轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在癲癇診療中的應(yīng)用

康 慧 張敬軍

山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東 泰安 271000

癲癇是一種高度異質(zhì)性的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全世界約有5 000萬癲癇患者［1］，癲癇發(fā)病機(jī)制尚未明確，2017年國際抗癲癇聯(lián)盟（ILAE）將導(dǎo)致癲癇的病因分為六類：遺傳性、代謝性、結(jié)構(gòu)性、免疫性、感染性和病因未明等［2］。近年來，隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，尤其是轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-sequencing，RNAseq）技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究，大量癲癇相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，RNA-seq對癲癇的發(fā)病機(jī)制研究有重要價(jià)值，本文探討RNA-seq在癲癇診療中的應(yīng)用。

1 RNA-seq

RNA是以DNA一條鏈為模板，依照堿基互補(bǔ)配對原則，轉(zhuǎn)錄形成的一條單鏈，可引導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，是連接DNA與蛋白質(zhì)的橋梁。RAN種類繁多，目前在生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)10多種RNA，如信使RNA（mRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）、miRNA、小分子RNA（small RNA）、不均一核RNA（hn RNA）、端粒酶RNA等，其中mRNA、tRNA和rRNA是細(xì)胞質(zhì)中參與蛋白質(zhì)合成的三類主要的RNA［3］。轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在特定發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的集合，具有空間和時(shí)間特異性，反映細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的表型和功能，對細(xì)胞生物活性調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用［4］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平上研究基因表達(dá)，屬于功能基因組學(xué)研究范疇。

RNA-seq又稱轉(zhuǎn)錄組高通量測序，是轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)展的創(chuàng)新性技術(shù)，通過檢測一個(gè)生物體中全部RNA的表達(dá)水平，從而獲得基因表達(dá)。RNA-seq技術(shù)應(yīng)用廣泛，是后基因組時(shí)代對基因組結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行深入研究的首選技術(shù)，應(yīng)用RNA-seq可獲得物種或者組織的轉(zhuǎn)錄組信息，得到轉(zhuǎn)錄組上基因的相關(guān)信息，挖掘新的基因，優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)可變剪切及基因融合，分析基因表達(dá)差異等［5］。

RNA-seq目前主要應(yīng)用在基因表達(dá)水平及差異分析。在神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病中，RNA-seq得到廣泛應(yīng)用，如癲癇、孤獨(dú)癥、精神分裂癥、抑郁癥等［6］。RNA-seq解決了傳統(tǒng)測序技術(shù)面臨的問題，相對于其他測序技術(shù)有明顯的優(yōu)勢：①不依賴參考基因組，對于大多數(shù)沒有高質(zhì)量完成基因組的有機(jī)體，從頭組裝可以提供一組初始轉(zhuǎn)錄物，從而進(jìn)行RNA序列表達(dá)研究［7］；②效率高，測序速度快，極大縮短了轉(zhuǎn)錄組的測序時(shí)間；③敏感度高，RNA-Seq已成功地用于分離基因組中相鄰的重疊基因和相反的鏈［8］；④精確性高，對嵌套基因和多映射基因可做到精確量化［8］；⑤費(fèi)用成本低，人類第一次基因組測序花費(fèi)有幾百萬美元，而利用高通量測序的成本大大降低；⑥操作簡便，無需提前針對已知序列設(shè)計(jì)探針，不需要克隆等過程，對樣本量要求較少。

目前，RNA-Seq主要有3種測序平臺：Roche/454、ABI/Solid、Illumina/Solexa，測序原理及序列長度的差異決定了這3種測序平臺在不同領(lǐng)域的應(yīng)用［9］。通常應(yīng)用Roche/454平臺探索單核苷酸多態(tài)性，應(yīng)用ABI/Solid測序平臺測序細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，應(yīng)用Illumina/Solexa測序平臺對哺乳動物轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析研究。

2 RNA-seq技術(shù)在癲癇中的應(yīng)用

2.1 難治性癲癇

難治性癲癇約占癲癇患者的20%~30%［10］，難治性癲癇患者不僅死亡率顯著增加，早期發(fā)病還伴隨認(rèn)知、行為、運(yùn)動障礙和神經(jīng)發(fā)育遲滯［11］。在兒童以Lennox-Gastaut綜合征為代表，成人以難治性顳葉癲癇為代表，顳葉癲癇中約30%是藥物難治性癲癇，手術(shù)是主要治療方法之一，然而仍有1/3患者在術(shù)后繼續(xù)出現(xiàn)癲癇發(fā)作［12］。海馬硬化（hippocampalsclerosis，HS）是難治性顳葉癲癇中最為常見的神經(jīng)病理類型，主要病理改變?yōu)橐种菩陨窠?jīng)元數(shù)目減少，神經(jīng)元樹突棘喪失及星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，約70%的難治性顳葉癲癇患者在磁共振上顯示出海馬硬化跡象［13］。文獻(xiàn)報(bào)道，與對照組相比，難治性顳葉癲癇患者海馬中參與突觸功能和離子通道的基因甲基化程度較高，不同亞型的海馬硬化甲基化程度也不同，這反映在基因的差異表達(dá)中［14］。Griffin等［15］應(yīng)用RNA-seq對伴有或不伴有海馬硬化的顳葉癲癇患者的齒狀顆粒細(xì)胞進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn)，與沒有海馬硬化的樣本相比，海馬硬化樣本中55個(gè)轉(zhuǎn)錄物顯著上調(diào)，11個(gè)轉(zhuǎn)錄物顯著下調(diào)，這些差異基因主要與氧化磷酸化、神經(jīng)變性和突觸傳遞相關(guān)。在動物模型中應(yīng)用RNA-seq分析癲癇持續(xù)狀態(tài)誘導(dǎo)的海馬RNA表達(dá)差異［16］。Dixit等［17］應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對難治性癲癇患者切除的海馬組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)難治性癲癇患者中56個(gè)顯著調(diào)節(jié)基因，這些基因主要與神經(jīng)免疫、神經(jīng)炎癥、能量代謝及突觸傳遞等有關(guān)，為難治性癲癇的基因組學(xué)提供了新的認(rèn)知。目前，難治性顳葉癲癇患者發(fā)病機(jī)制尚未闡明，Hammer等［18］對高頻率癲癇發(fā)作和低頻率癲癇發(fā)作患者的海馬組織進(jìn)行RNA-seq，并進(jìn)行一系列差異表達(dá)和富集分析，發(fā)現(xiàn)與低頻率癲癇發(fā)作組相比，高頻率癲癇發(fā)作組與更多信號通路改變有關(guān)，其中很多信號通路失活。

2.2 Dravet綜合征

Dravet綜合征又稱為嬰兒嚴(yán)重肌陣攣性癲癇，于嬰兒期出現(xiàn)癥狀性癲癇性腦病，癲癇發(fā)作表現(xiàn)為多種形式，包括局灶性發(fā)作、全面強(qiáng)直-陣攣發(fā)作、肌陣攣發(fā)作及非典型失神發(fā)作等，易出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，該病猝死率大約為10%［19-20］。研究顯示約70%~80%的Dravet綜合征由SCN1A突變導(dǎo)致［21］，是該病最常見的致病基因，該基因編碼電壓門控鈉離子通道，突變誘發(fā)大腦神經(jīng)元細(xì)胞功能障礙，從而導(dǎo)致癲癇發(fā)作。研究發(fā)現(xiàn)，海馬硬化的兒童中71.4%為Dravet綜合征，平均年齡為7.2歲［22］。Hawkins等［23］研究發(fā)現(xiàn)Dravet綜合征小鼠模型，一組129S6/SVEVTAC（129）SCN1A+/-系小鼠具有正常表型和壽命，而另一組［129xc57bl/6j］f1-scn1a+/-系小鼠出現(xiàn)自發(fā)性癲癇以及高死亡率，利用RNA-seq對這兩組小鼠的海馬組織進(jìn)行候選基因分析，顯示Gabra2基因?yàn)楦叨葍?yōu)先級候選基因，并且通過表達(dá)分析和藥理學(xué)方法將Gabra2基因鑒定為影響SCN1A+/-Dravet模型中小鼠存活的推定修飾基因。

2.3 SCN8A腦病

電壓門控鈉通道基因SCN8A位于12q13號染色體上，在興奮性和抑制性神經(jīng)元中表達(dá)［24］，在軸突起始段和Ranvier節(jié)點(diǎn)濃度較高，SCN8A基因突變增加鈉通道亞單位Nav1.6的活性，主要見于癲癇性腦病患者，被稱為SCN8A腦病，該腦病的突出特征為出生后18個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)癲癇發(fā)作，多見于4個(gè)月大的嬰兒，合并癥包括發(fā)育遲緩、嚴(yán)重智力障礙、多發(fā)性精神障礙及多發(fā)性精神分裂癥等［25］。一些研究發(fā)現(xiàn)良性家族性震顫、陣發(fā)性舞蹈病中也存在SCN8A基因突變［26］，與發(fā)熱有關(guān)的全身性強(qiáng)直性癲癇發(fā)作也與SCN8A基因突變有關(guān)［27］。通過TALEN靶向?qū)CN8A腦病的患者中鑒定的基因突變p.Asn1768 Asp（N1768D）引入小鼠基因組中，然后在SCN8A腦病小鼠模型中進(jìn)行RNA-seq，結(jié)果顯示僅在癲癇發(fā)作后的前腦中轉(zhuǎn)錄譜有差異，癲癇發(fā)作后50個(gè)轉(zhuǎn)錄本的豐度增加超過3倍，15個(gè)轉(zhuǎn)錄本減少超過3倍，升高的轉(zhuǎn)錄物包括抗驚厥神經(jīng)肽基因、參與反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生基因及損傷神經(jīng)元的基因［28］，為抗癲癇藥物研究提供了新的靶點(diǎn)。

2.4 遺傳性癲癇

文獻(xiàn)報(bào)道遺傳性癲癇患者約占40%，大多數(shù)由基因突變導(dǎo)致，這些基因突變主要導(dǎo)致離子通道功能障礙，例如鉀離子通道、鈉離子通道、鈣離子通道和氯離子通道［29］，其中電壓門控鈉離子通道是迄今發(fā)現(xiàn)與遺傳性癲癇最為密切的通道，該通道由α亞基和β亞基組成［30］。在遺傳性癲癇家族患者中，具有相同鈉離子通道基因突變的家庭成員的臨床嚴(yán)重程度具有差異性，這表明其他基因改變了初級突變的作用，導(dǎo)致臨床表現(xiàn)的差異性，可以把這些基因稱作修飾基因。Scn2aq54轉(zhuǎn)基因小鼠模型由于Scn2a突變而具有癲癇表型，該突變導(dǎo)致鈉離子通道失活［31］，Scn2aq54小鼠癲癇表型的嚴(yán)重程度與遺傳背景高度相關(guān)。研究人員繪制了兩個(gè)基因座，即染色體11上的Moe1（癲癇修飾區(qū)）以及染色體19上的Moe2，這兩個(gè)基因座與Scn2aq54表型的嚴(yán)重程度有關(guān)［32］。研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6J系小鼠與SJL系小鼠雜交后出現(xiàn)新一代小鼠，新一代小鼠與C57BL/6J系上同源的Scn2aq54小鼠表現(xiàn)出遲發(fā)性癲癇發(fā)作和較高的生存率。應(yīng)用RNA-seq在Moe1中進(jìn)行候選基因分析，對兩系小鼠腦組織RNA進(jìn)行測序，顯示出幾種作用強(qiáng)的修飾基因，包括兩個(gè)電壓門控鈣通道亞基Cacna1g和Cacnb1，以及富含脯氨酸和酸性氨基酸的堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子HLF［33］。認(rèn)識遺傳修飾基因的分子基礎(chǔ)有助于人類研究新型抗癲癇藥物，為癲癇的精準(zhǔn)化治療提供新靶點(diǎn)。

2.5 局灶性腦皮質(zhì)發(fā)育不良（focalcorticaldysplasia，F(xiàn)CD）

FCD是皮質(zhì)發(fā)育畸形（malformations of cortical development，MCDs）的一類特殊亞型，首先由Taylor等［34］于1971年報(bào)道。FCD的病理特征是皮質(zhì)分子層結(jié)構(gòu)紊亂以及出現(xiàn)異常神經(jīng)元細(xì)胞。2011年，ILAE根據(jù)FCD患者的影像學(xué)、病理學(xué)及電生理特性，將FCD系統(tǒng)分為三型，即FCDⅠ型（Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc），F(xiàn)CDⅡ型（Ⅱa、Ⅱb），F(xiàn)CDⅢ型（Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc、Ⅲd）。研究表明FCD亞型可以根據(jù)DNA甲基化來區(qū)分，F(xiàn)CD中的甲基化測序顯示基因體、基因間區(qū)和增強(qiáng)子受到差異甲基化的影響［35］。目前，國內(nèi)外對于FCD導(dǎo)致癲癇發(fā)作的機(jī)制尚不明確，以往的研究主要是對致癇細(xì)胞的探討，研究認(rèn)為巨型神經(jīng)細(xì)胞和未成熟細(xì)胞可能導(dǎo)致了癲癇發(fā)作［36］。近年來隨著基因技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)報(bào)道提出FCD存在某些特征性基因突變，F(xiàn)CDⅡ型通常發(fā)病年齡早、癲癇發(fā)作頻率高且發(fā)作時(shí)間長［37］。用微陣列分析了Ⅱb型FCD患者的微RNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)有24個(gè)微RNA表達(dá)存在差異，其中19個(gè)微RNA表達(dá)上調(diào)，5個(gè)表達(dá)下調(diào)［38］。以FCDⅡ型患者腦組織及正常對照腦組織為研究對象，應(yīng)用RNA-seq及基因差異表達(dá)分析，研究發(fā)現(xiàn)FCDⅡa及FCDⅡb共同差異表達(dá)基因464個(gè)，對這些基因進(jìn)行功能聚類分析發(fā)現(xiàn)其主要與陽離子運(yùn)輸通道、P2嘌呤受體通路、血管形成等有關(guān)。FCDⅡa特異性表達(dá)基因536個(gè)，F(xiàn)CDⅡb特異性表達(dá)基因687個(gè)，同時(shí)對這些特異性表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CDⅡa特異性表達(dá)基因主要與離子通道有關(guān)，F(xiàn)CDⅡb特異性表達(dá)基因主要與細(xì)胞周期及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)，這些共同差異表達(dá)基因和特異性表達(dá)基因?yàn)榘d癇的發(fā)病機(jī)理及治療提供了新的研究方向。

3 展望

目前RNA-seq技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，與其他測序技術(shù)相比有明顯的優(yōu)勢，RNA-seq對于新基因發(fā)現(xiàn)、代謝通路調(diào)控等研究具有重要的意義。同時(shí)RNA-seq也面臨著多種挑戰(zhàn)，如需要研發(fā)高效的途徑來存儲、檢索和處理大量數(shù)據(jù)。

RNA-seq在不同類型癲癇的病因及治療研究中發(fā)揮重要的作用，通過對差異表達(dá)基因的分析，可以篩選出致病基因，并對其進(jìn)行下一步的驗(yàn)證和研究。，隨著對RNA-seq更深入的研究，對癲癇的發(fā)病機(jī)理及防治將起到重要的推動作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突