國食品藥品檢定研究院)

1.4 樣品 所用批號的17批草果藥材經(jīng)鑒定均為正品：草果CG1云南省瀘水雙米地村；草果CG2云南省上帕鎮(zhèn)同心社區(qū)；草果CG3云南省知子羅村；草果CG4云南省石月亮村；草果CG5云南省上帕鎮(zhèn)上帕村；草果CG6云南省瀘水苗干山村；草果CG7云南省上帕鎮(zhèn)木古甲村；草果CG8云南省瀘水段家寨村；草果CG9云南省上帕鎮(zhèn)達友村；草果CG10云南省瀘水大密扣村；草果CG11云南省上帕鎮(zhèn)古泉村；草果CG12云南省老姆登村；草果CG13云南省瀘水新田村；草果CG14云南省福貢縣鹿馬登鄉(xiāng)亞坪村；草果CG15云南省瀘水白水河村；草果CG16云南省瀘水老六庫村；草果CG17云南省上帕鎮(zhèn)施底村。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 載氣類型 氮氣、氦氣(純度：99.99%以上)；

2.1.2 色譜柱毛細(xì)管柱 固定液名稱：50%(苯基)-甲基聚硅氧烷，固定液膜厚度：0.25 um，固定液涂抹濃度：100%；

2.1.3 程序升溫 初始溫度60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至120 ℃，再以每分鐘10 ℃的速率升溫至160 ℃，再以每分鐘2 ℃的速率升溫至230 ℃；最后以每分鐘15 ℃的速率升溫至300 ℃，保持6 min；

2.1.4 進樣方式 進樣體積：1.0 μL，進樣口溫度：250 ℃，不分流；

2.1.5 質(zhì)譜檢測器參數(shù) EI離子源 離子源溫度：250 ℃，質(zhì)譜傳輸接口溫度：250 ℃。

2.1.6 檢測模式 MRM模式[5-6]。

2.2 對照品溶液的配制 精密量取對照品0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，加色譜乙腈稀釋至刻度，混勻，制成對照品儲備液。

2.3 空白基質(zhì)溶液制備 取草果空白基質(zhì)樣品，同2.6供試品溶液制備方法處理制成空白基質(zhì)溶液[7]。

2.4 內(nèi)標(biāo)溶液配制 稱取磷酸三苯酯對照品適量，精密稱定，加色譜乙腈溶解并稀釋成每1 mL含1.0 mg的溶液，即得。精密量取適量，加乙腈稀釋制成每1 mL含0.1 mg的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 精密量取對照品儲備溶液10 μL，并精密加入空白基質(zhì)600 μL，混勻，即得濃度約為5 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，精密加入空白基質(zhì)600 μL，混勻，即得濃度約為10 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用相同的方式依次稀釋分別得到濃度約為5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.6 供試品溶液的制備 取不同批次來源的供試品，分別粉碎成粉末(并過三號篩)，精密稱定3 g，放置于聚苯乙烯具塞離心管中，加入15 mL 1%冰醋酸溶液，在渦旋儀上混勻讓藥粉充分浸潤，放置30 min以上，精密加入15 mL色譜乙腈與內(nèi)標(biāo)溶液 100 μL，混勻，置振蕩器上劇烈震蕩(500 次/min)10 min以上，加入質(zhì)量比例為(1∶4)無水乙酸鈉與無水硫酸鎂的混合粉末7.5 g，及時搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩(500 次/min)10 min左右，于冰浴中冷卻 10 min，離心(3500 轉(zhuǎn)/min)5 min。取上清液9 mL，置已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管[N-丙基乙二胺(PSA)300 mg，無水硫酸鎂900 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，石墨化炭黑90 mg，硅膠300 mg]中，渦旋使充分混勻，再置振蕩器上劇烈震蕩(600 次/min)10 min使凈化完全，離心(4500 轉(zhuǎn)/min)10 min，吸取上清液 用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

分別取對照品溶液、供試液溶液、空白基質(zhì)溶液進樣，圖譜見圖1～圖3：

圖1 對照品圖譜

圖2 樣品圖譜

2.7 檢出限、定量限、線性關(guān)系與線性范圍考察 精密吸取禁用農(nóng)殘對照品溶液濃度約10 ng/mL、20 ng/mL、40ng/mL、60 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL溶液 2 μL注入液相色譜儀按上述色譜條件測得分析物峰面積，以峰面積積分值進行回歸處理。結(jié)果見表1。

表1 各分析物的檢出測定結(jié)果

2.8 系統(tǒng)精密度、準(zhǔn)確度(加標(biāo)回收率)

2.8.1 參照對照品溶液配制與供試品溶液配制方法 配制約50 ng/mL對照品溶液1份，對照品溶液連續(xù)進樣6針，分別記錄24項禁用農(nóng)藥的保留時間與峰面積。可接受標(biāo)準(zhǔn)：各峰的保留時間RSD≤2%(n=6)，各峰的峰面積RSD≤15%(n=6)。

2.8.2 采用全程加標(biāo)法 即取約3.0 g草果粉末，精密稱定，加入農(nóng)藥殘留對照品儲備液0.75 mL、1.5 mL、2.25 mL各3份，對照品的加入量為與所取供試品中待測定成分量之比控制在1∶0.5、1∶1、1∶1.5左右，之后按照供試品溶液制備方法配制。按50%、100%、150%濃度分別配制9份供試品加標(biāo)溶液。對照品、供試品溶液各進樣1次，進樣體積為1.0 μL。

2.8.3 將上述配制好供試品液進樣2 μL 結(jié)果見表2。

表2 系統(tǒng)精密度、回收率結(jié)果

2.9 樣品測定 分別精密吸取上述制備好的基質(zhì)混合對照品溶液和供試品溶液各1 μL，精密加入磷酸三苯酯內(nèi)標(biāo)溶液0.3 mL，混勻，濾過，取續(xù)濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各1 μL注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各分析物含量。結(jié)果：17批草果藥材中均未檢查出24種分析物。

3 討論

草果是藥食同源的品種，無論是作為藥材提取加工成制劑服用，還是作為食品香料、調(diào)料直接供大眾食用，對人體都存在一定的安全隱患。需要對農(nóng)藥殘留及安全性進行控制，保障人們食用安全。

藥材草果經(jīng)加工處理后為干燥藥材，含水量不多。3 g的樣品量比較方便合適，且具有一定的代表性。不會因取樣量過大，而導(dǎo)致試劑、樣品的浪費及環(huán)境的污染。 最后處理得到供試品溶液中藥材含量為0.5 g·mL-1，滿足藥材痕量分析要求。

提取后的草果溶液含有酚類、糖、多糖、皂苷、黃酮、蒽醌、香豆素、內(nèi)酯、揮發(fā)油、萜類、油脂等多種物質(zhì)，有的成分對分析會造成干擾?？焖贅悠诽幚矸?QuEChERS)相對直接提取法能更好地去除雜質(zhì)、防止被測組分和回收率的流失、保證試驗的準(zhǔn)確性。

離子對的優(yōu)化與判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)全掃描質(zhì)譜得到標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥的各保留時間劃分時間段，盡可能減少在每一時間段所檢測目標(biāo)化合物的數(shù)量。在質(zhì)譜圖中，選擇3對特征離子，豐度較高的一對作為定量離子對，其余兩對為定性離子對。采用保留時間和離子豐度比定性，再用定量離子對的峰面積定量。

參照氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對17批草果進行農(nóng)藥殘留量的測定，其標(biāo)準(zhǔn)限度按 《中國藥典》2020年版四部通則0212藥材和飲片檢定通則項下33種禁用農(nóng)藥不得檢出(不得過定量限)的表執(zhí)行，其中氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法收載31種農(nóng)藥測定，但高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法也有部分項目重復(fù)檢測，考慮分析物內(nèi)吸磷、久效磷、水胺硫磷、蠅毒磷、磷酸三苯酯、苯線磷、治螟磷等已在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測效果較佳，所以不再復(fù)進行測定只測定上述24項結(jié)果均為未檢出。根據(jù)上述探索性研究結(jié)果表明，該方法基本可適用于草果禁用農(nóng)藥殘留的質(zhì)量控制。

4 結(jié)論

本研究建立了草果藥材中禁用農(nóng)藥殘留量測定法。對不同來源、方法適用性、分析物含量等方面進行了考察研究，發(fā)現(xiàn)能按此超氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對草果藥材進行24種禁用農(nóng)藥殘留測定，此方法能準(zhǔn)確、快速、科學(xué)、有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。確定取樣量為3 g，采用快速樣品處理法(QuEChERS)處理，按此氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為草果24種禁用農(nóng)藥殘留測定法。