鐵死亡與缺血性腦卒中及其中醫(yī)藥干預研究進展

劉長興，郭心怡，張雷雷，常翔

腦卒中是全球殘疾和死亡的主要原因之一［1］，其可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中以缺血性腦卒中為主，缺血性腦卒中約占所有腦卒中的4/5［2］。缺血性腦卒中是由于腦供血動脈狹窄或閉塞導致腦供血障礙，并導致局部腦組織缺血性壞死或腦軟化的一種腦血管疾?。?］。由于腦組織的缺血缺氧，缺血性腦卒中患者神經元的正常血液供應被破壞，進而導致神經元死亡［4］。然而，缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展機制目前尚不完全清楚。隨著對細胞死亡研究的深入，鐵死亡作為一種新的細胞死亡方式逐漸受到了人們關注，其在形態(tài)學、分子機制、免疫特征上不同于其他類型的細胞死亡［5］。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡是腦卒中等急性腦損傷患者病理性細胞死亡的重要機制，并且有研究發(fā)現(xiàn)，鐵抑制劑具有減輕神經功能損傷的功效［6］。因此，本文就鐵死亡與缺血性腦卒中的關系及其中醫(yī)藥干預相關研究進行綜述，以期為發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中藥物作用的新靶點提供參考。

1 鐵死亡

1.1 鐵死亡的特點 鐵死亡最早于2012年由DIXON等［7］提出，其是一種鐵依賴性的以細胞內活性氧堆積為特征的新型非凋亡性細胞死亡方式。有趣的是，在鐵死亡這一概念被提出之前，其誘導劑就已經被確認，研究發(fā)現(xiàn)，一種新的Erastin化合物可以殺死RAS基因突變的癌細胞，且該細胞死亡過程不涉及細胞核變化及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3）的活化，該化合物所引起的細胞死亡方式后來被證明是鐵死亡［8］。鐵死亡不同于凋亡、壞死、自噬和其他形式的細胞死亡，在細胞學方面，鐵死亡后細胞內線粒體明顯皺縮，線粒體膜密度增加，線粒體嵴消失，線粒體外膜破裂［5，9］。

1.2 鐵死亡的發(fā)生機制 鐵死亡的確切發(fā)生機制目前尚不清楚，但有研究表明，其與鐵代謝異常、脂質過氧化以及System Xc-失調密切相關［5］。

1.2.1 鐵代謝異常 鐵參與了細胞的多種生理功能，如氧氣運輸、線粒體呼吸、DNA復制和細胞信號傳遞。雖然機體中鐵含量很高，但其生物利用度有限，主要以鐵離子的形式存在［10］，其在生理pH值條件下不溶于水溶液。鐵可以形成鐵離子和亞鐵離子，從而能夠作為過渡金屬，在氧化還原反應中輕松地失去或得到電子［11］。通常細胞內的鐵是由一個微妙的調節(jié)系統(tǒng)所維持的：銅藍蛋白（ceruloplasmin，Cp）通過氧化從腸道吸收的亞鐵離子產生鐵離子，并與轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）結合形成轉鐵蛋白-鐵離子（transferrin-Fe3+，TF-Fe3+）復合物，從而被內吞進入細胞［12］；前列腺六跨膜上皮抗原3（six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3，STEAP3）將鐵離子還原為亞鐵離子，繼而二價金屬離子轉運體1（divalent metal-ion transporter-1，DMT1）將亞鐵離子儲存在一個鐵礦池（labile iron pool，LIP）中［13］。為了維持平衡，多余的亞鐵離子會被鐵轉運蛋白（ferroportin，F(xiàn)pn）氧化為鐵離子，當細胞內存在過量的游離亞鐵離子時，其可能通過Fenton反應促進羥基自由基的形成，從而導致DNA、蛋白質和脂質損傷引起的鐵死亡［14］。因此，減少細胞內游離亞鐵離子，如使用鐵螯合劑，可抑制鐵死亡的發(fā)生。

1.2.2 脂質過氧化 多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）是一種主要存在于細胞膜上的脂肪酸，包括花生四烯酸（arachidonic acid，AA）和腎上腺酸（adrenic acid，ADA），其對氧化非常敏感，可導致脂質過氧化氫（lipid hydroperoxide，LOOH）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累［15］。PUFA在細胞內的富集和定位可決定鐵死亡的程度。在氧化發(fā)生之前，PUFA酯化為膜磷脂〔主要為磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl-ethnolamine，PE）〕，然后通過脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）進一步氧化為氫過氧化物AA-PE-OOH或ADA-PE-OOH，從而誘導鐵死亡的發(fā)生。在AA-PE或ADA-PE的形成過程中，?；o酶A合成酶長鏈家族成員4（long-chain acyl CoA synthetase 4，ACSL4）和溶血磷脂酰膽堿?；D移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）被認為是AA和ADA酯化為PE的促進劑［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）可以抑制ACSL4及LPCAT3的活性［17］。這表明，即使當細胞膜中存在高氧化性PUFA，鐵死亡只有在GPX4直接或間接〔即谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗盡后〕失活后才能發(fā)生。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，15-LOX和磷脂酰乙醇胺結合蛋白1（phosphatidylethanolamine binding protein 1，PEBP1）所形成的復合物對于誘導AA-PE脂質過氧化和形成親鐵質15-HOOAA-PE過氧化物至關重要，而誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）可通過抑制15-LOX/PEBP1的氧化活性來防止鐵死亡信號的產生，且該氧化活性獨立于GPX4/GSH系統(tǒng)［18-19］。

1.2.3 System Xc-失調 System Xc-是一個由重鏈亞單位（CD98hc，SLC3A2）和輕鏈亞單位（xCT，SLC7A11）組成的二硫連接的異質體［20］，其是由細胞內高濃度的谷氨酸所驅動進行轉運的，且不依賴ATP，因而在腦組織受損時System Xc-會受到細胞外高濃度谷氨酸的抑制［21］。System Xc-可將細胞外的胱氨酸運到細胞內，然后轉化為半胱氨酸用于GSH的合成，而將細胞內的谷氨酸轉移出細胞［22］。GPX4將GSH作為輔助因子，進行細胞抗氧化防御。System Xc-可誘導GSH耗竭并間接地使GPX4失活，導致ROS的積累，從而引起鐵死亡［23］；或通過抑制谷氨酸-半胱氨酸連接酶〔如丁硫氨酸磺酰亞胺（butylthiocyanine sulfonimide，BSO）〕直接抑制GSH的合成，從而誘發(fā)鐵死亡［24］。GPX4通過消耗GSH將LOOH還原為脂質醇（lipid alcohol，LOH），GSH被氧化為氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）；然后，GSSG被NADPH依賴的GSH還原酶還原為GSH，從而進入下一個循環(huán)［25］。LOOH可以被細胞內的亞鐵離子氧化，生成高反應性的氧化脂質自由基，這些自由基可以通過鏈式反應破壞相鄰的PUFA，導致廣泛的膜損傷和細胞死亡［26］。同時，GSH可作為不穩(wěn)定LIP中游離亞鐵離子的結合配體，防止其與過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）反應而產生高細胞毒性的羥基自由基［15］。

2 缺血性腦卒中患者發(fā)生鐵死亡的機制

2.1 鐵超載促進缺血性腦卒中患者發(fā)生鐵死亡 鐵超載被認為是缺血性腦卒中患者發(fā)生鐵死亡的重要原因，因為其具有加劇線粒體氧化損傷和增加腦梗死面積的作用［27-28］。腦卒中患者發(fā)生鐵超載主要涉及兩個方面：鐵流入和鐵流出［29］。LI等［30］通過大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠模型發(fā)現(xiàn)，負責細胞鐵流出的血漿CP的喪失可能會破壞鐵的平衡，并且加重氧化損傷和增加缺血灶面積，同時損傷神經功能，這表明鐵代謝平衡失調可能導致鐵超載并引起鐵死亡。鐵流出也被發(fā)現(xiàn)與微管相關蛋白Tau的表達有關，敲除Tau基因的小鼠發(fā)生MCAO時，其癥狀比野生型小鼠更嚴重，但鐵靶向干預可以緩解小鼠的神經功能損傷，這表明Tau可能誘導鐵流出并抑制鐵超載［31］。此外，VAN LEYEN等［32］也觀察到，在缺血性腦卒中的動物模型和細胞模型中NF-κB調控的DMT1表達增加，這與神經元的鐵流入增加有關。研究證明，有兩種可能的途徑是導致缺血腦組織鐵超載的原因：其一是缺血期間IL-6表達增加，IL-6可通過上調JAK-STAT3通路來促進鐵蛋白表達，進而導致膜鐵轉運蛋白1（ferroportin 1，F(xiàn)PN1）表達下調和鐵釋放減少，從而誘導鐵超載［33］；另一種鐵超載的原因是鐵攝取的增加［34］，因為轉鐵蛋白（transferrin，TF）-TFR1信號通路是神經元攝取鐵的主要途徑，因而腦組織缺血后TFR1表達水平升高，大量的鐵離子由細胞外轉入細胞內，導致細胞內的鐵超載。

2.2 脂質代謝異常促進缺血性腦卒中患者發(fā)生鐵死亡

2.2.1 ACSL4可促進缺血性腦卒中患者發(fā)生鐵死亡 GUBERN等［35］發(fā)現(xiàn)，大腦缺血后ACSL4表達升高，并參與缺血再灌注損傷。而ACSL4的過度表達可能是由miR-347控制的，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-347表達在缺血性腦卒中患者中增加，并在轉錄后上調了ACSL4水平［28］。特殊蛋白1（specificity protein 1，Sp1）是通過與ACSL4促進子區(qū)域結合來促進ACSL4表達的重要轉錄元件［36-37］。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦卒中大鼠模型中，抑制ACSL4可以減輕鐵死亡，而羅格列酮和siRNA可以有效抑制ACSL4的活性，進而減少鐵死亡［28］。然而，該領域的相關研究仍然較少，因此未來應通過更多的研究來揭示ACSL4在缺血性腦卒中患者鐵死亡發(fā)生中的具體作用機制。

2.2.2 抑制LOX可減少缺血性腦卒中患者鐵死亡 LOX是催化PUFA并誘導鐵死亡的關鍵酶［38］。目前研究發(fā)現(xiàn)了多種LOX亞型，其中12/15-LOX是一個特殊的亞型，其能夠直接氧化含有PUFA的脂質膜，并直接攻擊線粒體［39］。JIN等［40］研究發(fā)現(xiàn)，12/15-LOX過度表達會導致腦卒中患者神經元死亡和血-腦脊液屏障被破壞，并且使用12/15-LOX抑制劑可以改善神經功能，減輕水腫。此外，KARUPPAGOUNDER等［34］研究發(fā)現(xiàn)，5-LOX可以促進脂質過氧化并誘發(fā)鐵中毒，而含有硫醇的氧化還原劑化合物〔N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）〕可以有效抑制5-LOX的功能，逆轉腦損傷并減少神經元死亡。以上研究表明，LOX特別是12/15-LOX是限制腦卒中后腦損傷的一個新的治療靶點。

2.3 System Xc-失調可促進缺血性腦卒中患者發(fā)生鐵死亡 GPX4能抑制脂質過氧化，與腦卒中患者發(fā)生鐵死亡密切相關。ALIM等［41］在缺血性腦卒中大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，硒可以通過激活轉錄因子活化蛋白2C（transcription factor activator protein 2C，TFAP2C）和Sp1促進抗氧化劑GPX4的表達，從而抑制鐵死亡和保護神經元。有研究發(fā)現(xiàn)，GPX4基因表達上調可有效改善腦卒中大鼠繼發(fā)性腦損傷程度，包括腦水腫和神經元功能障礙程度；相反，敲除GPX4基因會加重腦損傷程度［42］。GSH是細胞內唯一能阻止亞鐵離子產生劇毒羥基自由基從而抑制鐵死亡的亞鐵離子配體，而促進GSH生成有助于減輕缺血性腦卒中大鼠的神經功能損傷程度［43］。研究發(fā)現(xiàn)，依達拉奉可以抑制由各種情況引起的鐵死亡，尤其是由胱氨酸缺乏引起的GSH含量降低導致的鐵死亡，并已被臨床批準用于治療急性缺血性腦卒中［44］。System Xc-作為谷氨酸/半胱氨酸逆向轉運體，可產生GSH和GPX4，因此其對抑制鐵死亡具有積極作用。缺血性腦卒中發(fā)生時，細胞外谷氨酸水平會因谷氨酸攝取量的降低、細胞外囊泡釋放量的增加和非囊泡谷氨酸的釋放而升高，從而導致谷氨酸中毒［45-46］，進而阻止胱氨酸與谷氨酸交換，抑制GPX4的產生，最終引發(fā)鐵死亡［47］。然而，System Xc-上調將導致更多的谷氨酸釋放和對膠質細胞所產生的興奮性毒性損害事件。類似的，星形膠質細胞中的System Xc-可以通過調節(jié)IL-1β的興奮性毒性作用來加重腦缺血后的神經損傷［48］。System Xc-的功能障礙可能由其溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）（又稱xCT，發(fā)揮氨基酸轉運作用的亞基）的失活觸發(fā)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中大鼠模型中xCT上調可產生持續(xù)的谷氨酸興奮性毒性作用［49］。以上研究表明，當System Xc-的濃度達到一定閾值時，可能會加重谷氨酸興奮性毒性、增加鐵死亡，而不是抑制谷氨酸興奮性毒性、降低鐵死亡，當然，還需要更多的研究來證實System Xc-在缺血性腦卒中患者鐵死亡發(fā)生中的具體作用機制。

3 中醫(yī)藥通過干預鐵死亡治療缺血性腦卒中相關研究進展

缺血性腦卒中在中醫(yī)學中屬“中風”范疇，中醫(yī)藥在缺血性腦卒中的臨床治療中具有獨特的優(yōu)勢，其在抗氧化損傷、抑制鈣超載、調節(jié)自噬和凋亡、促進血管生成和神經再生方面發(fā)揮重要作用［50］。

3.1 電針通過干預鐵死亡治療缺血性腦卒中 電針結合了傳統(tǒng)針灸和現(xiàn)代電刺激，在臨床上得到了廣泛應用，其可以明顯改善缺血性腦卒中患者的神經功能和生活質量［51］。電針不僅能提供強大而穩(wěn)定的刺激，還可以作用于多個靶點。研究表明，電針具有抗凋亡、抑制自噬、抗炎、減輕氧化應激、促進神經干細胞增殖和分化以及神經血管重塑等作用［52-54］。LIANG等［55］發(fā)現(xiàn)，電針預處理組大鼠比對照組大鼠腦梗死體積?。籛estern blotting分析結果顯示，再灌注后電針預處理組鐵代謝相關蛋白FPN-1表達水平高于對照組；電針預處理組大鼠腦組織中GSH、GPX4表達水平高于對照組，而ROS表達水平低于對照組。以上研究提示電針可以通過調節(jié)氧化應激和鐵代謝相關蛋白來抑制鐵死亡，從而達到改善缺血性腦卒中患者神經功能的目的。

3.2 中藥提取物通過干預鐵死亡治療缺血性腦卒中 紅花黃色素（saffower yellower，SY）是一種從紅花中提取的黃酮類化合物，GUO等［56］采用SY治療MCAO模型大鼠2周后發(fā)現(xiàn)，SY可降低大鼠神經功能缺損評分，減少腦含水量和縮小梗死面積，指出SY可抑制亞鐵離子和ROS的積累，降低腦內ACSL4、TFR1、GPX4、鐵蛋白重鏈1（ferritin heavy chain 1，F(xiàn)TH1）表達水平，升高血清GSH、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛水平。說明SY治療缺血性腦卒中可能與其能減輕炎癥和抑制鐵死亡有關。香芹酚是一種從牛至中提取出來的萜烯類物質，GUAN等［57］發(fā)現(xiàn)其可以通過上調GPX4表達水平來抑制鐵死亡，從而保護沙鼠海馬神經元免受腦缺血再灌注（ischemia/reperfusion，IR）損傷，在此過程中，沙鼠腦組織中的脂質過氧化水平降低，學習記憶能力提高。地黃苷A是一種從地黃中提取出來的物質，其對脊髓損傷、血管性癡呆等患者具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的神經保護作用［58］。有研究者對MCAO合并認知障礙模型大鼠以80 mg/kg的劑量腹腔注射地黃苷A，并用生地黃甙A處理24 h后發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，地黃苷A組大鼠認知障礙和神經功能缺損情況明顯減輕，腦梗死體積減小，細胞活力增加，H2O2所誘導的氧化毒性降低，說明地黃苷A的作用機制可能與抑制鐵死亡和激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/核因子E2相關因子2（nuclear facter erythroid 2-related facter 2，Nrf2）信號通路和SLC7A11/GPX4信號通路有關［59］。此外，從高良姜中分離出來的黃酮類化合物高良姜素，可通過激活沙鼠體內的SLC7A11和GPX4抑制鐵中毒，從而減輕腦IR損傷［60］。

3.3 中藥復方通過干預鐵死亡治療缺血性腦卒中 腦泰方為目前治療缺血性腦卒中的有效中藥復方，其能夠明顯減輕MACO模型大鼠神經元損傷，并可促進大鼠神經功能的恢復［61］。饒政清等［62］使用腦泰方治療MCAO模型大鼠發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗組大鼠腦梗死體積縮小，神經功能評分降低，腦缺血區(qū)尼氏體增多，細胞損傷程度降低，含鐵聚集顆粒細胞的數目減少，腦鐵、丙二醛及活性氧含量降低，提示腦泰方可以通過抑制TFR1/DMT1信號通路和激活SCL7A11/GPX4信號通路而減少神經元對鐵的吸收，從而改善大鼠的神經功能。補陽還五湯具有擴張血管、增加腦血流量、消炎、抗氧化、改善微循環(huán)以及抗血栓等作用，其可通過增加血管內皮生長因子、抑制神經元凋亡、抗感染、減少基質金屬蛋白酶等多種途徑來防治缺血性腦卒中［63-64］。趙馮巖等［65］通過網絡藥理學推測出補陽還五湯經鐵死亡途徑調控缺血性腦卒中可能與MAPK、PI3K-Akt等信號通路有關。目前中藥復方對缺血性腦卒中患者鐵死亡作用的研究仍較少，需要進一步研究證實。

4 小結及展望

鐵死亡與缺血性腦卒中密切相關，抑制鐵死亡能明顯減輕缺血性腦卒中患者的神經損傷程度，提示鐵死亡介導了缺血性腦卒中的神經損傷，并且可作為缺血性腦卒中的潛在干預靶點。然而鐵死亡發(fā)生的確切機制仍不清楚。中醫(yī)藥具有多靶點的優(yōu)勢，在治療“中風”方面有著悠久的歷史，且在患者神經功能的康復中具有重要作用。雖然中醫(yī)藥通過干預與鐵死亡相關的通路治療缺血性腦卒中的研究有限，但從目前的研究中可以發(fā)現(xiàn)，電針、中藥提取物、中藥復方等可通過干預鐵死亡治療缺血性腦卒中，這有助于腦卒中治療方法的發(fā)展。未來還需要開展更多的研究，繼續(xù)深入挖掘中醫(yī)適宜技術中的關鍵靶點環(huán)節(jié)，為中醫(yī)藥治療腦卒中提供新思路和新策略。

作者貢獻：劉長興進行文章的構思與設計，撰寫論文；郭心怡進行文獻/資料整理；郭心怡、張雷雷進行論文修訂；常翔進行文章的可行性分析，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。