miR-490-3p通過(guò)靶向調(diào)控TGFBR1抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲

李艷青，郭婷婷，曾毅，周玉柏

北京工業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124

肺癌是全球癌癥發(fā)病和死亡的首要原因，2018年預(yù)計(jì)新發(fā)病例210萬(wàn)，致死180萬(wàn)，占所有癌癥死亡人數(shù)的五分之一[1]。肺癌可分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），約 85%的肺癌患者為NSCLC[2]。非小細(xì)胞肺癌又可分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌等，其中以肺腺癌和肺鱗癌最為常見(jiàn)。近年來(lái)，隨著酪氨酸激酶抑制劑的使用和免疫治療技術(shù)的發(fā)展，NSCLC患者的治療模式發(fā)生了革命性的變化[3-4]。然而，上述新型治療方法也存在患者適用范圍窄、副作用明顯及易發(fā)耐藥等缺點(diǎn)，NSCLC患者的5年綜合生存率仍然偏低。因此，深入研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找藥物作用的新靶點(diǎn)，對(duì)于改善肺癌患者預(yù)后，提高生活質(zhì)量有重要的臨床意義。

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)包括20～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過(guò)與mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合，降解mRNA或抑制其翻譯過(guò)程，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)水平[5-6]。大量數(shù)據(jù)表明，miRNA在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，根據(jù)作用的不同可分為促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的促癌miRNA和具有抑癌作用的抑癌miRNA[7]。近來(lái)研究表明，miR-490-3p的表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生有著密切關(guān)系，在乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用[8-11]，但其在肺癌中的作用還不明確[12-13]。我們以非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為模型，探討miR-490-3p在NSCLC中的作用及分子機(jī)制，為尋找新的藥物靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)新的治療措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、PBS、Opti-MEM購(gòu)自Gbico公司；LipofectAMINE 3000購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、RT-PCR試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；TGFBR1抗體購(gòu)自Abcam公司；GAPDH抗體購(gòu)自CST公司；抗兔IgG抗體購(gòu)自KPL公司；Transwell小室購(gòu)自Corning公司；pmirGLO質(zhì)粒、雙螢光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；Cy3標(biāo)記的miR-490-3p mimics、miR-NC由廣州銳博生物公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（添加100 μg/mL青霉素和鏈霉素），于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將A549細(xì)胞以3×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后設(shè)置miR-490-3p mimics組、陰性對(duì)照組（miR-NC）和空白組，用LipofectAMINE 3000進(jìn)行相應(yīng)miRNA轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別于24、48、72 h棄舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL CCK8試劑和培養(yǎng)基DMEM混合液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，用10 μL的無(wú)菌槍頭垂直方向劃直線(xiàn)，PBS清洗3次去除脫落細(xì)胞后加入2 mL無(wú)血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，分別在0和24 h于顯微鏡下拍照記錄，用ImageJ軟件測(cè)量遷移距離，計(jì)算各組細(xì)胞的遷移率。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移與侵襲能力

將轉(zhuǎn)染后24 h的各組細(xì)胞分別用無(wú)血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，遷移實(shí)驗(yàn)Transwell上室細(xì)胞接種數(shù)為5×104，侵襲實(shí)驗(yàn)（含基質(zhì)膠Matrigel）Transwell上室細(xì)胞接種數(shù)為1×105，下室分別加入600 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS清洗1次，4%多聚甲醛固定20 min，用0.1%結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)。

1.7 miR-490-3p靶基因的預(yù)測(cè)及qRT-PCR篩選

miRwalk在線(xiàn)工具通過(guò)集成Targetscan和miRTarBase預(yù)測(cè)網(wǎng)站的算法進(jìn)行miRNA靶基因的預(yù)測(cè)，并可對(duì)不同算法獲得的預(yù)測(cè)基因取交集以得到更可信的結(jié)果。我們對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果根據(jù)基因功能進(jìn)行進(jìn)一步篩選，最終確定進(jìn)入后續(xù)篩選的候選調(diào)控基因。用TRIzol法提取轉(zhuǎn)染48 h后的A549細(xì)胞總RNA，以U6為內(nèi)參，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量反應(yīng)（反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)數(shù)），記錄最終結(jié)果，用 2-ΔΔCt法計(jì)算不同調(diào)控基因mRNA表達(dá)的差異。

1.8 Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加100 μL RIPA細(xì)胞裂解液，置冰上裂解15 min，收集至EP管，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清進(jìn)行蛋白定量；加入SDS上樣緩沖液沸水浴10 min，每組取25 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE；電泳結(jié)束后，在100 mA恒流下將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，室溫下用5%的脫脂奶粉封閉2 h；加入一抗，4℃孵育過(guò)夜；加入二抗，室溫孵育1 h；條帶信號(hào)用Odyssey遠(yuǎn)紅外影像分析儀檢測(cè)；用ImageJ對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將相應(yīng)基因的3'-UTR序列插入pmirGLO載體的多克隆位點(diǎn)，將構(gòu)建的載體與miR-490-3p mimics、miR-NC用 LipofectAMINE 3000共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后用雙螢光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶活性。相對(duì)螢光素酶活性以螢火蟲(chóng)螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值表示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism7.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素的方差分析。P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-490-3p對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

用LipofectAMINE 3000轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的miR-490-3p mimics，在明場(chǎng)和熒光下觀察，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90%以上（圖1）。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR-490-3p mimics的A549細(xì)胞在培養(yǎng)48和72 h后，細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組（圖2，P＜0.01），提示miR-490-3p過(guò)表達(dá)可顯著降低A549細(xì)胞的增殖能力。

圖1 miR-490-3p mimics的轉(zhuǎn)染效率

圖2 miR-490-3p過(guò)表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖

2.2 miRNA-490-3p對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響

采用劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定過(guò)表達(dá)miR-490-3p后A549細(xì)胞遷移能力的變化，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了miR-490-3p mimics的A549細(xì)胞的遷移率明顯降低（圖3，P＜0.01），提示miR-490-3p過(guò)表達(dá)可抑制A549細(xì)胞的遷移能力。

2.3 miRNA-490-3p對(duì)A549細(xì)胞遷移侵襲的影響

采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-490-3p對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-490-3p mimics的A549組細(xì)胞穿膜數(shù)目顯著減少（圖4，P＜0.001）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，miR-490-3p過(guò)表達(dá)的A549組細(xì)胞穿膜數(shù)目明顯減少（圖5，P＜0.001）。提示miR-490-3p過(guò)表達(dá)可顯著抑制A459細(xì)胞的遷移與侵襲能力。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-490-3p對(duì)A459細(xì)胞遷移的影響

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-490-3p對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-490-3p對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響

2.4 qRT-PCR篩選miRNA-490-3p的靶基因

根據(jù)在線(xiàn)預(yù)測(cè)的miRNA-490-3p靶基因并結(jié)合基因功能分析，選擇與細(xì)胞增殖、遷移及侵襲表型相關(guān)的RASAL2、TGFBR1、PAPPA、HMGA2、TGFA基因進(jìn)行后續(xù)qRT-PCR篩選。結(jié)果表明，僅TGFBR1基因的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖6，P＜0.01），其他基因的mRNA與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。因此，選擇TGFBR1基因?yàn)閙iRNA-490-3p的候選靶基因進(jìn)行后續(xù)研究。

圖6 qRT-PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-490-3p對(duì)靶基因mRNA表達(dá)水平的影響

2.5 Western印跡檢測(cè)miRNA-490-3p對(duì)TGFBR1蛋白水平的影響

Western印跡顯示，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-490-3p mimics后，A549細(xì)胞中的TGFBR1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（圖7，P＜0.05），說(shuō)明miR-490-3p與A549細(xì)胞中TGFBR1蛋白的表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)性。

圖7 miR-490-3p對(duì)A549細(xì)胞中TGFBR1蛋白表達(dá)水平的影響

2.6 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-490-3p靶向TGFBR1基因

TGFBR1基因的3'-UTR和miR-490-3p的結(jié)合序列如圖8A所示。用LipofectAMINE 3000將miR-490-3p mimics/miR-NC和雙螢光素酶報(bào)告基因載體pmirGLO-TGFBR1共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后用雙螢光素酶試劑盒檢測(cè)各組螢光素酶的活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-490-3p mimics組相對(duì)熒光值顯著下降（圖8B，P＜0.05），提示miR-490-3p可通過(guò)結(jié)合TGFBR1的3'-UTR抑制TGFBR1基因的表達(dá)。TGFBR1基因是miR-490-3p的靶基因。

圖8 miR-490-3p與靶基因TGFBR1結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

3 討論

數(shù)十年來(lái)，隨著新型靶向藥物及免疫治療的發(fā)展，肺癌的治療手段越來(lái)越多樣化，治療效果有明顯的提高，但肺癌患者的總體預(yù)后仍然不容樂(lè)觀，5年生存率僅為15%[14]。因此，探討NSCLC的發(fā)生機(jī)制，尋找新的分子標(biāo)志物及藥物靶點(diǎn)，對(duì)于進(jìn)一步提高肺癌患者的治療效果十分必要。

現(xiàn)已明確，miRNA參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。綜合已有的數(shù)據(jù)，可以認(rèn)為，對(duì)于腫瘤這種表型多樣復(fù)雜的疾病，必然存在不同層面的涉及多種代謝及信號(hào)通路的異常，而在此過(guò)程中，不同的miRNA及其靶基因之間形成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能發(fā)揮重要作用。目前僅有不多的幾種miRNA被證實(shí)與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)[15-18]。比如miR-4326可通過(guò)靶向APC2促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖；miR-214通過(guò)靶向CPD抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，發(fā)現(xiàn)新的具有調(diào)控作用的miRNA分子，對(duì)于加深對(duì)肺癌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，開(kāi)發(fā)新型靶向藥物具有重要意義。miR-490-3p被認(rèn)為在多種腫瘤中發(fā)揮作用，在乳腺癌中可通過(guò)下調(diào)RhoA基因抑制乳腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)[19]，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-490-3p的下調(diào)可以激活Wnt/βcatenin通路[20]。然而，miR-490-3p在肺癌中的作用及分子機(jī)制并不清楚。本研究將miR-490-3p mimics導(dǎo)入非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，通過(guò)CCK8、細(xì)胞劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)，表明miR-490-3p過(guò)表達(dá)可顯著抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。隨后，通過(guò)qRT-PCR和Western印跡對(duì)其可能的靶基因進(jìn)行篩選。qRT-PCR結(jié)果顯示，僅有TGFBR1基因的mRNA水平顯著下調(diào)，隨后的Western印跡也進(jìn)一步確證TGFBR1蛋白表達(dá)水平與其mRNA具有同樣的變化趨勢(shì)，提示TGFBR1基因可能是miR-490-3p調(diào)控的靶基因。最后，運(yùn)用雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明，miR-490-3p可通過(guò)直接結(jié)合TGFBR1基因的3'-UTR最終下調(diào)該基因的蛋白表達(dá)水平。TGFBR1基因編碼TGF-β信號(hào)通路中的重要受體TGF-β受體1，接受胞外刺激信號(hào)的TGF-β受體1發(fā)生磷酸化進(jìn)而激活Smad信號(hào)通路，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等過(guò)程[21]。研究發(fā)現(xiàn)，TGFBR與腫瘤的增殖、侵襲表型密切關(guān)系[22-24]，在NSCLC患者人群中存在較高的TGFBR1等位基因特異性表達(dá)，且與TGFBR1基因的一個(gè)兩位點(diǎn)單倍型相關(guān)，這提示TGFBR1基因與NSCLC的病因?qū)W有重要聯(lián)系[25]。本研究證明在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中miR-490-3p通過(guò)靶向TGFBR1調(diào)控其表達(dá)，從而發(fā)揮抑癌作用，進(jìn)一步豐富了對(duì)miR-490-3p在肺癌中的調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

綜上，miR-490-3p可通過(guò)直接靶向TGFBR1抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移侵襲。此研究為miR-490-3p在肺癌靶向治療中的潛在應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。