病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)在豆科植物中的應(yīng)用

魏正欣，孫虎，向艷濤，蔣浩中，沙愛華*，劉良軍

（1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心/濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州，434025；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430064）

豆科（Leguminosae）植物約有690 屬，17 600 余種，是雙子葉種子植物，分布于世界各地，我國有1300 多種。豆科植物中有許多種類是世界性的經(jīng)濟(jì)作物，與人類生活密切相關(guān)，如大豆、花生等，除此之外還有一些具有藥用價值，如含羞草、決明、皂莢等。在過去的幾十年里，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，在模式植物研究中取得了巨大成就。然而，在與人類生活密切相關(guān)的農(nóng)作物中，分子水平研究還有很大不足。轉(zhuǎn)基因等多種分子生物學(xué)技術(shù)在大多數(shù)的植物中仍然存在著一些問題，需要進(jìn)一步突破。近些年，病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)，可為植物基因功能研究提供強(qiáng)有力工具[1]。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）是一種RNA 介導(dǎo)的防御機(jī)制，即轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS），是植物體內(nèi)普遍存在的遺傳免疫機(jī)制[2]。該技術(shù)利用攜帶植物功能基因cDNA 的病毒，在侵染植物體后可誘導(dǎo)植物發(fā)生基因沉默從而引起表型改變，以通過植物表型或生理指標(biāo)上的變化反映該基因的功能[3]，近年來已廣泛地應(yīng)用于植物基因功能的研究。與轉(zhuǎn)基因等其它方法相比，VIGS具有簡便高效、周期短、可沉默基因家族、不需獲取轉(zhuǎn)基因植株、高通量等優(yōu)點(diǎn)，同時可在不同遺傳背景的植物間進(jìn)行基因功能比較，是研究功能基因組和特定基因功能的有效工具[4]。目前已經(jīng)普遍應(yīng)用于煙草[5]、擬南芥[6]、棉花[7，8]、番茄[9]、馬鈴薯[10]等植物基因功能的研究中。本文綜述了近年來VIGS 技術(shù)在豆科植物功能基因挖掘中的研究進(jìn)展，旨在為進(jìn)一步應(yīng)用VIGS在豆科植物中開展相關(guān)研究提供借鑒。

1 VIGS技術(shù)原理

基因沉默是植物界普遍存在的一種自我保護(hù)反應(yīng)。在長期生物進(jìn)化過程中，植物為了保護(hù)自身不受傷害而禁止外源核酸入侵，最終形成了這種保護(hù)機(jī)制?；虺聊l(fā)生在兩種水平上，一種是轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS），是DNA 水平上基因調(diào)控的結(jié)果，主要是由啟動子甲基化或?qū)牖虍惾旧|(zhì)化而導(dǎo)致的。另一種是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS），是RNA 水平基因調(diào)控的結(jié)果，在基因轉(zhuǎn)錄后水平上通過對靶RNA 的特異性降解而使基因沉默。在這兩種水平上引起的基因沉默都與入侵核酸片段和宿主基因的同源性有關(guān)[11]。當(dāng)病毒攜帶植物基因序列感染植物時，病毒感染會觸發(fā)VIGS。原理是攜帶目標(biāo)序列病毒感染植物導(dǎo)致目標(biāo)植物基因表達(dá)下調(diào)，使用來源于病毒的雙鏈RNA（dsRNA）作為模板產(chǎn)生小分子干擾RNA（siRNA），而siRNA 則將單鏈病毒RNA 靶向并在特定序列中降解，因此，插入病毒基因組中的植物基因片段成為siRNA 的來源，然后針對相應(yīng)的植物基因mRNA 進(jìn)行破壞，由于宿主基因的功能喪失或表達(dá)降低，引起受感染植物的表型變化[3]。VIGS 最 早 是 在RNA 病 毒 中 發(fā) 現(xiàn)，1995 年Kmuagai等[12]首次將八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturas，PDS) 的DNA 片段插入煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus,TMV），再將重組TMV 侵染煙草使得煙草葉片褪色，說明TMV 成功沉默了PDS基因；1998年Ruiz 等[13]在馬鈴薯X 病毒（potato virus X，PVX）上插入PDS的DNA 片段，重組病毒侵染植物后也觀察到葉片白化現(xiàn)象。說明植物內(nèi)發(fā)生了基因沉默，使得PDS表達(dá)受抑制，產(chǎn)生白化現(xiàn)象。1999 年Baulcombe等[14]研究發(fā)現(xiàn)VIGS機(jī)制中存在一種基因沉默信號dsRNA（double stand RNA），使非侵染組織具有抗病能力。dsRNA 是基因沉默的關(guān)鍵起始因子，它可以通過病毒的復(fù)制機(jī)制、RNA 自我復(fù)制等策略產(chǎn)生[15]。

VIGS 技術(shù)主要包括3 個步驟：（1）對病毒基因組進(jìn)行改造，構(gòu)建包含外源目標(biāo)基因片段的病毒基因重組載體；（2）將其侵染宿主植物；（3）植物細(xì)胞識別入侵病毒，通過植物對病毒侵染的防御機(jī)制使目標(biāo)基因沉默，表現(xiàn)出靶基因功能喪失和表達(dá)活性降低等表型，從而鑒定目標(biāo)基因的功能[16]。

2 VIGS病毒載體的選擇

病毒載體是攜帶外源目的基因進(jìn)入動植物體內(nèi)并有效表達(dá)的工具，可以在植物體中過表達(dá)或抑制基因表達(dá)。當(dāng)基因被工程化到病毒基因組中時，植物病毒載體可以有效表達(dá)外源蛋白。隨著病毒在宿主中復(fù)制，外源蛋白大量產(chǎn)生。根據(jù)構(gòu)建VIGS載體的病毒性質(zhì)，可以將其分為三大類：RNA 病毒載體、DNA病毒載體和衛(wèi)星病毒載體。

2.1 RNA病毒載體

VIGS 中使用的病毒載體主要是RNA 病毒載體，主要有煙草花葉病毒（TMV）、大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus,BSMV）、煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus, TRV）、馬鈴薯X 病毒（PVX）等十余種，其中TMV 和PVX 是最先被開發(fā)利用的VIGS 載體，但是它們侵染后植物存在癥狀嚴(yán)重、基因沉默效率低、無持久作用等缺點(diǎn)。TRV 也是廣泛應(yīng)用于各種植物物種中最常見的病毒載體，它具有侵染后癥狀較輕，基因沉默效率高，可在多個組織產(chǎn)生沉默且效果長久等優(yōu)點(diǎn)[17]。BSMV 的病毒載體已成功應(yīng)用于對小麥（Triticum ɑestivum）中非生物脅迫基因進(jìn)行功能鑒定[18]。蘋果潛隱球形病毒（apple latent spherical virus, ALSV）已經(jīng)成功在幾種重要的作物如番茄、蘋果、豆科植物、葫蘆科等植物中應(yīng)用[3]。豌豆早枯病毒（pea early browning virus,PEBV）和豆莢斑駁病毒（bean pod mottle virus, BPMV）則是較早且成功應(yīng)用于豆科植物VIGS 中的病毒載體[19]。

2.2 DNA病毒載體

DNA 病毒也能誘導(dǎo)基因發(fā)生沉默，Kjemtrup等[20]人利用番茄金色花葉病毒（tomato golden mosaic virus,TGMV）有效沉默了增殖性細(xì)胞核抗原基因（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）。Tang 等[21]人研究發(fā)現(xiàn)白菜卷葉病毒（cabbage leaf curl virus,CaLCuV）載體在植物中過度表達(dá)內(nèi)源或人工miRNA，能夠誘導(dǎo)擬南芥中轉(zhuǎn)基因與外源基因的沉默。多種DNA 病毒被用來研究植物基因組功能，其中CaLCuV 和TYLCCNV（yellow leaf curl China virus）是最廣泛使用的DNA 病毒載體，已成功應(yīng)用到煙草、擬南芥、卷心菜和菜花中[22]。與RNA 病毒載體相比，DNA 病毒VIGS 載體具有構(gòu)建簡單、無需轉(zhuǎn)錄、操作簡單、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，但其基因沉默效率沒有RNA病毒載體高[23]。

2.3 衛(wèi)星病毒載體

VIGS 的衛(wèi)星病毒載體是由病毒鏈的衛(wèi)星病毒改造而來，Gossele 等[24]研究表明微衛(wèi)星病毒載體STMV（satellite of tobacco mosaic virus）能夠有效抑制煙草中PDS等13個內(nèi)源基因，并引起明顯的表型變化。Ju 等[25]首次發(fā)現(xiàn)病毒衛(wèi)星DNA 載體是一種有效的病毒誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平基因沉默載體，可用來研究植物基因組DNA 甲基化。由于衛(wèi)星病毒具有可以在植物中大量復(fù)制且自身基因組小，易操作等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種優(yōu)良的VIGS 載體，但同樣存在基因沉默效率低的缺點(diǎn)[23]。

3 VIGS在豆科植物中的應(yīng)用

近年來，栽培大豆的基因組測序工作已完成，構(gòu)建了野生大豆泛基因組，并不斷地完善大豆種質(zhì)資源的測序數(shù)據(jù)[26]。近十幾年來，已有諸如豌豆早枯病毒（PEBV）、豆莢斑駁病毒（BPMV）和蘋果潛隱球狀病毒（ALSV）等多種VIGS病毒載體成功應(yīng)用于豆科植物基因功能的研究中，使得豆科植物這種遺傳轉(zhuǎn)化較難的物種的基因組學(xué)可以高效開展。目前，VIGS 技術(shù)在豌豆中應(yīng)用較多，以PEBV 為載體的VIGS 技術(shù)是研究豌豆發(fā)育途徑功能基因調(diào)控的良好工具，且不會對豌豆開花及結(jié)莢成熟產(chǎn)生影響，不會影響豆科植物與根瘤菌共生形成根瘤[27]，具有廣闊的開發(fā)前景。Gabriela 等[28]研究將攜帶PDS基因的cDNA片段插入到病毒載體的單鏈RNA2中，感染豌豆后成功沉默PDS基因，出現(xiàn)特征性的光漂白葉片；宋偉杰等[29]成功地利用VIGS 研究了豌豆基因PsPI（Pisum sɑtivum pistellɑtɑ）的功能，證明了Ps-PI基因具有擬南芥PI、金魚草GLO同源基因的功能，為豌豆花發(fā)育調(diào)控基因的功能研究開拓新思路。此外，VIGS技術(shù)是進(jìn)行植物基因功能鑒定的簡便、高效的方式，目前已成功應(yīng)用于豆科植物中。Ramegowda 等在豌豆中使用了VIGS 技術(shù)研究叢枝菌根真菌AMF 中獲取磷酸鹽相關(guān)基因，沉默共生基因PsSym19，減少根皮層叢枝和囊泡的發(fā)育，揭示這些基因?qū)ν愣怪辛姿猁}同化的重要性[2]；ATWOOD等[30]將VIGS 技術(shù)用于大豆中鐵元素相關(guān)基因的功能分析中，沉默基因GmRPA3，沉默的植株葉片較小，葉綠素含量較高，對鐵元素增加無響應(yīng)，這表明GmRPA3基因在鐵的獲取中發(fā)揮了作用；Cooper等[31]利用豆莢斑駁病毒（BPMV）系統(tǒng)沉默Rpp1（Rgenes resistance toP.pɑchyrhizi），導(dǎo)致大豆喪失對根腐病的免疫功能，表明Rpp1基因調(diào)控的免疫途徑以及相關(guān)基因與大豆防御系統(tǒng)緊密相關(guān)；使用VIGS技術(shù)沉默CHS基因使大豆種皮由棕變黃，表明CHS基因功能與色素合成有關(guān)[32]。豆科植物中已成功構(gòu)建了以ALSV、BPMV 為載體的VIGS 體系，并通過改良載體或接種方式以提高沉默效率。Lgarashi 等[33]從大豆植物中提取PDS基因與ALSV 構(gòu)建重組載體后分別侵染大豆、豌豆、菜豆和豇豆植株的第1 片葉子，發(fā)現(xiàn)沉默植株的新生葉出現(xiàn)白化現(xiàn)象；Gedling等[3]修改了基于ALSV 載體的接種程序，使用大豆GmPDS1基因作為VIGS目標(biāo)基因，在19種大豆基因型中評估了新方法的功效且獲得明顯的沉默表型；Zhang 等[34]研究改良BPMV 載體，以提高BPMV 載體對大豆功能基因組學(xué)的效率；Juvale 等對不同時間和空間下BPMV基因沉默體系植株沉默情況研究中發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育時期、不同組織的沉默效果不同，說明VIGS技術(shù)也可用于豆科植物組織水平研究[35]。

4 VIGS技術(shù)在豆科植物中應(yīng)用效率

4.1 VIGS載體插入目的基因片段長度及位置

較高的基因沉默效率是VIGS 技術(shù)需要著重解決的問題。在VIGS 過程中持續(xù)沉默的最重要因素可能是病毒感染期間載體中插入外源片段的遺傳穩(wěn)定性，而插入的目的基因片段序列和大小對VIGS沉默效率有一定影響。一般認(rèn)為，比較理想的片段大小為150～500 bp[36]，插入靶基因片段長度與病毒在植物細(xì)胞間運(yùn)動的限制有關(guān)，且在不同病毒和植物物種間可能存在差異[37]。如在BMSV 中分別插入PDS275、400、584 個核苷酸序列后，結(jié)果表明隨序列長度增加，插入片段在接種植物的載體中穩(wěn)定性越差，甚至插入片段丟失[38]。Werner 等[39]構(gòu)建ALSV載體時，目標(biāo)基因序列約201 bp，較短則會降低沉默效率，較長則會導(dǎo)致不穩(wěn)定，不能長久保持沉默。

VIGS的效果是基于序列同源性，兩者序列同源性越高，基因沉默效果越好[40]。另一個需要注意的問題是靶基因片段的區(qū)域選擇。很多研究表明，選擇不恰當(dāng)?shù)幕蚱慰赡苓_(dá)不到基因沉默的效果，導(dǎo)致基因表型不正確，選擇更為特異的片段可有效提高沉默效率[41]。

4.2 病毒載體的選擇及轉(zhuǎn)化方法

目前VIGS技術(shù)應(yīng)用的病毒載體大致為三類，包括RNA 病毒載體、DNA 病毒載體和衛(wèi)星病毒載體，但每種病毒載體適用寄主范圍不同，沉默效果不同。因此，在VIGS 技術(shù)中，所選擇的病毒載體應(yīng)是對實(shí)驗(yàn)植物有很好的侵染性、不產(chǎn)生致病表型，最好能在寄主植物中產(chǎn)生系統(tǒng)的沉默效果，以保證較高的基因沉默效率和持久的沉默表型[38]。如何有效地將病毒載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，是VIGS 技術(shù)的關(guān)鍵。目前，已有注射滲透法[42]、農(nóng)桿菌滲透法[43]、摩擦接種法[3]、牙簽刺傷法[43]、真空滲透法[44]等多種載體轉(zhuǎn)化方式。其中注射滲透法可以精確傳遞接種物并引起有效且一致的基因沉默，農(nóng)桿菌滲透法易于實(shí)施，可提高包括根在內(nèi)的整個植株水平的基因沉默效率，但二者僅適用于少量植物；牙簽刺傷法可用于大規(guī)模實(shí)驗(yàn)，這種方法容易且快速，成本適中收益較高。由于載體和植物種類，以及轉(zhuǎn)接方式所呈現(xiàn)出的沉默效果不同，在實(shí)踐中要根據(jù)植物和病毒載體的種類選擇適宜的轉(zhuǎn)接方式。因?yàn)锳LSV 不容易感染園藝植物，所以在對園藝植物進(jìn)行處理時常選擇粒子轟擊法，即以病毒RNA 的形式進(jìn)行接種，而不是通過摩擦接種或農(nóng)桿菌浸潤來接種[45]。在基于CIYVV（Cloyer yellow vein virus），SMV和BPMV載體的試驗(yàn)中，通過摩擦接種的方法成功地在大豆中進(jìn)行了DNA 克隆[46]，Zhang 等[47]人開發(fā)了一種在小麥和玉米發(fā)芽種子中通過真空和共培養(yǎng)農(nóng)桿菌浸潤的新方法?？梢砸l(fā)全植株水平的VIGS。在使用VIGS 研究棉花基因GhBI-1（cotton Bax inhibitor-1）對鹽脅迫的響應(yīng)功能時，開發(fā)了棉花中的SSAVIGS 方法，通過將裸露的發(fā)芽種子浸入含有TRVVIGS載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物中，在發(fā)育的早期引起葉和根中的基因沉默[48]。

4.3 植物培養(yǎng)環(huán)境

植物的培養(yǎng)條件對于病毒的侵染、復(fù)制有一定的影響，所以在外部環(huán)境條件都適宜時，基因沉默的效果最好。溫度是影響基因沉默效果的重要因素之一，不同載體的適宜溫度不同，同一載體對不同寄主的適宜溫度也不同，如TRV 在本生煙上沉默的最適溫度為25℃，而感染番茄的最適溫度要低于或等于21℃[17]。而衛(wèi)星病毒載體對溫度敏感性較低，TYLCCNV（tomato yellow leaf curl virus-china）衛(wèi)星病毒載體可在32℃發(fā)生基因沉默[49]。濕度對VIGS 沉默效果也有一定的影響，F(xiàn)u 等[50]研究發(fā)現(xiàn)低濕度環(huán)境有利于TRV 載體發(fā)生基因沉默。因此，在人工氣候室中進(jìn)行VIGS 可以提高基因沉默效率。

5 VIGS 技術(shù)在豆科植物中的局限和前景

VIGS技術(shù)與傳統(tǒng)基因鑒定的方法相比，具有實(shí)驗(yàn)周期短、方法操作簡單、成本低、高通量、獲得表型快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物的生長發(fā)育、抗病抗逆、代謝調(diào)控等生理過程的研究中。但是隨著VIGS 技術(shù)研究不斷深入，也暴露出一定的局限性。例如基因沉默效率低、病毒癥狀明顯、基因功能敲除不徹底、基因脫靶以及沉默不均一等問題。其中基因沉默不徹底是VIGS技術(shù)的最大問題，基因功能不能完全消除，VIGS 技術(shù)難以對其功能進(jìn)行鑒定[51]。其次沉默效率低，在不同品種或組織中沉默效果不一致，可能使得試驗(yàn)結(jié)果在不同的品種或組織間有較大差異，可通過控制環(huán)境條件、改良載體或接種方式來提高基因沉默效率[52]。提高VIGS 在豆科植物中的基因沉默效率、開發(fā)新的病毒載體和接種方法將是一類研究目標(biāo)，雖然VIGS技術(shù)在豆科植物中的應(yīng)用還不成熟，但與傳統(tǒng)方法相比優(yōu)勢顯著，隨著不斷探索研究該技術(shù)必將逐步得到完善與發(fā)展，VIGS技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn)將會推動豆科植物研究的發(fā)展，打破傳統(tǒng)研究的局限。