miRNAs在肝細胞癌中的作用及其機制的研究進展

徐紅艷 張守華 黃 慧 雷 俊 綜述 梅金紅 審校

小分子RNA(microRNA，miRNA)被稱為微小RNA，目前已經在自然界中的哺乳動物、植物以及線蟲等真核生物中鑒定發(fā)現(xiàn)超過千種miRNAs[1]。微小RNA作為一類長度在19～22個核苷酸大小內源性非編碼的一組遺傳基因，其作用主要是通過與下游靶基因信使脫氧核糖核酸(mRNA)堿基進行配對從而抑制轉錄或阻礙蛋白翻譯過程，并在轉錄后水平起到對靶基因表達的有效控制。相關研究資料顯示，在人類基因組中，有接近1/3為微小RNA的靶基因[2]。而在最新的研究中，提示這類遺傳因子可能通過全方位、多層次的網絡系統(tǒng)而扮演著在基因表達調控過程中的分子開關角色，并且同動植物的一系列生理學和病理學過程緊密相關，諸如胚胎發(fā)育、器官生長、細胞的增殖、分化、自噬和凋亡、免疫應答以及脂肪代謝等生命活動[3]。既往大量研究表明，miRNAs的異常表達在腫瘤的形成和進展過程中起到了十分關鍵的作用，其中諸多miRNAs在某些類型腫瘤中體現(xiàn)了表達特異性，因此為臨床腫瘤患者接受有效的靶向治療提供了機會[4]。

1 miRNAs生物學特點

1.1 結構及合成

據(jù)推測多數(shù)已鑒定的miRNAs具有發(fā)夾結構，miRNA的合成初始步驟為發(fā)生于細胞核中的多級式反應過程[5]。在細胞核中，約70個堿基大小形成發(fā)夾結構的單鏈RNA最初由核糖核酸聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下轉錄形成初級miRNA(Pri-miRNA)，其在受到酶-蛋白復合體(Drosha酶-DGCR8)的作用下，形成長度71～85個核苷酸大小的含缺陷莖環(huán)結構的前體miRNA(Pre-miRNA)。隨后該pre-miRNA在Ran/GTP及Exportin-5的輔助作用下向胞質轉移，到達胞質后的pre-miRNA由Dicer酶剪切為大約22個核苷酸長度的雙鏈miRNA，這陣雙鏈微小RNA中一條單鏈可選擇性的同RISC(RNA-induced silencing complex)發(fā)生結合，最后形成成熟的微小RNA分子，發(fā)揮調控細胞生物學功能的作用[6]。

1.2 生物學功能

從物種進化角度分析，微小RNA顯示出了高度保守性，這意味著miRNAs在細胞的各項功能活動中起到了十分重要的調控作用。miRNA同RISC的結合過程，可通過與下游靶基因發(fā)生互補或非完全互補方式的識別和結合，通過RNA干擾途徑導致基因表達沉默，或引起靶基因mRNA直接發(fā)生裂解或阻抑蛋白的翻譯過程，由轉錄后水平調節(jié)基因的表達[7]?；虮磉_受到miRNA所節(jié)制，多個基因可受到某一種miRNA的調控作用，而同一個靶基因的表達可受到多個miRNA的組合調控而實現(xiàn)精密調控[8]。盡管目前已經認識鑒定了人類超過幾百個miRNA基因，隨著近年來計算機信息技術的發(fā)展，經過精密的推算，在人類基因組中有超過1000個微小RNA，其中有某一個微小RNA能夠調節(jié)超過200個下游靶基因，并且有接近30%的蛋白編碼基因的表達受到miRNA所調節(jié)。這些研究均顯示出這類遺傳因子在基因表達調節(jié)領域所扮演的關鍵角色。國際上大量科學實驗證實[9]，miRNAs往往存在于這些生物細胞染色體的相關脆性位點或出現(xiàn)雜合子缺失，并參與到調控組織細胞的各項生物學活動中，包括細胞的增殖、分化及凋亡活動，并且被證實同人類惡性腫瘤、糖尿病、關節(jié)炎以及紅斑狼瘡等疾病的發(fā)生和發(fā)展緊密相關，但是miRNA在這些疾病中所發(fā)揮的作用及具體分子機制仍不明確。

1.3 失調分子機制

既往miRNA與腫瘤性疾病發(fā)生發(fā)展的相關性研究能夠清晰闡明miRNAs表達失調相關分子機制，對人類認識腫瘤的起病和發(fā)展的具體過程、提升腫瘤的診斷水平以及找到更加高效的治療靶點等有重要的意義。研究證據(jù)表明[10]，微小RNA表達失調的因素多種多樣，歸納其主要原因包括：基因轉位、DNA甲基化、基因擴增、癌性轉錄因子活化、低氧狀態(tài)、miRNA點突變或基因多態(tài)化以及致癌病毒蛋白產物等。

2 miRNAs在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機制

2.1 miRNAs與肝癌的發(fā)生

肝癌作為一種原發(fā)于人類肝臟的惡性腫瘤，其發(fā)病因素較多，最常見的因素有長期過度飲酒、病毒性肝炎、食用霉變食物以及遺傳因素等[11]。大量分子生物學研究表明，微小RNA同肝細胞癌的發(fā)病關系緊密，具體可能同多個不同癌基因、抑癌基因及其相應產物表達和結構異常改變有關，miRNA在其中不僅可扮演癌基因發(fā)揮致癌作用，還可參與到抑癌基因相關途徑發(fā)揮抗癌作用[12]。國外的相關研究分別對肝癌細胞和正常肝細胞中的189個miRNAs分子表達情況進行檢測分析，結果發(fā)現(xiàn)，相比于正常肝細胞中miR-221表達水平，肝癌組織中表達明顯增高，接近正常肝細胞的9倍[13]。值得引起注意的是，當肝細胞中miR-221表達水平增高時，可引起PTEN基因蛋白表達減少，提示miR-221的靶向目標分子可能為PTEN。而在相關研究中[14]，高水平表達的miR-221可起到對PTEN基因翻譯過程的抑制作用，該基因表達受阻可觸發(fā)一系列細胞多種生物學行為，包括增殖活動、遠端轉移以及侵襲浸潤等，由此推測miR-221可能在肝細胞癌的起病和發(fā)展過程中起到了始動效應。國外相關研究中[15]，某課題組應用致癌藥Tamoxifen對大鼠進行飼喂若干周后，誘導獲得肝癌大鼠模型，分別在12周和24周檢測荷瘤老鼠肝臟組織細胞中miRNAs表達譜，發(fā)現(xiàn)同正常對照組相比，肝癌組大鼠中有34個(21個表達增加，13個下調)miRNAs呈異常差異化表達，其中部分被視為癌基因的miRNAs均呈現(xiàn)明顯過表達[16]，包括miR-16、miR-21、miR-17-5p、miR-20b、miR-34、miR-106a以及miR-146a等。同時研究還發(fā)現(xiàn)這些miRNAs所對應的Bcl-2、Notch1、E2F1以及RB1等多個下游靶基因蛋白的表達呈顯著下調趨勢，而這些活性蛋白對細胞周期進展、細胞凋亡、染色質修飾、DNA復制及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中均有重要影響。除了上述幾種miRNAs外[17]，還檢測到包括miR-18、miR-31、miR-25、miR-15a、miR-193、miR-345、miR-193、miR-375在內的16個miRNAs表達上調，同時還檢測到包括miR-27a、miR-28、miR-361、miR-195、miR-350、miR-203以及miR-191在內的14個miRNAs表達下調，同時指出miRNA的異常差異化表達開始于腫瘤形成的初始階段，是一類在評估腫瘤形成過程的重要潛在生物學標志物，可為肝癌的預防、診斷和靶向治療提供重要依據(jù)。

2.2 miRNAs與肝細胞癌分化

國外研究學者對入院治療的28例肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)、24例HCC周邊正常組織(Normal tissue，NT)及11例慢性肝炎(Chronic hepatitis，CH)進行粗針穿刺后，通過芯片技術檢測分析其miRNAs表達譜，結果發(fā)現(xiàn)HCC組同NT組相比，一共有32個miRNAs存在明顯差異[18]。研究表明，相對于NT組檢測結果，HCC組表達呈現(xiàn)出顯著增高的miRNA共有3個：分別為miR-18、miR-224及pre-miR-18，存在顯著下調的一共有5個：分別為miR-125a、miR-192-3p、miR-165a、miR-222和miR-200a[19]。進一步研究發(fā)現(xiàn)同HCC分化程度存在一定相關性的miRNAs有3個：分別為miR-18、miR-92、pre-miR-18，這些異常因子的表達量在分化差的HCC組織中最高，在分化好的HCC組織中處于低水平[20]；而miR-92的實際表達量同癌細胞的分化程度呈現(xiàn)出顯著的正相關性。由此認為，miR-18可能在HCC的發(fā)生和分化成熟過程中發(fā)揮著重要調節(jié)作用。此外，研究人員對入院患者中16例肝硬化(Liver cirrhosis，LC)和14例CH樣本進行分析，結果一共找到14個miRNAs呈現(xiàn)出明顯的表達差異，其中LC組的miR-28、miR-143、miR-126、miR-199a以及miR-145b等8個表達明顯高于CH組；而miR-182、miR-15b以及miR-224等6個較CH組表達明顯降低。而在對入選HCC患者的病因學分析中[21]，研究組發(fā)現(xiàn)伴HBV或HCV感染的HCC組miRNAs表達譜之間并不存在統(tǒng)計學差異。國外某課題組進行的大鼠對照研究中，應用含246種不同miRNAs的芯片分別對正常大鼠肝臟和葉酸、甲基、膽堿缺乏性大鼠肝腫瘤模型的微小RNA表達情況進行檢測分析，結果在腫瘤組中一共發(fā)現(xiàn)了26種表達增加，3個表達下調。在臨床實驗中[22]，研究者應用miRNA芯片檢測42例肝細胞癌組織中的微小RNA表達情況，發(fā)現(xiàn)有6種表達超過正常組兩倍，分別為miR-23a、miR-24、miR-130、miR-130a、miR-328-1和miR-219-1；在所有腫瘤樣本中僅miR-22表達降低50%，部分miRNA在不同組織樣本中降低程度不一致，如miR-123和miR-235等。國內臨床研究報道中[23]，有學者對24例肝細胞癌組織進行測定分析，結果發(fā)現(xiàn)同癌周肝組織相比較，12例肝癌樣本中的miR-122表現(xiàn)出顯著降低趨勢，在人、大鼠及小鼠的HepG2、H4及H7等多個肝癌細胞系中均呈現(xiàn)為低表達或不表達。有證據(jù)提示[24]，miR-122是肝臟發(fā)育過程具有關鍵調節(jié)作用的“肝特異性miRNA”，對肝臟器官的發(fā)育、分化和結構功能維持有重要作用。在細胞學研究中，在大鼠母體置入受精卵后約13天則可在其體內檢測到miR-122的表達；在大量腫瘤相關實驗中同樣檢測到miR-122的異常過表達現(xiàn)象，包括肝腺瘤及肝細胞局部結節(jié)性增生等[25]。值得關注的是，一些微小RNA的表達與肝臟惡性腫瘤有關危險因素存在一定關聯(lián)，以miR-96為例，其表達變化被證實同乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染后出現(xiàn)的肝細胞癌密切相關；miR-126同酒精性肝細胞癌的發(fā)生密切相關[26]。與此同時，近年來開展的相關研究大多側重于miRNA對mRNA功能的調節(jié)方面，但微小RNA的自身表達和功能發(fā)揮同時受到其他相關因素影響的研究尚不多見。

2.3 miRNAs與肝細胞癌侵襲及轉移

miRNAs的異常差異化表達還同惡性腫瘤細胞的轉移和侵襲性有關。研究資料表明[27]，導致臨床中肝癌患者死亡的最主要原因是惡性腫瘤發(fā)生轉移和術后復發(fā)，因此相關領域研究專家致力于探索某些特定miRNAs表達水平同肝細胞癌遠端轉移和侵襲性之間的關聯(lián)。國外某研究小組[28]在收集獲得的452個HCC癌性樣本(分為侵襲性樣本和非侵襲性腫瘤組織樣本)和260個非癌性樣本(僅為非侵襲性腫瘤樣本)后，應用RNA芯片miRNA表達譜進行檢測分析，結果發(fā)現(xiàn)有20種可以作為同腫瘤轉移相關分子生物學標志物，可用于原發(fā)性HCC的預測評估，主要包括miR-1-2、miR-194、miR-9-2、miR-207、miR-34a、miR-48b等。但在與之相對應的非癌性組織樣本中并未檢測到這些miRNAs的表達。這些在癌性樣本中的腫瘤生物學標志物顯示出了與臨床中原發(fā)性肝癌患者存活時間及手術治療后復發(fā)風險的緊密相關性[29]。miRNAs的表達模式可為研究者鑒定腫瘤及其侵襲轉移性提供更為簡單的方式方法。國內某課題組的研究中[30]，研究人員應用含有145個miRNA的液相芯片和Luminex100檢測系統(tǒng)對20個HCC樣本和20個NT組織進行檢測分析，實驗結果發(fā)現(xiàn)在其miRNAs表達譜中有32個呈差異化表達，其中24個表達下調，8個表達上調；在其入選所有樣本中，表現(xiàn)為共存性異常表達的共10個，其中有2個表達上調，即miR-222和miR-224，呈下調趨勢的6個：miR-122a、miR-200a、miR-195、miR-182、miR-15b及miR-199a-3p。選擇呈過表達的miR-224及其預測靶基因結締組織生長因子(CTGF)于兩個樣本采用Wetern blot 和RT-PCR進行驗證分析[31]，結果其CTGF中的mRNA表達水平在HCC及NC組織并不存在差異性，但蛋白水平在原發(fā)性肝癌組顯著降低，推測miR-224是通過轉錄后基因沉默機制而對CTGF蛋白的表達起到了阻抑效應，最終促進了癌遠端轉移和浸潤侵襲。

3 miRNAs在肝細胞癌中的潛在治療作用

基于miRNA在腫瘤中的重要價值潛力，研究專家們長期致力于miRNA治療腫瘤疾病的研究中。目前此方面的策略主要包括兩個途徑，第一種通過干預使腫瘤中miRNA表達下調，通過轉染pre-miRNA而起到對相應miRNA表達的糾正性作用，從而達到控制腫瘤細胞異常增殖和(或)促凋亡目的。如同pre-let-7進行干預可發(fā)揮抗肺癌細胞株A549增殖作用；第二種策略是利用反義技術使過度表達的miRNA下調。在國外相關報道中[32]，研究者通過將已經修飾的反義RNA轉入至大鼠體內，結果檢測到包括肝臟在內多種器官的miR-122、miR-194及miR-16表達水平均明顯降低。近期研究表明，miR-122在肝臟發(fā)育過程中呈特異性表達。在動物實驗中[33]，采用miR-122反義寡核苷酸進行干預后，可觀察到其明顯的肝功能改變，如膽固醇的合成水平顯著降低，提示該微小RNA對于肝功能維持正常有重要意義。在肝癌細胞株MHCC97的體外培養(yǎng)實驗中，發(fā)現(xiàn)miR-122a具有調控細胞周期蛋白(Cyclin G1)表達作用，在HCC中二者表達趨勢顯示出明顯的負相關，提示Cyclin G1可能為miR-122a的作用靶點之一[34]。而Cyclin G1同人類基因組的不穩(wěn)定性緊密相關，并在人乳腺癌等多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)異常過表達。國內有關報道[35]，指出Stathmin1為miR-223下游的一個作用靶點。Stathmin為一種主要的微管不穩(wěn)定蛋白，可通過磷酸化和去磷酸化作用間接控制細胞周期作用。大量腫瘤基因學實驗表明[36]，該蛋白的在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中存在異常過表達現(xiàn)象，通過干預抑制其表達后可起到一定的抗腫瘤增殖和轉移作用。以上研究結論均提示我們，采取一定措施干預HCC發(fā)生發(fā)展相關的某些“原癌基因”或“抑癌基因”的miRNAs表達，有望為今后實現(xiàn)肝細胞癌病患接受更加有效的基因靶向治療奠定基礎。

基于近年來國內外有關miRNA參與腫瘤進展的相關研究，其作用已經得到廣泛證實，但其表達失調與腫瘤發(fā)生過程的具體機制仍然有待進一步的研究。目前的研究，已經對轉錄異常、基因突變、miRNA生物合成過程中關鍵酶缺陷、表觀遺傳型改變以及DNA拷貝異常等多種調節(jié)機制有了初步認識。在腫瘤的診斷中，目前miRNA的應用仍然存在一定局限性，如通過小樣本、單中心的檢查來獲得差異性標志物，不能通過大樣本人群進行篩選和驗證，其敏感性和特異性結果存在較大差異。目前miRNA在肝臟惡性腫瘤領域的研究尚不成熟，在治療方面仍然處于體外細胞學研究和動物實驗階段，某些miRNA類似物及antagomiRNA是否安全和有效性還有待評估驗證。將miRNA用作為肝癌診斷、治療及預后評估的標志物仍需克服諸多問題[37]。