盧凱，齊軍山，祁凱，馬立國，張悅麗，張博，馬國蘋，李長松

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南，250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/山東省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南，250100）

大豆根腐?。⊿oybean root rot）作為世界性土傳病害，給大豆生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。該病最早于1917 年由Crommell 等人在美國報(bào)道[1]，1991 年沈崇堯等報(bào)道我國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)大豆根腐病[2]。大豆根腐病的病原種類復(fù)雜，報(bào)道過的有鐮孢菌Fusɑriumspp.、絲核菌Rhizoctoniɑ solɑni、腐霉菌Pythiumspp.和疫霉菌Phytophthorɑ sojɑe等[3,4]，其中以絲核菌和鐮孢菌為主，腐霉菌在低洼地塊和多雨炎熱時(shí)會有發(fā)生，但報(bào)道較少。腐霉菌侵染大豆的根系和莖基部分，造成豆苗出土前根部腐爛，出土后豆苗猝倒，導(dǎo)致植株生長緩慢，甚至死亡，因此腐霉菌的危害非常嚴(yán)重。

我國大豆種植地域廣泛，氣候差異較大，大豆根腐病的病原也有所不同。黃淮地區(qū)和新疆以茄腐鐮孢菌F. solɑni為主，黑龍江省以尖鐮孢菌F.oxysporum和立枯絲核菌R. solɑni為主[5]，山東省以茄腐鐮孢菌F. solɑni為主，木賊鐮孢菌F. equiseti次之[6]，江蘇和安徽等南方省份的大豆根腐病致病菌中層生鐮孢菌F. ɑcuminɑtum的分離頻率較高。據(jù)報(bào)道，2017 年之前，我國導(dǎo)致大豆根腐病的鐮孢菌至少有24 種[7]，黃淮海地區(qū)可以導(dǎo)致大豆根腐病的腐霉菌有12 種，其中9 種腐霉菌為強(qiáng)致病菌[8]。與鐮孢菌相比，腐霉菌報(bào)道較少，而且強(qiáng)致病菌占比較高，需要更加關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集和分離

2019-2020 年的6-8 月份，在山東省濟(jì)寧、泰安、菏澤等地市的27 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的86 個(gè)采樣點(diǎn)采集大豆根腐病樣品432份，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存。應(yīng)用的培養(yǎng)基為玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）[8]和含有多菌靈、青霉素及利福平的玉米粒瓊脂培養(yǎng)基（CPR）[9]。自來水沖洗掉樣品表面泥土，在病健交界處取2 mm×2 mm的組織，用75%酒精表面消毒30 s，無菌水沖洗3 次，滅菌濾紙吸干，置于CPR 平板上，并將其放在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，挑取單菌絲置于CPR 平板中純化一次，再挑取單菌絲于CMA 平板擴(kuò)大培養(yǎng)[10]。

1.2 致病性測定

依據(jù)形態(tài)和培養(yǎng)性狀，將明顯不同的菌株歸為3 類，依次命名為SD-1、SD-2 和SD-3。應(yīng)用土壤接種法[11]進(jìn)行致病性測定。大豆品種為齊黃34。土壤滅菌后裝盆。接菌量為土壤重量的3%[11]，對照盆接種滅菌玉米粒。3 次重復(fù)。將接菌后的大豆植株置于密閉保濕桶中，24 h后取出，溫室培養(yǎng)。定期觀測記錄發(fā)病情況，3 天后從發(fā)病的植株上再次分離病原菌，驗(yàn)證與接種菌是否一致。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將純化的3 種腐霉菌接種到CMA 上，切取菌落邊緣的菌餅接種到Petris 培養(yǎng)液[8]中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每天觀察菌落形態(tài)，在顯微鏡下觀察菌絲、菌絲膨大體、藏卵器、雄器和卵孢子的大小、形態(tài)以及著生位置。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

用E. Z. N. A. Fungal DNA 提取試劑盒提取DNA，-20℃冰箱保存。以ITS、CoxII 和β-tubulin 基因序列為目標(biāo)序列，分別利用通用引物ITS1 和ITS4[12]、FM66 和FM58[13]、BT5 和BT6[13]擴(kuò) 增ITS、CoxII 和β-tubulin，引物序列如表1 所示。使用50μL PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板2μL，上下游引物各1μL，2x PCR Mix 25μL，ddH2O 21μL。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。在每次反應(yīng)中設(shè)陰性對照（不含模板DNA）。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化回收后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank 上與已發(fā)表的基因序列進(jìn)行同源性比對。根據(jù)ITS 序列分析結(jié)果，應(yīng)用MAGE6.0 完成最大似然法（Maximum Likelihood，ML）運(yùn)算，用Bootstrap 重復(fù)抽樣5000 次來評估各分支點(diǎn)的可信度（自舉值），建立系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。依據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)果確定大豆根腐病的病原菌種類。

表1 ITS、CoxII、β-tubulin引物序列Table 1 ITS,CoxII,β-tubulin primer sequences

1.5 病原菌再次分離

對人工接菌后發(fā)病的植株進(jìn)行病原菌的分離鑒定，驗(yàn)證與接種菌株是否一致。一致的話，則確定該菌株為致病菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離

從432 份病樣中分離出279 株真菌，其中52 株菌株類似腐霉菌。通過形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，SD-1為瓜果腐霉P. ɑphɑnidermɑtum，SD-2為終極腐霉P. ultimum，SD-3 為林棲腐霉P. sylvɑticum。其中，瓜果腐霉P. ɑphɑnidermɑtum分離頻率最高，林棲腐霉P. sylvɑticum分離頻率最低，詳見表2。

表2 大豆根腐病病原菌分離結(jié)果Table 2 Isolation results of soybean root rot pathogens

2.2 致病性測定

回接發(fā)現(xiàn)，SD-1、SD-2、SD-3 均可造成典型的根腐病病癥：葉片青枯，莖基部縊縮呈褐色，根部變褐呈水漬狀。高溫高濕時(shí)發(fā)病很快，3 天便發(fā)病死亡。如圖1所示。

圖1 人工接菌SD-1、SD-2、SD-3 3天后大豆幼苗癥狀Fig.1 Symptoms of soybean seedlings after artificial inoculation with SD-1,SD-2 and SD-3 for 3 days

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

SD-1、SD-2、SD-3 接種在CMA 培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)，SD-1、SD-2 經(jīng)2 d 便可長滿直徑90 mm平皿，SD-3 需要3 d 才可長滿。培養(yǎng)4 d 后，SD-1 在培養(yǎng)基表面向上生長，SD-2、SD-3 菌絲開始沿培養(yǎng)皿壁生長。SD-1、SD-2、SD-3 菌落在CMA 上呈放射狀，氣生菌絲棉絮狀，菌絲發(fā)達(dá)分支茂盛。

SD-1 孢子囊成簇狀，有間生及頂生，藏卵器近球型，表面平滑，平均直徑22.8μm。玉米粒狀的雄器可與藏卵器結(jié)合，形成卵孢子。卵孢子內(nèi)含貯球物，不滿器，平均直徑19.5μm（圖2）。

圖2 SD-1菌落和顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 colony and microstructure of SD-1

SD-2菌絲膨大體近球形，有間生、頂生，平均直徑21.3μm，雄器可與藏卵器結(jié)合，形成卵孢子。卵孢子平均直徑為21.1μm，內(nèi)含貯球物一個(gè)，不滿器，平均直徑為20.8μm（圖3）。

圖3 SD-2菌落和顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 Colony and microstructure of SD-2

SD-3 可長出菌絲膨大體，有頂生、間生，如圖4中的C、D、E、F所示，平均直徑26.8μm（圖4）。

圖4 SD-3菌落和顯微結(jié)構(gòu)Fig.4 Colony and microstructure of SD-3

參 照van der Plaats-Niterink[15]、余 永 年[16]、Kageyama[17]和Ueta 和Tojo[18]等人的方法對3 種菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。結(jié)果SD-1 為瓜果腐霉P.ɑphɑnidermɑtum，SD-2 為終極腐霉P. ultimum，SD-3為林棲腐霉P. sylvɑticum。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)ITS、CoxII、β-tubulin 測定的序列在NCBI上進(jìn)行比對的結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（表3、圖5、圖6）。根據(jù)ITS、CoxII、β-tubulin 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹可以確定SD-1 為瓜果腐霉P. ɑphɑnidermɑtum，SD-2 為終極腐霉P. ultimum，SD-3 為林棲腐霉P.sylvɑticum。

表3 ITS、β-tubulin和CoxII blast結(jié)果Table 3 ITS,β-tubulin and CoxII BLAST results

圖5 SD-1、SD-2、SD-3基于ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic trees of SD-1,SD-2 and SD-3 based on ITS sequence

圖6 SD-1、SD-2、SD-3基于β-tubulin序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic trees of SD-1,SD-2 and SD-3 based on β-tubulin sequence

2.5 病原菌再次分離結(jié)果

分離純化的菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。經(jīng)ITS 序列鑒定，SD-1 與序列號MN744684.1 相似性為99.73%，為瓜果腐霉P.ɑphɑnidermɑtum；SD-2 與序列號KU209757.1 的相似性為100%，為終極腐霉P. ultimum；SD-3 與序列號MN541113.1 的相似性為99.78%，為林棲腐霉P. sylvɑticum。確定瓜果腐霉P. ɑphɑnidermɑtum、終極腐霉P. ultimum和林棲腐霉P. sylvɑticum為大豆根腐病的致病菌。

3 討論

大豆根腐病病原組成復(fù)雜，多是幾種菌復(fù)合侵染，其中鐮孢菌最多，報(bào)道的常見鐮孢菌有尖孢鐮孢菌和茄腐鐮孢菌，此外還有立枯絲核菌，而腐霉菌報(bào)道較少。在山東，二十世紀(jì)八九十年代大豆根腐病的病原以鐮孢菌為主[6]，也有疫霉菌的報(bào)道[19]。之后20 多年，關(guān)于山東大豆根腐病的病原報(bào)道不多。而本次鑒定發(fā)現(xiàn)，腐霉菌已經(jīng)成為山東省大豆根腐病的重要病原菌。在其他省份，大豆腐霉菌根腐病也有報(bào)道，如福建省的瓜果腐霉P. ɑphɑnidermɑtum[20]，湖南省的刺腐霉P. spinosum[21]和終極腐霉P. ultimum[22]。加拿大的終極腐霉P. ultimum、異宗配合腐霉P. heterothɑllicum、林棲腐霉P. sylvɑticum等也可以導(dǎo)致大豆根腐病[23]。張瑞萍等從大豆土壤中[24]分離到林棲腐霉，接種后可導(dǎo)致種子腐爛及苗期莖折、樓兵干等[25]從大豆猝倒苗中也分離到了林棲腐霉。本研究與張瑞萍和樓兵干的分離材料不同，林棲腐霉P. sylvɑticum導(dǎo)致大豆成株期根腐病在國內(nèi)為首次報(bào)道。

本研究結(jié)果豐富了大豆根腐病的病原組成，為大豆根腐病抗性品種的選育及制定切實(shí)有效的防控措施提供了重要的理論依據(jù)。本課題組20 余年的研究發(fā)現(xiàn)，作物根腐類病害的病原菌已經(jīng)由鐮孢菌為主轉(zhuǎn)為鐮孢菌與腐霉菌并重，腐霉菌可以導(dǎo)致小麥、生姜、草莓、花生等多種作物的根腐病。在許多作物上，腐霉菌根腐病的發(fā)生頻率及危害程度已經(jīng)超過鐮孢菌根腐病。在炎熱多雨季節(jié)時(shí)，腐霉菌病程短、發(fā)病重、損失大。在制定根腐病防治策略和抗病育種目標(biāo)時(shí)必須把腐霉菌作為重要的目標(biāo)來對待。