藥品無(wú)菌檢查中污染微生物的鑒定

陳靜，夏培培(江蘇九旭藥業(yè)有限公司，江蘇 徐州 221000)

0 引言

若想確保無(wú)菌制劑藥品使用安全，其中做好藥品無(wú)菌檢查工作非常必要。這有利于保持現(xiàn)下無(wú)菌制劑藥品質(zhì)量水平，降低臨床用藥階段誘發(fā)不良反應(yīng)概率。微生物在使用的藥品中存活，不僅威脅用藥者生命安全，也會(huì)導(dǎo)致藥品生產(chǎn)企業(yè)面臨巨額經(jīng)濟(jì)損失風(fēng)險(xiǎn)。為了更好地保證藥品質(zhì)量，必須重視與加強(qiáng)藥品無(wú)菌檢查，做好微生物污染鑒定，確定污染源，為藥品質(zhì)量安全管理工作高質(zhì)量開(kāi)展提供基礎(chǔ)保障。

1 藥品無(wú)菌檢查中污染微生物鑒定必要性分析

無(wú)菌制劑用藥安全與前期藥品無(wú)菌檢查工作質(zhì)量有著十分密切關(guān)聯(lián)性，同時(shí)也直接影響著無(wú)菌制劑質(zhì)量評(píng)控水平以及臨床不良反應(yīng)情況的出現(xiàn)概率。通過(guò)對(duì)近些年來(lái)藥品無(wú)菌檢查實(shí)際情況的調(diào)研與分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)菌藥害事件發(fā)生頻率逐漸提升。但由于藥品質(zhì)量安全監(jiān)管各項(xiàng)工作精準(zhǔn)落實(shí)，使得無(wú)菌藥害事件所造成的負(fù)面影響并沒(méi)有擴(kuò)大，這其中藥品無(wú)菌檢查在此過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。無(wú)菌藥品污染主要來(lái)自三個(gè)方面，分別是物理性污染、化學(xué)性污染以及微生物污染。其中導(dǎo)致微生物污染問(wèn)題出現(xiàn)的成因較多，微生物污染是指在各種因素綜合作用影響下，使得無(wú)菌藥品中微生物含量超過(guò)國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，繼而發(fā)生微生物污染情況。微生物具有體積小、生長(zhǎng)繁殖快、種類多以及適應(yīng)強(qiáng)等特征，這在一定程度上加大了藥品無(wú)菌檢查難度，同時(shí)對(duì)此方面工作提出嚴(yán)格要求。目前國(guó)家現(xiàn)行《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》相關(guān)條例對(duì)藥品中微生物限量有著明確規(guī)定，要求通過(guò)開(kāi)展藥品無(wú)菌檢查工作，對(duì)微生物限量進(jìn)行監(jiān)管，盡可能消除對(duì)無(wú)菌制劑對(duì)用藥者生命安全的威脅。

從現(xiàn)階段我國(guó)臨床用藥情況來(lái)看，用藥頻率逐年呈上升趨勢(shì)，在一定程度上加大了藥品質(zhì)量安全監(jiān)管難度。為了充分發(fā)揮藥品無(wú)菌檢查功能作用，必須做好污染微生物鑒定工作并確認(rèn)藥品無(wú)菌檢查過(guò)程中是否會(huì)對(duì)藥品帶來(lái)污染影響。以明確微生物污染源，為進(jìn)一步優(yōu)化與完善優(yōu)化藥品無(wú)菌檢查提供有價(jià)值參考依據(jù)。

2 污染微生物鑒定實(shí)驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

污染微生物鑒定的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備流程如下：(1)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象：革蘭式陽(yáng)性球菌，數(shù)量為7株；(2)實(shí)驗(yàn)要求：分別在兩個(gè)無(wú)菌且獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下開(kāi)展污染微生物鑒定試驗(yàn)，根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)具體要求，配置相應(yīng)數(shù)量實(shí)驗(yàn)人員，要求參與實(shí)驗(yàn)的人員均要獨(dú)自完成鑒定無(wú)菌藥品的實(shí)驗(yàn)任務(wù)；(3)基于國(guó)家現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)產(chǎn)地、批次均不同的藥物進(jìn)行無(wú)菌檢查；改良馬丁培養(yǎng)基與硫乙醇酸鹽為培養(yǎng)基樣品，且存在處于生長(zhǎng)狀態(tài)的微生物，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為24 h，環(huán)境溫度設(shè)置為35 ℃，本次實(shí)驗(yàn)期間細(xì)菌總計(jì)收集7株；(4)將7株細(xì)菌微生物作為本次污染微生物鑒定實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，通過(guò)一系列鑒定與分析，確定微生物污染源。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

本次鑒定細(xì)菌微生物過(guò)程中，選擇細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒輔助實(shí)驗(yàn)人員提取微生物基因組DNA，在提前準(zhǔn)備好的TE緩沖液中存放所提取的細(xì)菌DNA。為滿足藥品無(wú)菌檢查中污染物微生物鑒定要求，將選擇三種鑒定方法，分別是全自動(dòng)微生物生化鑒定、16SrRNA基因測(cè)序鑒定方法以及RiboPrinter儀器鑒定，這三種鑒定方法主要負(fù)責(zé)細(xì)菌鑒定，其中Ribo Printer儀器分型法、16SrRNA基因同源分型法以及DiversiLab儀器分型法用于分析各菌株同源性[1]。另外，為了保證本次鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，要求參與鑒定實(shí)驗(yàn)的人員均要具備較高專業(yè)水平和豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，確保細(xì)菌鑒定與分型實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范性、標(biāo)準(zhǔn)性，從而將微生物污染源如實(shí)反映。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 細(xì)菌鑒定結(jié)果

本次鑒定實(shí)驗(yàn)共選擇7株細(xì)菌，其中全自動(dòng)微生物化鑒定、16SrRNA基因測(cè)序鑒定方法以及RiboPrinter儀器鑒定三種方法所顯示的6株細(xì)菌鑒定結(jié)果信息一致，表皮葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的細(xì)菌。經(jīng)過(guò)一系列鑒定操作，樣品鑒定結(jié)果呈陽(yáng)性，分別是表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌(呈奶白色狀)、溶血葡萄球菌。

2.3.2 細(xì)菌同源性鑒定結(jié)果

鑒定與分析細(xì)菌同源性的過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員采用了多種鑒定法。采用Ribo Printer儀器對(duì)細(xì)菌分型后，發(fā)現(xiàn)溶血葡萄球菌分型無(wú)明顯變化特征，沃氏葡萄球菌與表皮葡萄球菌分別存在2種和3種結(jié)果。

采用16SrRNA基因同源分型，發(fā)現(xiàn)在基因水平方面，溶血葡萄球菌和沃氏葡萄球菌二者之間差異性變化較小，表皮葡萄球菌結(jié)果存在2種。通過(guò)對(duì)比此鑒定方法下細(xì)菌同源性結(jié)果，基于參照的16SrRNA基因序列，發(fā)現(xiàn)結(jié)果信息顯示僅存在基因突變1個(gè)。

采用DiversiLab儀器分型，溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌分別存在2組、3組、2組。通過(guò)分析葡萄球菌污染源，各實(shí)驗(yàn)樣品中并未出現(xiàn)細(xì)菌交叉污染情況，但其中一項(xiàng)樣品被沃氏葡萄球菌污染的幾率較高；因此環(huán)境因素并不是表皮葡萄球菌污染源，與自身因素有著十分密切的關(guān)聯(lián)性。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

從藥品質(zhì)量安全監(jiān)管角度上分析，藥品無(wú)菌檢查工作有效性開(kāi)展，不僅有利于促進(jìn)藥品質(zhì)量提升，在一定程度上也能起到減少臨床用藥階段誘發(fā)不良反應(yīng)情況出現(xiàn)，是實(shí)現(xiàn)藥品質(zhì)量安全監(jiān)管落實(shí)的必要途徑。通過(guò)對(duì)目前藥品無(wú)菌檢查情況調(diào)研與分析發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有污染微生物鑒定方法較為多樣，如全自動(dòng)微生物生化鑒定方法、16SrRNA基因測(cè)序鑒定方法等。其中生化鑒定法是現(xiàn)階段污染微生物鑒定過(guò)程中使用頻率較高的方法，但環(huán)境因素對(duì)此鑒定方法的使用效果有著較大影響，故該方法不適用于在過(guò)于復(fù)雜的環(huán)境中進(jìn)行污染微生物鑒定[2]。

基于此，本次藥品無(wú)菌檢查中選擇多種鑒定方法輔助實(shí)驗(yàn)開(kāi)展。從整體上看，每項(xiàng)鑒定方法均獲得了較為精準(zhǔn)的結(jié)果，雖然各鑒定方法在操作方面各不相同，但其結(jié)果信息顯示均無(wú)明顯差異。通過(guò)對(duì)照上述幾種鑒定方法所顯示的結(jié)果信息，發(fā)現(xiàn)6SrRNA基因測(cè)序鑒定方法在分析菌株層面方面存在明顯劣勢(shì)，難以保證菌株層面分辨率。因RiboPrinter儀器由高精密度構(gòu)件組成，在較高自動(dòng)化水平支持下，使得鑒定結(jié)果相較于其他鑒定方法所提供的鑒定結(jié)果其結(jié)果準(zhǔn)確性、可靠性明顯高于后者。從藥品無(wú)菌檢查中微生物污染源追溯鑒定情況來(lái)看，溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌均為諸多污染源中較為常見(jiàn)的幾種類型。就本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：污染樣品的來(lái)源為溶血葡萄球菌，通過(guò)觀察各實(shí)驗(yàn)樣品，并未出現(xiàn)樣品間交叉污染情況；來(lái)源不同的沃氏葡萄球菌會(huì)對(duì)污染期間的樣品帶來(lái)一定程度上感染影響；上述提及表皮葡萄球菌來(lái)自所在環(huán)境，但環(huán)境因素并未對(duì)樣品造成污染。為了進(jìn)一步驗(yàn)證藥品檢查中污染微生物鑒定結(jié)果是否與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作不規(guī)范相關(guān)，將采用OOS(超標(biāo)結(jié)果)調(diào)查方法進(jìn)行驗(yàn)證，檢查藥品整個(gè)無(wú)菌檢查流程。

基于國(guó)家現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)與GMP要求，具體要求如下：(1)實(shí)驗(yàn)期間，所有參與實(shí)驗(yàn)鑒定的人員均具備相應(yīng)專業(yè)資質(zhì)，對(duì)藥品無(wú)菌檢驗(yàn)流程熟悉程度較高，各實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)均嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行操作；(2)實(shí)驗(yàn)全過(guò)程所涉及到的儀器設(shè)備各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置均未出現(xiàn)誤差，并無(wú)故障問(wèn)題，符合污染微生物鑒定實(shí)驗(yàn)要求標(biāo)準(zhǔn)；(3)實(shí)驗(yàn)期間所涉及到樣品、培養(yǎng)基、沖洗液等，在實(shí)驗(yàn)前期均做好相應(yīng)消毒殺菌工序，與無(wú)菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果信息顯示一致；(4)針對(duì)環(huán)境中微生物檢測(cè)，僅收集到表皮葡萄球菌，其他相關(guān)環(huán)境微生物并未發(fā)現(xiàn)[3]。從OOS調(diào)查結(jié)果來(lái)看，藥品無(wú)菌檢查中來(lái)自實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)期間污染的可能性最低。并加上多種鑒定方法反復(fù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，可以確定藥品無(wú)菌檢查中微生物污染和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境因素不相關(guān)，其中樣品運(yùn)輸或樣品加工環(huán)節(jié)受到污染的概率較高。因此，后期藥品無(wú)菌檢查過(guò)程中，相關(guān)人員應(yīng)多關(guān)注藥品加工及運(yùn)輸環(huán)節(jié)，提升對(duì)微生物污染控制重視程度，積極應(yīng)用最新技術(shù)手段，為藥品無(wú)菌檢查工作高效率開(kāi)展提供強(qiáng)力技術(shù)支持，從根本上保障藥品質(zhì)量安全。

3 加強(qiáng)藥品無(wú)菌檢查中微生物污染控制的有效建議

上述提及到藥品無(wú)菌檢查中微生物污染與實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不相關(guān)，但藥品加工及運(yùn)輸環(huán)節(jié)導(dǎo)致微生物污染問(wèn)題發(fā)生的概率較高?；诖?，下面將著重闡述對(duì)這兩方面加強(qiáng)監(jiān)管的措施，減少微生物污染情況出現(xiàn)。

3.1 人員方面

據(jù)數(shù)據(jù)顯示，由于人員操作方面因素導(dǎo)致無(wú)菌藥品中微生物含量超標(biāo)的概率最高，高達(dá)70%左右。為了進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)人員操作方面管控，應(yīng)根據(jù)國(guó)家現(xiàn)行規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，明確制定無(wú)菌操作流程，并要求進(jìn)入操作室的任何人員均要進(jìn)行全面消毒，并對(duì)無(wú)菌操作區(qū)內(nèi)的人員數(shù)量加以控制，一方面減少無(wú)菌操作區(qū)運(yùn)動(dòng)頻率，規(guī)范人員操作行為，防止污染源出現(xiàn)；另一方面針對(duì)非加工人員進(jìn)入無(wú)菌操作區(qū)，如：參觀人員、設(shè)備維修人員以及質(zhì)檢人員等，均要在專業(yè)人員監(jiān)督與指導(dǎo)下進(jìn)入無(wú)菌操作區(qū)，待做好消毒程序后，方可進(jìn)入無(wú)菌操作區(qū)，降低此方面出現(xiàn)微生物污染可能性。除此之外，無(wú)菌操作是降低微生物污染概率的必要途徑，若藥品生產(chǎn)人員無(wú)菌操作意識(shí)薄弱、無(wú)菌操作不規(guī)范以及個(gè)人消毒不徹底等均會(huì)導(dǎo)致微生物污染情況出現(xiàn)。因此，必須提升藥品生產(chǎn)人員無(wú)菌操作規(guī)范性，增強(qiáng)無(wú)菌操作意識(shí)，在生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)嚴(yán)格按照規(guī)范流程進(jìn)行無(wú)菌操作，進(jìn)出無(wú)菌操作區(qū)均要消毒，切忌大幅度運(yùn)動(dòng)，防止人員運(yùn)動(dòng)帶來(lái)大量灰塵而導(dǎo)致微生物增多的情況出現(xiàn)。

3.2 設(shè)施方面

為符合國(guó)家藥品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)菌藥品生產(chǎn)前提，需要保證藥品生產(chǎn)環(huán)境無(wú)菌。針對(duì)無(wú)菌環(huán)境設(shè)計(jì)，需要注意以下幾點(diǎn)內(nèi)容：

第一，嚴(yán)格區(qū)分無(wú)菌和有菌區(qū)域，藥品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)所涉及到滅菌設(shè)備均要按照規(guī)定要求并在指定區(qū)域內(nèi)存放和運(yùn)輸?？s短藥品生產(chǎn)運(yùn)輸路線，盡可能減少微生物出現(xiàn)。

第二，做好無(wú)菌環(huán)境消毒工作?；趪?guó)家現(xiàn)行規(guī)定最新標(biāo)準(zhǔn)，選擇符合規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的滅菌工藝，如甲醛熏蒸、乳酸熏蒸等，為了更好地保證藥品生產(chǎn)加工環(huán)境無(wú)菌性，應(yīng)根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況，明確消毒效果最佳滅菌工藝，切實(shí)做到無(wú)菌化藥品生產(chǎn)和加工[4]。

第三，無(wú)菌設(shè)備選擇。以除菌過(guò)濾設(shè)備為例，為了保證藥液在過(guò)濾過(guò)程中無(wú)微生物污染情況出現(xiàn)，應(yīng)按照GMP規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，選擇合適的無(wú)菌過(guò)濾設(shè)備，在過(guò)濾設(shè)備中添加雙層除菌濾芯，以此來(lái)達(dá)到有效除菌目的，從根源上規(guī)避濾芯破損而出現(xiàn)微生物污染問(wèn)題。

第四，藥品運(yùn)輸。全過(guò)程監(jiān)管藥品運(yùn)輸，有利于確保藥品質(zhì)量安全，并符合國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。在實(shí)際藥品運(yùn)輸過(guò)程中，應(yīng)遵循及時(shí)、準(zhǔn)確、安全以及規(guī)避微生物污染基本原則，嚴(yán)格按照現(xiàn)有藥品運(yùn)輸管理制度體系開(kāi)展藥品運(yùn)輸各項(xiàng)工作。明確藥品運(yùn)輸人員、藥品質(zhì)量管理人員責(zé)任范疇，在藥品運(yùn)輸前期，根據(jù)藥品運(yùn)輸各項(xiàng)要求，做好運(yùn)輸路線規(guī)劃與運(yùn)輸工具確認(rèn)工作。避免藥品運(yùn)輸過(guò)程中出現(xiàn)不必要停留，有效縮短藥品運(yùn)輸耗時(shí)。并確認(rèn)所運(yùn)輸?shù)乃幤肥欠翊嬖诎b破損等情況，降低微生物污染概率。

除此之外，需要完善藥品運(yùn)輸防護(hù)措施，如：防水、防潮、防蟲(chóng)等相關(guān)措施，以預(yù)防與控制微生物污染。如運(yùn)輸特殊性藥品，應(yīng)按照國(guó)家相關(guān)規(guī)定執(zhí)行藥品運(yùn)輸各流程，以提高藥品運(yùn)輸質(zhì)量為原則，根據(jù)季節(jié)變化采取相應(yīng)保暖與冷藏措施，規(guī)避運(yùn)輸環(huán)境因素導(dǎo)致微生物污染問(wèn)題發(fā)生，切實(shí)做到全過(guò)程、全方位監(jiān)管藥品加工與運(yùn)輸。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，污染微生物鑒定作為藥品無(wú)菌檢查過(guò)程中最為關(guān)鍵一環(huán)，通過(guò)對(duì)其的研究以調(diào)研和分析目前藥品無(wú)菌檢查情況，其中為了保證鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性，采用了多種不同鑒定方法。結(jié)果顯示藥品被微生物污染，與環(huán)境因素?zé)o關(guān)，其中來(lái)自藥品加工或運(yùn)輸階段的污染源概率較大。因此，為了降低藥品被微生物污染風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)此方面管控，減少藥品使用不良反應(yīng)出現(xiàn)，從根本上保障藥品質(zhì)量。