TANK結(jié)合激酶1在肺動脈高壓中的作用機(jī)制

劉美洋，孫佳偉，崔志峰，宮小薇，袁雅冬

研究表明，肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）可能影響全球約1%的人口，在65歲以上人群中，PH的患病率已達(dá)10%［1］。PH是一種由肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、肺動脈平滑肌細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞凋亡異常等引起的復(fù)雜疾病，其特征是肺血管阻力增加、血管重塑、血管阻塞，最終導(dǎo)致右心衰竭和死亡［2］。在PH的病理生理過程中，巨噬細(xì)胞中損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）相關(guān)先天免疫［3］、巨噬細(xì)胞代謝以及肺血管系統(tǒng)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）重塑［4］均發(fā)揮重要作用。隨著研究的逐步深入，TANK結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）逐漸被大家關(guān)注，其是先天免疫的關(guān)鍵酶，同時可參與細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)，亦可參與ECM重塑。因此，本文立足于TBK1，綜述TBK1的結(jié)構(gòu)與活化機(jī)制、巨噬細(xì)胞與PH的關(guān)系及TBK1在PH患者巨噬細(xì)胞DAMP相關(guān)先天免疫、巨噬細(xì)胞代謝、肺血管系統(tǒng)ECM重塑中的作用，旨在進(jìn)一步闡述PH的病理機(jī)制，為其治療提供新的方向與靶點(diǎn)。

1 TBK1的結(jié)構(gòu)與活化機(jī)制

1.1 TBK1的結(jié)構(gòu) TBK1也稱為NF-κB激活蛋白（NF-κB- activating kinase，NAK）或T2K，屬于IκB激酶（IκB kinase，IKK）家族。TBK1最初被確定為介導(dǎo)TANK激活NF-κB能力的激酶［5］。TBK1是由729個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，包含4個主要結(jié)構(gòu)域，分別為激酶結(jié)構(gòu)域、泛素樣結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-like domain，ULD）、C末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（coiled-coil-domain，CCD）（包括CCD1和CCD2）［6］。其中，CCD1和CCD2構(gòu)成一個α螺旋支架二聚化結(jié)構(gòu)域（α-helical scaffold dimerization domain，SDD）［7］。與經(jīng)典IKK（IKKα、IKKβ）相比，CCD1和CCD2共享一個ULD，這是最佳激酶活性所必需的，但TBK1結(jié)構(gòu)上缺乏C-末端NF-κB必需調(diào)節(jié)劑（NF-κB essential modulator，NEMO）結(jié)合結(jié)構(gòu)域［8］，因此也就失去了與結(jié)構(gòu)蛋白NEMO結(jié)合的可能，NEMO雖然沒有催化活性，但卻是經(jīng)典NF-κB活化途徑中的必需結(jié)構(gòu)蛋白［9］。NEMO是NF-κB介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其通過傳輸細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)信號，控制NF-κB［10］。TBK1信號通路的活化則依賴于其他接頭蛋白的參與［11］，如TRAF家族成員相關(guān)的NF-κB激動子、NAK相關(guān)蛋白1（NAK-associated protrin 1，NAP1）和視神經(jīng)蛋白［12］。這些接頭蛋白的結(jié)構(gòu)及作用模式均類似于NEMO［13］，均與TBK1直接相互作用，形成蛋白酶復(fù)合物，進(jìn)而激活下游蛋白因子。

1.2 TBK1的活化機(jī)制 TBK1的活化是由多種方式調(diào)節(jié)的，如磷酸化、泛素化、激酶活性和防止功能性TBK1復(fù)合物的形成［14］等。

1.2.1 磷酸化 TBK1未被激活時以二聚體形式存在，當(dāng)接收到活化信號時，TBK1發(fā)生折疊并開始成簇聚集，使得分子間相互接觸而激活激酶活性區(qū)，導(dǎo)致第172位絲氨酸發(fā)生自磷酸化。磷酸化的TBK1會通過類似正反饋調(diào)節(jié)的方式，進(jìn)一步激活更多的TBK1，以達(dá)到級聯(lián)放大的活化效果［15］。TBK1自磷酸化過程受多種激酶及磷酸酶的調(diào)控，最早發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵激酶是糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β），其可與TBK1結(jié)合而輔助TBK1的自磷酸化［16］。Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitory protein，RKIP）則是TBK1激酶的底物，TBK1磷酸化RKIP后，可進(jìn)一步促進(jìn)TBK1自磷酸化［17］。同時，第179位酪氨酸的磷酸化對TBK1的激活有促進(jìn)作用，此過程由酪氨酸激酶Src進(jìn)行催化［18］。然而，終止TBK1磷酸化則是由多種磷酸酶進(jìn)行調(diào)控的，且去除S172上的磷酸集團(tuán)后TBK1可恢復(fù)未激活狀態(tài)。其中蛋白磷酸酶4［19］、蛋白磷酸酶1B（protein phosphatase 1B，PPM1B）［20］以及細(xì)胞分裂周期25A（cell division cycle 25A，CDC25A）［21］均參與終止TBK1磷酸化的過程。此外，還可通過其他途徑間接地終止TBK1磷酸化，如Src蛋白激酶家族成員Lck、Hck及Fgr［22］、糖皮質(zhì)激素［23］等。

1.2.2 泛素化 除磷酸化/去磷酸化外，泛素化/去泛素化是調(diào)節(jié)TBK1活化的另一種重要方式。E3泛素連接酶可介導(dǎo)TBK1上的K63連接的多泛素化并促進(jìn)其活化［24］。E3泛素連接酶中的MIB1、MIB2和Nrdp1通過促進(jìn)K63連接的多泛素化激活TBK1［25］。研究表明，同時存在的幾種去泛素化酶可以通過破壞K63連接的多泛素化來終止TBK1的激活，如腫瘤抑制基因CYLD可去除K63連接的多泛素鏈［26］，A20調(diào)節(jié)復(fù)合物可拮抗K63-TBK1的連鎖多泛素化，該復(fù)合物包括泛素編輯酶A20（也稱為TNFAIP3）、Tax1結(jié)合蛋白1（Tax1 binding protein 1，TAX1BP1）和A20結(jié)合的NF-κB抑制物1（A20-binding inhibitor of NF-κB 1，ABIN1）［27-28］。

1.2.3 激酶活性 TBK1為先天免疫中的關(guān)鍵激酶，可以通過調(diào)節(jié)TBK1激酶的活性來調(diào)節(jié)其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。含有Src同源結(jié)構(gòu)域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2（Src homology 2 domaincontaining protein tyrosine phosphatase 2，SHP-2）可以不依賴磷酸酶活性來抑制TBK1活性，TBK1激酶的結(jié)構(gòu)域可以直接與SHP-2上的C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而抑制其活性及干擾素（interferon，IFN）-β的產(chǎn)生［29］。MCCOY等［23］發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素地塞米松不僅可抑制TBK1磷酸化，還可以通過抑制其激酶活性來影響其活性。

1.2.4 防止功能性TBK1復(fù)合物的形成 功能性TBK1復(fù)合物包括含TBK1、IKKε、TRAF3、干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）3和其他接頭分子〔TRIF、線粒體抗病毒信號蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）或干擾素基因刺激蛋白（stimulator of interferon gene，STING）〕的復(fù)合物，其形成對TBK1的活化至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，MIP-T3可與TRAF3蛋白特異性相互作用，這可能會阻礙功能性TRAF3-TBK1復(fù)合物的形成，從而終止IFN-β的激活［30］。SIKE（IKKε抑制因子）可隔離IKKε/TBK1，其可作為IKKε/TBK1的生理抑制因子［31］。研究發(fā)現(xiàn)，AVSSTING-TBK1復(fù)合物可通過空間位阻的方式特異性破壞干擾素刺激基因56（IFN-stimulated gene 56，ISG56），進(jìn)而影響免疫反應(yīng)［32］。

2 巨噬細(xì)胞與PH的關(guān)系

PH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受多種因素影響。炎癥是PH的標(biāo)志之一，與其發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。PH不僅可作為各種全身炎癥狀態(tài)的并發(fā)癥，如紅斑狼瘡、硬皮病、混合性結(jié)締組織病、橋本甲狀腺炎、Castleman病、POEMS綜合征、HIV感染和自身免疫性疾?。?3］。同時，研究發(fā)現(xiàn)，PH患者肺血管病變內(nèi)可觀察到大量巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而引發(fā)肺血管重構(gòu)，這提示免疫炎癥反應(yīng)參與PH的發(fā)生發(fā)展［34］。研究表明，巨噬細(xì)胞是PH病變血管周圍最主要的炎癥細(xì)胞［35］。巨噬細(xì)胞具有高度可塑性，其在炎癥不同階段針對外界信號作出不同反應(yīng)，并可分化為不同表型，根據(jù)其表型和分泌的細(xì)胞因子可將其分為經(jīng)典激活的M1型巨噬細(xì)胞和替代激活的M2型巨噬細(xì)胞兩種亞型，一定條件下二者可相互轉(zhuǎn)化［36］。巨噬細(xì)胞M1型/M2型極化失衡可誘發(fā)并促進(jìn)如PH、動脈粥樣硬化等多種疾病的進(jìn)展［37］。其中M1型巨噬細(xì)胞可分泌多種促炎因子，如IL-6、IL-12、IL-18、IL-23和TNF-α，并上調(diào)CD86、CD80、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、趨化因子（C-X-C基序）配體〔chemokine（C-X-C motif）ligand，CXCL〕9、CXCL10等的表達(dá)，防御細(xì)胞內(nèi)病原體的感染，同時也會抑制組織周圍的細(xì)胞增殖，導(dǎo)致組織損傷；M2型巨噬細(xì)胞可分泌抗炎因子如IL-10、IL-1受體拮抗劑，并上調(diào)精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）、CD206和CD163的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、傷口愈合及組織修復(fù)，在炎癥后期起重要作用［38］。

3 TBK1在PH患者巨噬細(xì)胞DAMP相關(guān)先天免疫中的作用

近年來研究發(fā)現(xiàn)，消除PH中的關(guān)鍵免疫過程可能逆轉(zhuǎn)血管重塑，進(jìn)而緩解PH［39］。先天免疫系統(tǒng)是人體抵抗感染的第一道防線，該系統(tǒng)可以通過病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）途徑來識別病原體。同時，MATZINGER［40］發(fā)現(xiàn)，人體正在使用的與PAMP類似的系統(tǒng)在沒有感染的情況下，可發(fā)出組織損傷的信號，并將其命名為DAMP。研究發(fā)現(xiàn)，PH患者巨噬細(xì)胞中可發(fā)生DAMP激活以促進(jìn)肺血管重塑［3］。與PAMP類似，DAMP可被模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別并能夠在巨噬細(xì)胞中引發(fā)免疫反應(yīng)［41］。PRR主要包括Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ）樣受體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）樣受體和C型凝集素受體［42-43］，這4類受體可以識別脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、病毒RNA、雙鏈DNA（doublestranded DNA，dsDNA）等物質(zhì)并向下游通路傳導(dǎo)信號，進(jìn)而激活免疫系統(tǒng)并引發(fā)炎癥反應(yīng)［44］。MELOCHE等［45］發(fā)現(xiàn)，DNA損傷對PH的發(fā)展很重要。有研究者在PH動物模型肺和重塑的動脈中均發(fā)現(xiàn)了高水平的DNA損傷［46］。在PH患者中，越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激和炎癥通過促進(jìn)血管過度收縮和細(xì)胞增殖來促進(jìn)血管重塑［47-48］，得到公認(rèn)的是這些因素也可導(dǎo)致DNA損傷［49］。

在先天免疫中，環(huán)-磷酸鳥苷-磷酸腺苷合酶（cyclic-GMP-AMP synthas，cGAS）發(fā)揮著重要作用［50-51］，其是一種細(xì)胞DNA感受器，主要識別dsDNA并激活先天免疫應(yīng)答［52］。其中TBK1是cGAS信號通路中的關(guān)鍵蛋白，且cGAS-STINGTBK1軸被認(rèn)為是先天免疫的主要信號通路，與多種疾病密切相關(guān)［50-51］。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時，dsDNA可釋放至細(xì)胞質(zhì)［53］，并與cGAS結(jié)合，形成一個2∶2的二聚體結(jié)構(gòu)［54-55］，從而引發(fā)活性位點(diǎn)的改變；激活狀態(tài)的cGAS可將ATP和三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）合成環(huán)鳥苷酸-腺苷酸（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP），而cGAMP可以作為第二信使直接激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STING；隨后，激活的STING從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體中間室和高爾基體［56］，其中高爾基體上激活的STING可招募并激活TBK1，而TBK1又可招募并磷酸化下游IRF3［57］；STING同時可以激活I(lǐng)KK，并磷酸化NF-κB的抑制劑IκB家族；磷酸化的IκB蛋白被泛素-蛋白酶體途徑降解［58］，此時NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，并與干擾素調(diào)節(jié)劑IRF3協(xié)同作用，誘導(dǎo)M1型相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，從而引起炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在低氧相關(guān)PH小鼠病程早期肺泡灌洗液中，M1型相關(guān)炎癥因子水平升高［59］，且IL-6水平隨PH嚴(yán)重程度的加重而升高［60］。因此，在巨噬細(xì)胞中，TBK1參與的先天免疫可促進(jìn)PH的病理變化。

4 TBK1在PH患者巨噬細(xì)胞代謝中的作用

細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)需要通過合成代謝過程將營養(yǎng)物質(zhì)（如葡萄糖和氨基酸）和能量（ATP）協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化為大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)），并將這些大分子物質(zhì)再循環(huán)回其營養(yǎng)成分，從而進(jìn)一步分解代謝，產(chǎn)生能量。隨著營養(yǎng)物質(zhì)的不斷輸入，這種營養(yǎng)物質(zhì)和大分子物質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化理論上可以自我維持。然而，細(xì)胞和有機(jī)體擁有不同的系統(tǒng)來感知營養(yǎng)和能量的波動，從而使其代謝狀態(tài)適應(yīng)營養(yǎng)供應(yīng)或消耗［61］。巨噬細(xì)胞的極化方向與能量代謝方式密切相關(guān)，而PH患者巨噬細(xì)胞代謝變化主要包括糖酵解、脂肪酸氧化等。

4.1 糖酵解 Warburg效應(yīng)最初是在癌癥中定義的，指在正常氧濃度條件下葡萄糖最終產(chǎn)生乳酸［62］。COTTRILL等［63］發(fā)現(xiàn)，在許多情況下，Warburg效應(yīng)是PH的主要致病機(jī)制。1970年，HARD［62］首次發(fā)現(xiàn)活化的巨噬細(xì)胞中糖酵解水平上升，同時氧化磷酸化及ATP水平明顯降低，表現(xiàn)出類似腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，M1型巨噬細(xì)胞主要以有氧糖酵解及戊糖磷酸途徑來提供能量，M2型巨噬細(xì)胞主要以氧化磷酸化及脂肪酸氧化來提供能量［36］。mTORC1是一種營養(yǎng)感應(yīng)蛋白激酶，是細(xì)胞代謝的主要調(diào)節(jié)劑，其被激活時可促進(jìn)生物合成過程，其還可誘導(dǎo)糖酵解和谷氨酰胺分解過程以進(jìn)一步支持合成代謝功能。DüVEL等［64］發(fā)現(xiàn)，mTORC1可以刺激糖酵解途徑，這是通過激活影響缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding proteins，SREBP）1和SREBP2的代謝基因靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄程序來實(shí)現(xiàn)的。BODUR等［65］在細(xì)胞實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，TBK1可以與mTOR上特異性位點(diǎn)（在S2159上）結(jié)合并激活mTORC1，首次證明了TBK1可直接激活mTORC1?？傊?，TBK1可能通過mTORC1來影響糖酵解，進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞極化，參與PH的形成。

4.2 脂肪酸氧化 脂質(zhì)是巨噬細(xì)胞極化過程中的關(guān)鍵代謝物。M1型巨噬細(xì)胞合成脂肪酸并將其用作合成炎癥遞質(zhì)的前體，同時從有氧糖酵解中獲得大部分ATP，而M2型巨噬細(xì)胞具有由脂肪酸氧化驅(qū)動的功能性線粒體呼吸鏈。脂肪酸代謝包括多個步驟，如細(xì)胞脂肪酸攝取和儲存、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體、線粒體脂肪酸β-氧化和脂肪酸合成等。研究顯示，PH患者的心臟和肺臟中存在脂肪酸代謝失衡［66-67］。2018年的一項研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食小鼠的正常脂肪細(xì)胞中，TBK1的表達(dá)和活化水平增加，而特異性敲除脂肪細(xì)胞中TBK1后小鼠對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖具有抵抗性［68］?？傊?，TBK1對PH患者巨噬細(xì)胞中的脂肪酸氧化可能有一定影響，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

5 TBK1在PH患者肺血管系統(tǒng)ECM重塑中的作用

越來越多的證據(jù)表明，肺動脈ECM重塑導(dǎo)致的肺動脈順應(yīng)性降低在PH發(fā)病中起關(guān)鍵作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，PH大鼠表現(xiàn)出典型的NF-κB活性增加，同時伴有右心室肥厚和右心功能障礙，而給予非選擇性NF-κB抑制劑可以改善這種狀況［69］。這可能與ECM重塑有關(guān)，PH患者的ECM重塑可歸因于內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（endothelial-mesenchymal transition，EndoMT），其中內(nèi)皮細(xì)胞可獲得間充質(zhì)表型，其基因譜表達(dá)增加，類似于平滑肌細(xì)胞［70］。通常與PH發(fā)病機(jī)制有關(guān)的各種因素會引發(fā)EndoMT，如慢性缺氧導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活化轉(zhuǎn)錄因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）、NF-κB、IRF1和β-catenin表達(dá)增加，這些轉(zhuǎn)錄因子通過與HIF和TGF-β信號傳導(dǎo)相互作用來引發(fā)EndoMT［70-71］。同時研究發(fā)現(xiàn)，在PH動物模型及內(nèi)皮細(xì)胞模型中，NF-κB家族成員（如NF-κB1、NF-κB2、P65和RelB）的DNA結(jié)合活性均增加［72］。TBK1中的CCD2可與TANK、NAP1及與NAP1類似的TBK1接頭蛋白（similar to NAP1 TBK1 adaptor，SINTBAD）相結(jié)合，進(jìn)而共同調(diào)控NF-κB信號通路的活化［73］。TBK1同時可以與NAP1直接相互作用，進(jìn)而活化NF-κB信號通路［74］。綜上，在PH患者中，TBK1可通過活化NF-κB信號通路來影響EndoMT，進(jìn)而導(dǎo)致肺血管系統(tǒng)ECM重塑。

6 小結(jié)及展望

PH存在病情進(jìn)展迅速、致死率高、預(yù)后較差的特點(diǎn)，目前被稱為心血管疾病中的“惡性腫瘤”。當(dāng)前治療藥物并不能逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的肺血管系統(tǒng)ECM重塑，只能延緩PH的病情進(jìn)展，且患者的長期預(yù)后依舊不容樂觀。TBK1參與的巨噬細(xì)胞中DAMP相關(guān)先天免疫、代謝異常及肺血管系統(tǒng)ECM重塑在PH病理過程中發(fā)揮了重要作用，抑制TBK1可有效緩解PH，進(jìn)一步明確TBK1在PH發(fā)展過程中的分子機(jī)制可為治療PH提供新的思路。

作者貢獻(xiàn)：劉美洋進(jìn)行文獻(xiàn)資料的收集和分析，撰寫、修訂論文；孫佳偉、崔志峰進(jìn)行文獻(xiàn)資料的分析、整理；宮小薇、袁雅冬進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制和審校；袁雅冬對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。