微小RNA調(diào)控增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的研究進展

楊俊楠，包秀麗

0引言

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy, PVR)的基本病理改變是在玻璃體腔和(或)視網(wǎng)膜表面形成由細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)和各種類型細胞組成的視網(wǎng)膜前膜(epiretinal membranes, ERM)，ERM收縮形成視網(wǎng)膜皺褶，并牽拉視網(wǎng)膜引起視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment, RD)。PVR的病理過程包括血-視網(wǎng)膜屏障的破壞、細胞的增殖遷移、增殖膜的形成與收縮、ECM的沉積和視網(wǎng)膜皺褶的形成5個主要階段[1]。其中，視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是PVR病理機制中的核心環(huán)節(jié)，在細胞因子/生長因子、轉(zhuǎn)錄因子及miRNA等的調(diào)控下，RPE細胞經(jīng)歷表型轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞樣細胞并分泌ECM等成分，形成ERM。目前手術(shù)仍是PVR的主要治療手段，但存在復(fù)發(fā)率高、預(yù)后視力差等問題，主要原因在于未從根本上抑制ERM的形成，且至今未找到可靠的防治方法。因此，探討RPE細胞在EMT過程中的具體基質(zhì)和調(diào)控因素尤為重要。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA,miRNA)在許多疾病的穩(wěn)態(tài)和發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。本文對miRNA在PVR的病理機制，特別是miRNA調(diào)控RPE細胞EMT過程的研究做一綜述，旨為PVR的防治提供更多的理論和實驗依據(jù)。

1 PVR中的EMT

1.1PVR的發(fā)病機制PVR常見于RD或視網(wǎng)膜復(fù)位手術(shù)后，是導致RD復(fù)位手術(shù)失敗的常見原因。PVR的形成是眼內(nèi)組織的纖維化過程，當視網(wǎng)膜組織在缺血缺氧、氧化應(yīng)激、代謝障礙和炎癥等因素刺激下，血-視網(wǎng)膜外屏障受到破壞，異位的環(huán)境導致RPE細胞發(fā)生增殖和遷移，在玻璃體腔和(或)視網(wǎng)膜表面形成ERM，ERM收縮形成視網(wǎng)膜皺褶和RD[1]。此外，外層視網(wǎng)膜由于缺血發(fā)生視網(wǎng)膜感光細胞死亡和視網(wǎng)膜內(nèi)纖維化，從而導致外層視網(wǎng)膜僵硬和功能喪失，最終造成不可逆的視力損害[2]。在PVR病理改變中，不同部位的視網(wǎng)膜纖維增殖膜的組織學結(jié)構(gòu)各有差異：視網(wǎng)膜表面增殖膜中細胞占大部分的是轉(zhuǎn)分化的RPE細胞，還包括富含α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle action, α-SMA )的肌成纖維細胞(Myofabroblast, Mfb)、富含膠質(zhì)纖維酸性蛋白的神經(jīng)膠質(zhì)細胞和CD68陽性的巨噬細胞；視網(wǎng)膜下增殖膜中主要以CK17陽性的RPE細胞為主，間雜著Mfb、CD68陽性的巨噬細胞和Müller細胞等；視網(wǎng)膜內(nèi)的增殖膜中以Müller細胞為主，其他細胞成分還有待研究[3]。由此可見，參與PVR的主要細胞類型有RPE細胞、成纖維細胞(主要來源于RPE細胞)、免疫細胞(主要是巨噬細胞、淋巴細胞)和神經(jīng)膠質(zhì)細胞(主要是Müller細胞)。其中，RPE細胞在PVR的EMT中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。在RD中，RPE細胞從Bruch膜上脫落下來通過視網(wǎng)膜裂孔游走到玻璃體腔、視網(wǎng)膜表面或是視網(wǎng)膜下空間，在相關(guān)因子作用下引發(fā)一連串的級聯(lián)反應(yīng)包括EMT、細胞遷移、趨化、侵襲以及ECM收縮等[5]。歷經(jīng)EMT的RPE細胞成為多能干細胞，失去上皮特性表現(xiàn)出間充質(zhì)細胞特征，包括遷移、侵襲、抗凋亡和產(chǎn)生ECM的能力增強[6]。同時，RPE細胞還可轉(zhuǎn)化為成纖維樣細胞，產(chǎn)生α-SMA和膠質(zhì)纖維酸性蛋白等物質(zhì)并參與形成ERM。在EMT中，轉(zhuǎn)分化的RPE細胞是一種最常見的EMT形態(tài)，被認為是PVR這一復(fù)雜纖維化過程的主要參與者。

1.2PVR中的RPE細胞RPE細胞是具有色素微絨毛的高度分化的單層細胞，生理狀態(tài)下整齊排列在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與脈絡(luò)膜之間的Bruch膜上，該膜含有透明質(zhì)酸、基質(zhì)蛋白、硫酸軟骨素、彈性蛋白和Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ型膠原等[7]。RPE細胞是血-視網(wǎng)膜外屏障的組成部分之一，參與脈絡(luò)膜毛細血管與視網(wǎng)膜光感受器細胞之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，具有支持和營養(yǎng)光感受器細胞、再生及修復(fù)等功能。在生理條件下，RPE細胞處于分裂靜止狀態(tài)，不會進行增殖和遷移，停留在G0期。視網(wǎng)膜出現(xiàn)裂孔時，由于血-視網(wǎng)膜外屏障受損或異?；罨募毎置诖罅康募毎蜃雍蜕L因子釋放入玻璃體腔[8]，暴露于玻璃體腔的RPE細胞失去上皮表型，轉(zhuǎn)換為具有高度侵襲遷移能力的紡錘狀的間充質(zhì)細胞。在轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、血小板衍生生長因子、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α)和凝血酶等因子的刺激下，靜止的RPE細胞被激活進入活躍的細胞周期，具有更強的增殖、遷移和發(fā)生EMT的能力[9]。RPE細胞經(jīng)歷EMT過程轉(zhuǎn)化為成纖維細胞樣細胞，與神經(jīng)膠質(zhì)細胞等共同作用并分泌ECM形成ERM，引起RD。因此探討RPE細胞在PVR中的分子機制，對PVR的早期防治具有重要意義。

1.3RPE細胞的EMT EMT是指上皮細胞在多種因素的作用下失去其上皮表型轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型的生物學過程，EMT介導三種類型的生理功能：(1)促進胚胎和器官的發(fā)育；(2)加速創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生和器官纖維化進程；(3)參與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲過程[10]。EMT是一個動態(tài)且可逆的過程，具體包括細胞表面分子的異常表達、細胞骨架的重建、頂-底極性的缺失、ECM的過度分泌、細胞增殖和遷移侵襲能力增強。EMT過程中的分子機制包括上皮細胞標記物包括緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1)、P-鈣黏蛋白(P-cadherin)、細胞角蛋白(cytokeratin, CK)和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達降低，以及間充質(zhì)標記物包括α-SMA、波形蛋白(vimentin)和纖連蛋白(fibronectin)的表達增加[11]。RPE細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)分化為Mfb的過程被稱為上皮-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化(Epithelial-myofibroblast transition, EmyT)[12]。RPE中的細胞間黏附可通過由黏著連接(Adherens junctions, AJs)、緊密連接(Tight junctions, TJs)和縫隙連接(Gap junctionss,GJs)組成的連接復(fù)合體維持，而緊密連接蛋白ZO-1和E-cadherin、P-cadherin和N-cadherin等是細胞間黏附作用的必要條件。α-SMA是一種參與調(diào)節(jié)細胞運動的細胞骨架微絲蛋白，具有極強的收縮性能。Vimentin也是一種細胞骨架蛋白，在遷移過程中起著穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)的作用。Fibronectin是一種細胞內(nèi)微絲沉積所必需的間充質(zhì)蛋白。最近的研究表明，細胞間黏附作用在維持RPE細胞上皮表型方面很重要，RPE細胞間這種連接的破壞可誘導EMT發(fā)生。Zhitnyak等[13]發(fā)現(xiàn)當RPE細胞發(fā)生E-cadherin到N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換”，正常的細胞間黏附被破壞，最終導致RPE細胞發(fā)生EMT。

2 miRNA對EMT的調(diào)控

miRNA是一組由18～24個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，序列具有高度保守性，充當信使RNAs(mRNAs)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑，可與目的mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’UTR)特異性結(jié)合，通過對靶基因表達和蛋白質(zhì)翻譯的負反饋調(diào)節(jié)來調(diào)控機體的基本生物過程，例如細胞增殖、侵襲遷移、分化、凋亡和EMT等過程[14]。單個miRNA可以同時下調(diào)多個靶點，這些靶點通常屬于同一代謝或信號通路，提示miRNA在調(diào)節(jié)細胞活動中的重要性。目前已知眼部存在百余種miRNA，差異性地表達于角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜、RPE和脈絡(luò)膜組織中，參與調(diào)控多種生理和病理的生物學活動，特別是miRNA與RPE細胞的EMT過程密切相關(guān)[15]。可知，miRNA是調(diào)控EMT的重要表觀遺傳因素之一。因此，明確miRNA調(diào)控RPE細胞EMT過程的作用機制對于纖維化疾病(例如PVR)的防治具有重要意義。

3 RPE細胞中的miRNA和EMT

近年來，越來越多聚焦于miRNA的研究發(fā)現(xiàn)其與心臟、肺、腎和肝臟等器官纖維化過程有著密不可分的關(guān)系，是纖維化疾病的有效調(diào)節(jié)劑。在眼部，若干特定的miRNA可直接靶向調(diào)節(jié)多種EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，進而誘導或抑制RPE細胞的EMT過程，在PVR的病理進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3.1miR-124 miR-124主要在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)中呈高表達狀態(tài)，是CNS發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一[16]。研究發(fā)現(xiàn)miR-124通過靶向前列腺癌細胞中的Slug基因抑制TGF-α 誘導的EMT，miR-124也可調(diào)節(jié)乳腺癌MDA-MB-231細胞中的Slug基因來抑制EMT過程[17-18]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞與CNS組織均起源于神經(jīng)外胚層，miR-124在視網(wǎng)膜中也呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。Jun等[19]發(fā)現(xiàn)miR-124在RPE細胞通過靶向結(jié)合RHOG 3’UTR區(qū)域以抑制EMT中的細胞遷移，從而阻礙PVR的發(fā)生。具體機制為TGF-β1的作用下，過表達的miR-124與RHOG 3’UTR區(qū)域相結(jié)合，下調(diào)RHOG的表達，RHOG既是控制肌動蛋白重塑的關(guān)鍵信號分子又可以作用于其下游的RAC1，調(diào)節(jié)TGF-β1誘導的上皮細胞可塑性，從而抑制EMT發(fā)生[20]。轉(zhuǎn)分化的RPE細胞能夠分泌不同類型的膠原和纖連蛋白參與形成ERM，并在細胞因子的作用下影響細胞間黏附和細胞表型。研究發(fā)現(xiàn)，過表達的miR-124可以抑制膠原收縮、減弱細胞運動和增強細胞間黏附，抑制TGF-β1介導的ERM形成[7]。由此可見，miR-124通過TGF-β1/RHOG/RAC1途徑參與了EMT過程，從而推測上調(diào)或加入外源性miR-124也許能夠抑制PVR的發(fā)展，有望成為PVR防治的新靶點。

3.2miR-29b miR-29b是miR-29家族的成員之一，通常在正常組織中呈現(xiàn)高表達，而在神經(jīng)母細胞瘤、膠原母細胞瘤、慢性淋巴細胞白血病和肺癌等腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達，并且與器官的纖維化高度相關(guān)[21]。在肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的miR-29b通過降低TGF-β1的表達水平，導致成纖維細胞和膠原蛋白生成減少，從而抑制肺纖維化中的EMT進程[22]。Li等[23]首先檢測了TGF-β1誘導ARPE-19細胞發(fā)生EMT的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)在5種表達下調(diào)的miRNAs中，miR-29b的下調(diào)最顯著。

存在于人Mfb的miR-29b可通過調(diào)節(jié)PI3K、AKt和Sp1信號分子參與纖維化進程。在人RPE細胞中，上調(diào)的miR-29b可以特異性結(jié)合Akt2，作為非SMAD信號通路之一的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/ Akt途徑的重要組成部分，在肺癌細胞、軟骨肉瘤細胞和腎小管上皮細胞中介導細胞中的EMT。具體機制為TGF-β1誘導ARPE-19細胞發(fā)生EMT時，Akt2和p-Akt2表達上調(diào)，這一過程可被miR-29b阻斷，提示miR-29b可能是通過阻斷PI3K / Akt信號通路抑制PVR中的EMT過程[24]。此外，ARPE-19細胞中的miR-29b上調(diào)還可以直接抑制EMT過程，表現(xiàn)為α-SMA的表達下調(diào)以及E-cadherin和ZO-1的表達上調(diào)，從而抑制細胞的遷移[23]。這些結(jié)果證實了miR-29b及其靶基因Akt2在ARPE-19細胞EMT過程中發(fā)揮著重要作用，但其下游分子通路尚有待于進一步研究。

3.3miR-34a miR-34a在CNS中呈現(xiàn)高表達，通過結(jié)合下游靶基因調(diào)控細胞增殖、遷移及凋亡等過程[25]。miR-34a可通過與乳腺癌細胞中的腫瘤蛋白D52(TPD52)基因的3’UTR區(qū)域結(jié)合，抑制EMT過程中的細胞遷移和侵襲[26]。C-Met是一種肝細胞生長因子(HGF)受體，作為miR-34a重要的下游靶基因之一，參與調(diào)節(jié)細胞生長、遷移和再生過程。Hou等[27]發(fā)現(xiàn)miR-34a通過結(jié)合HGF/c-Met信號通路中的c-Met分子，下調(diào)c-Met基因的表達抑制RPE細胞增殖和遷移，減緩PVR的發(fā)展進程。Hou等[28]在之后的研究中發(fā)現(xiàn)LGR4也是miR-34a的下游靶基因之一，miR-34a與LGR4的3’UTR區(qū)域結(jié)合下調(diào)LGR4的表達，進而抑制ARPE-19的增殖、遷移和減弱細胞間黏附。miR-34a還可直接或間接調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)分子，包括E2F1、細胞周期蛋白依賴激酶2(Cyclin-dependent kinase 2, CDK2)、CDK4、CDK6和磷酸化CDC-2(p-CDC2)等，通過下調(diào)這些細胞周期調(diào)節(jié)因子進而阻斷細胞由G1期進入S期，抑制PVR的發(fā)生[27]?？梢姡琺iR-34a通過下調(diào)其靶基因的表達，阻礙RPE細胞的增殖遷移，在PVR中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。以miR-34a和LGR4為基因靶點，在PVR的治療中有著重要的臨床意義。

3.4miR-let7c miR-let7c是miR let7家族的成員之一，通過負反饋調(diào)節(jié)多種器官纖維化中的EMT過程，在RPE細胞中可調(diào)控TGF-β2誘導的EMT過程[29]。在腎纖維化過程中，miR-let7c-5p直接與TGF-βmRNA 3’UTR的167-173位點結(jié)合，發(fā)揮對TGF-β的負反饋調(diào)控，影響腎臟的纖維化進程[30]。在TGF-β2誘導的PVR中，miR-let7c在RPE細胞中呈現(xiàn)低表達，誘導PVR的發(fā)生。當miR-let7c在RPE細胞中過表達時，通過作用于TGF-β2激活NF-κB信號通路，間充質(zhì)標記蛋白N-cadherin和Vimentin的表達相對減少，上皮標記細胞角蛋白-18(Cytokeratin-18，CK-18)的表達相對增加，抑制EMT過程[31]。本研究中過表達的miR-let7c以NF-κB依賴性方式作為EMT過程的抑制因子，參與調(diào)控PVR的發(fā)生發(fā)展[31]，揭示miR-let7c可能成為PVR的防治的新靶點。

3.5miR-194 早期研究發(fā)現(xiàn)，miR-194在發(fā)育期小鼠的內(nèi)耳膜和視網(wǎng)膜等器官感受器的上皮中表達。Lu等[32]的研究發(fā)現(xiàn)miR-194在視網(wǎng)膜各層組織中均有表達，在RPE-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細血管復(fù)合體中表達最高，可以調(diào)節(jié)RPE細胞的功能。此外，在鼠的視網(wǎng)膜和人的ARPE-19細胞中富含miR-194，過表達miR-194的RPE細胞mRNA表達譜顯示與感染、炎癥、Hippo通路、NF-κB通路相關(guān)以及與RPE細胞吞噬作用、細胞間黏附以及與ECM相互作用等功能密切相關(guān)的基因呈現(xiàn)高表達。

體內(nèi)和體外實驗均發(fā)現(xiàn)，ARPE-19細胞中過表達的miR-194可通過7-mer區(qū)域與ZEB1的 3’UTR區(qū)域互補結(jié)合，激活TGF-β1/ZEB1及Hippo信號通路來負反饋調(diào)節(jié)ZEB1的表達水平，抑制TGF-β1誘導的α-SMA的表達[33]。ZEB1是調(diào)節(jié)細胞可塑性和激活EMT、誘導腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要驅(qū)動因子。同時發(fā)現(xiàn)，高水平的miR-194通過經(jīng)典TGF-β1途徑以及與SMAD3協(xié)同作用調(diào)節(jié)ZEB1下游靶標的表達，包括上調(diào)E-cadherin和ZO-1等上皮標記基因的表達，下調(diào)N-cadherin、fibronectin等間充質(zhì)標記基因的表達[33]。可見，敲低RPE細胞中ZEB1的表達可減弱其與SMAD3之間的相互作用，能夠有效抑制EMT過程。除通過與TGFβ-1和ZEB1的交互作用外，miR-194可以通過Hippo通路激活ZEB1的轉(zhuǎn)錄啟動EMT，ZEB1通過抑制miR-200家族、miR-203、miR-183和miR-141的表達促進EMT、ZEB1可與其它EMT相關(guān)蛋白包括BMI1、EP300、IGFRIR和FOXM1之間互相調(diào)控，主要通過SNAI1和SNAI2與Hippo通路相聯(lián)系[34]，ZEB1是不可或缺的核心成分?？傊?，miR-194過表達可抑制TGF-β1誘導的EMT過程，并降低ZEB1的mRNA和蛋白表達，這為PVR的防治提供了新的理論依據(jù)。

Chen等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)TGF-β2處理的ARPE-19細胞的EMT中185種miRNAs被下調(diào)，而119種miRNAs被上調(diào)，而且大多數(shù)miRNA通過影響與EMT相關(guān)的因子來間接參與PVR的發(fā)生，未來仍有許多未知的miRNA及其作用機制有待進一步研究。

4小結(jié)

綜上，PVR是一個由多因素、多通路共同調(diào)控的疾病，RPE細胞通過EMT過程介導ERM的形成是PVR中的關(guān)鍵步驟。目前已有大量研究證實miRNA在PVR的EMT過程中的重要作用，但針對miRNA及其下游靶基因的作用機制尚不完全清楚，仍有待進一步研究。探索miRNA和miRNA激動劑/拮抗劑，或與其他抗PVR藥物的聯(lián)合應(yīng)用，可以為防治PVR藥物的研制和開發(fā)開辟新領(lǐng)域。