凝結(jié)芽孢桿菌的益生特性及機制研究進展

王一帆，岑叢楠，劉福奇，包維臣，傅玲琳，王彥波,

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州 310018；2.浙江工商大學(xué)實驗室與資產(chǎn)管理處，浙江杭州 310018；3.金華銀河生物科技有限公司，浙江金華 321000）

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是一種產(chǎn)芽孢的乳酸菌，因顯著的益生特性而備受關(guān)注，成為研究熱點并被逐漸應(yīng)用[1]。目前，凝結(jié)芽孢桿菌已經(jīng)被廣泛運用于保健食品中，可以促進腸道消化。但其益生特性還沒有得到很好地應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌主要通過提高免疫力、調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡和促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收等三種途徑改善機體的健康，在大健康背景下具有重要的研發(fā)意義。由于具有以上益生特性，凝結(jié)芽孢桿菌可以改善人類健康，緩解人類疾病，而在臨床應(yīng)用中發(fā)揮作用，從而應(yīng)用于更多的保健食品和益生菌食品中。凝結(jié)芽孢桿菌有助于治療由不同炎癥因子引起的多種免疫疾病，并且緩解各種消化道疾病，發(fā)揮益生作用。但是，凝結(jié)芽孢桿菌益生特性相關(guān)的機制并沒有得到很好的剖析和總結(jié)。鑒于此，在詳細(xì)剖析凝結(jié)芽孢桿菌益生特性的基礎(chǔ)上，借助于本領(lǐng)域的相關(guān)研究，深入探究和討論其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用機制，并探討了凝結(jié)芽孢桿菌未來發(fā)展趨勢，旨在為健康中國和食品安全國家戰(zhàn)略的實施助力。

1 凝結(jié)芽孢桿菌調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡的作用及機制

1.1 凝結(jié)芽孢桿菌調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡作用

調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡是凝結(jié)芽孢桿菌的益生特性。凝結(jié)芽孢桿菌芽孢以食用口服方式進入人體，在口腔中進行物理消化和酶降解之后，經(jīng)過蠕動通過食道運輸?shù)轿?，胃液的存在使凝結(jié)芽孢桿菌芽孢難以萌發(fā)。對于成年人來說，這一階段大約需要3 h，然后芽孢通過胃部消化環(huán)境后，開始在十二指腸內(nèi)萌發(fā)，并在小腸上部增殖[2]。通常，凝結(jié)桿菌在小腸的停留時間為2～5 h。最后，存活的凝結(jié)芽孢桿菌將向下運動到大腸，并在結(jié)腸下部形成芽孢[3]，參見圖1。凝結(jié)芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢特性使其擁有極高的抗逆性，保障該菌能通過消化道的復(fù)雜環(huán)境，最終在腸道定植，進而增加益生菌的數(shù)量，抑制致病菌，從而改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡[2]。

1.2 凝結(jié)芽孢桿菌調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡機制

凝結(jié)芽孢桿菌可以分泌細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)來抑制致病微生物的生長，從而改善消化道微生態(tài)[3]。Abada等[4]從一株凝結(jié)芽孢桿菌中表征獲得一種細(xì)菌素，具有耐熱性和廣譜抗菌譜，可以抑制致病菌。凝結(jié)芽孢桿菌L1208可以分泌一種抑制腐敗菌的生長的新型細(xì)菌素——凝固素L1208[5]。細(xì)菌素的殺菌機制主要分為破壞細(xì)胞膜和抑制基因表達(dá)兩方面[6]。帶正電的多肽通過靜電吸引結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜上，其C-端具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，通過疏水作用與磷脂結(jié)合，磷脂插入細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致孔的形成[7]。細(xì)菌素和肽聚糖結(jié)合，抑制肽聚糖合成，形成孔洞，參見圖2。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951產(chǎn)生的細(xì)菌素可以誘導(dǎo)單增李斯特菌細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致酶、核酸、蛋白質(zhì)、三磷酸腺苷和鉀離子等[9-10]細(xì)胞內(nèi)容物發(fā)生泄漏。細(xì)菌素還可以通過抑制基因表達(dá)來抑制致病微生物的生長。有些凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素還可以通過跨膜作用進入細(xì)胞，干擾細(xì)胞的正常生命活動。凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951產(chǎn)生的細(xì)菌素還可以插入DNA螺旋槽和DNA相結(jié)合，從而影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致基因組DNA的失活，進而抑制致病微生物[8]。凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951可以產(chǎn)生一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)的細(xì)菌素，環(huán)狀結(jié)構(gòu)可維持細(xì)菌素結(jié)構(gòu)完整性并增強生物活性，有利于其加工、儲存和應(yīng)用。

圖 2 凝結(jié)芽孢桿菌抑制消化道中致病菌Fig.2 Bacillus coagulans inhibits pathogenic bacteria in the digestive tract

此外，凝結(jié)芽孢桿菌還可以通過調(diào)節(jié)消化道環(huán)境來促進益生菌生長并抑制致病菌，進而改善機體消化道微生態(tài)。凝結(jié)芽孢桿菌有利于形成一個厭氧和酸性的消化道環(huán)境，這種環(huán)境不適合致病菌生長，從而促進了益生菌的生長。凝結(jié)芽孢桿菌可以產(chǎn)生L型乳酸，降低消化道環(huán)境pH，抑制致病菌，并為乳酸菌等益生菌提供更有利的生長環(huán)境。凝結(jié)芽孢桿菌作為兼性厭氧菌，可以消耗消化道中的游離氧，減少氧化還原反應(yīng)。凝聚芽孢桿菌RK-02產(chǎn)生的細(xì)胞外多糖（Extracellular Polysaccharides，EPS）是由四種不同的單糖（葡萄糖、巖藻糖、半乳糖和甘露糖）組成的單一雜聚體，這類生物分子具有清除消化道中的通過各種代謝反應(yīng)形成的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的能力，因此它們具有抗氧化和自由基清除活性[11]，從而消耗消化道中氧氣，形成厭氧環(huán)境。Ara等[12]研究表明，食用凝結(jié)芽孢桿菌能夠增加消化道中特定益生菌的數(shù)量，包括乳酸桿菌和雙歧桿菌。凝結(jié)芽孢桿菌可以提高腸道菌群中的物種豐度[13]，如通過暫時性地增殖乳酸菌、總需氧菌和總厭氧菌以及降低腸道中的腸桿菌科的細(xì)菌數(shù)量[14]，以此來改善消化道微生態(tài)和調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。此外，凝結(jié)芽孢桿菌還通過增加擬桿菌門細(xì)菌和減少厚壁菌門微生物，緩解了過敏原誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)[15]。Wang等[16]研究使用了包含凝結(jié)芽孢桿菌的益生菌合劑，通過恢復(fù)腸道粘膜微生物生態(tài)，促進短鏈脂肪酸產(chǎn)生，增加IL-10的表達(dá)和腸屏障功能，從而減少了細(xì)菌對腸道深部組織的侵襲，維持了宿主微生物的平衡進而減輕結(jié)腸炎癥狀[17]。

另一方面，凝結(jié)芽孢桿菌可以競爭性地抑制部分消化道中的致病菌，例如耐萬古霉素腸球菌[18]，從而維持消化道微生態(tài)的穩(wěn)定。凝結(jié)芽孢桿菌通過種群競爭[19]來抑制致病菌在消化道中定植和侵襲來降低致病菌感染風(fēng)險[20]。一項研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌可以被用于預(yù)防沙門氏菌感染，它們會在腸道內(nèi)與沙門氏菌競爭，并增強宿主粘膜免疫系統(tǒng)，延遲沙門氏菌向淋巴結(jié)、脾臟和肝臟的滲透，減少炎癥介質(zhì)，減少氧化應(yīng)激，并減少血液和生化變化，提升宿主對沙門氏菌的免疫能力[21]。通過調(diào)節(jié)消化道微生物區(qū)系豐度，凝結(jié)芽孢桿菌還可以減輕鉛對腸道絨毛的損傷[22]。

凝結(jié)芽孢桿菌通過改善消化道微生態(tài)對消化道疾病具有防控作用[23]，例如急性腹瀉、腸易激綜合征、便秘和結(jié)腸炎，因此食用凝結(jié)芽孢桿菌逐步應(yīng)用于大健康產(chǎn)業(yè)[24]，參見表1。

表 1 凝結(jié)芽孢桿菌在消化道上的益生應(yīng)用Table 1 Probiotic application of Bacillus coagulans in the gastrointestinal tract

2 凝結(jié)芽孢桿菌的促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收作用及機制

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收作用

凝結(jié)芽孢桿菌的益生特性還包括促進機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。Stecker等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在濃縮牛奶等蛋白質(zhì)中添加凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30，6086可以促進氨基酸吸收并顯著促進精氨酸和異亮氨酸吸收，進而提升蛋白質(zhì)消化吸收速率。這對于那些由于衰老或消化道損害等因素而無法吸收較大劑量蛋白質(zhì)的人具有一定意義。凝結(jié)芽孢桿菌還可以促進機體消化吸收乳糖，緩解乳糖不耐受癥。凝結(jié)芽孢桿菌還有利于淀粉和脂肪在機體內(nèi)的分解。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收機制

凝結(jié)芽孢桿菌可以通過酶的產(chǎn)生影響消化道中參與消化吸收的物質(zhì)產(chǎn)生以及改善腸道細(xì)胞健康，來促進機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，參見圖3。Aulitto等[36]研究顯示，凝結(jié)芽孢桿菌MA-13可以產(chǎn)生β-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶用于分解乳糖。凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的半乳糖苷酶可以分解乳糖進而有效緩解乳糖不耐受癥。凝結(jié)芽孢桿菌不僅可以產(chǎn)生α-淀粉酶和脂肪酶，還可以通過分解葡萄糖等糖類產(chǎn)生乳酸[37]，其中混合糖可以提高產(chǎn)乳酸效率[38]，該菌還可以分解木質(zhì)纖維素水解物[39]。凝結(jié)芽孢桿菌IPE22能夠分泌足夠活性的淀粉酶，充分水解淀粉后并進一步產(chǎn)生乳酸[40]。凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30，6086菌株已被證明能產(chǎn)生多種酶，將蛋白質(zhì)和碳水化合物降解成小分子肽和游離氨基酸，從而促進小腸上部的新陳代謝，提高了蛋白質(zhì)利用率，改善結(jié)腸的腸道環(huán)境，減少有毒代謝物[41-42]。此外，凝結(jié)芽孢桿菌還可以改善腸道細(xì)胞健康，從而促進機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。凝結(jié)芽孢桿菌可以通過減少炎癥，顯著改善腸道細(xì)胞健康，從而通過改善絨毛吸收區(qū)域的腸道細(xì)胞發(fā)育來增強機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。凝結(jié)芽孢桿菌還可以刺激腸道蠕動，減少胺等有害物質(zhì)的產(chǎn)生，改善消化道代謝環(huán)境，從而促進對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

圖 3 凝結(jié)芽孢桿菌影響營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收Fig.3 Bacillus coagulans influences digestion and absorption of nutritional materials

3 凝結(jié)芽孢桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用及機制

3.1 凝結(jié)芽孢桿菌免疫調(diào)節(jié)作用

改善機體免疫能力同樣也是凝結(jié)芽孢桿菌的益生特性。凝結(jié)芽孢桿菌食用后可以顯著調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)平衡，調(diào)節(jié)人體免疫功能。Shinde等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在正常或炎癥條件下，凝結(jié)芽孢桿菌MTCC 5856芽孢都可以通過減少促炎細(xì)胞因子IL-8的分泌和增加抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌，對HT-29細(xì)胞產(chǎn)生顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。滅活的凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30，6086還可以提高運動后人體的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞水平，影響促炎和抗炎細(xì)胞因子，從而提高人體免疫能力[44]。

3.2 凝結(jié)芽孢桿菌免疫調(diào)節(jié)機制

首先，凝結(jié)芽孢桿菌可以直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞。Jensen等[45]研究發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30，6086能夠激活人體免疫細(xì)胞，以此改變了免疫激活和抗炎細(xì)胞因子及趨化因子的產(chǎn)生。凝結(jié)芽孢桿菌可以通過產(chǎn)生乳酸來影響免疫系統(tǒng)，乳酸通過與潘氏細(xì)胞和腸道基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸受體Gpr81結(jié)合，以Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路刺激腸道干細(xì)胞增殖[46]。凝結(jié)芽孢桿菌直接作用于癌細(xì)胞，誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，從而可以應(yīng)用于癌癥的治療。凝結(jié)芽孢桿菌的熱滅活培養(yǎng)上清液能更有效地誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，可考慮用于結(jié)腸癌的輔助治療。與非癌性HEK 293T細(xì)胞相比，凝結(jié)芽孢桿菌Unique IS2使人體結(jié)腸癌、宮頸癌和慢性髓性白血病細(xì)胞系的細(xì)胞增殖分別降低了22%、31.7%和19.5%，促凋亡蛋白BAX增加，抗凋亡蛋白Bcl2減少，線粒體膜電位降低，細(xì)胞色素C釋放增加[47]。

其次，凝結(jié)芽孢桿菌還可以通過調(diào)節(jié)免疫蛋白來提高機體免疫能力。腸道堿性磷酸酶（Intestinal Alkaline Phosphatase，IAP）是一種由腸道上皮細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性蛋白，IAP的表達(dá)功能喪失與腸道炎癥增加、生物失調(diào)、腸屏障結(jié)構(gòu)受損、細(xì)菌移位以及隨后的系統(tǒng)性炎癥有關(guān)[48]。凝結(jié)芽孢桿菌可以通過刺激腸道IAP活性來緩解腸道炎癥[49]。凝結(jié)芽孢桿菌13002可以提高血清免疫球蛋白水平、上調(diào)IFN-γ和IL-4來保護粘膜屏障和維持Th1/Th2的平衡以及促進益生菌生長，以此減少烷化劑環(huán)磷酰胺對人體的損傷，進而提高人體免疫力[50]。Anaya-Loyola等[51]研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30，6068可以調(diào)節(jié)免疫蛋白TNF-α、CD163、G-CSF、ICAM-1、IL-6、IL-8、MCP-2、RAGE、uPAR和PF4等，從而提高免疫能力，緩解上呼吸道和消化道癥狀。凝結(jié)芽孢桿菌還可以通過促進半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶基因等凋亡基因的表達(dá)來誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[52]。凝結(jié)芽孢桿菌通過調(diào)節(jié)免疫蛋白來緩解炎癥，因此運用于臨床。包含凝結(jié)芽孢桿菌的益生菌混合物作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的輔助補充劑，有利于緩解疾病癥狀[53]，使紅細(xì)胞沉降率（Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR）[54]和C-反應(yīng)蛋白[55]水平顯著降低。凝結(jié)芽孢桿菌通過刺激抗炎細(xì)胞因子、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡和抗菌物質(zhì)的分泌而進行炎癥的免疫調(diào)節(jié)。凝結(jié)芽孢桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用機制見圖4。

圖 4 凝結(jié)芽孢桿菌免疫調(diào)節(jié)作用Fig.4 Immunomodulatory effects of Bacillus coagulans

近年來，食物過敏受到人們廣泛關(guān)注[56]，部分研究揭示了凝結(jié)芽孢桿菌的抗過敏機制，為未來凝結(jié)芽孢桿菌在抗過敏方面的應(yīng)用提供了理論支撐。凝結(jié)芽孢桿菌09.712能顯著改善上皮屏障功能，促進淋巴細(xì)胞增殖。凝結(jié)芽孢桿菌通過誘導(dǎo)CD4+Foxp3+Tregs和IL-10的產(chǎn)生而改變Th1/Th2/Treg平衡，從而抑制對蝦原肌球蛋白致敏。包含凝結(jié)芽孢桿菌09.712的益生菌混合劑還可減輕食物過敏引起的粘膜疾病[57]。食物過敏原（如蝦原肌球蛋白）的攝入誘導(dǎo)了脾臟中過敏T細(xì)胞的分化，隨后小腸中的炎性細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致過敏細(xì)胞因子的產(chǎn)生，杯狀細(xì)胞過度增殖和隱窩細(xì)胞凋亡。而益生菌混合劑的攝入可能通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)消化道代謝，特別是氨基酸代謝途徑，誘導(dǎo)抗過敏T細(xì)胞分化，抑制炎性細(xì)胞浸潤[5]。凝結(jié)芽孢桿菌可以分解食物中的過敏原，從而降低過敏風(fēng)險[58]。

4 凝結(jié)芽孢桿菌的其他益生特性及機制

凝結(jié)芽孢桿菌還可以直接影響人體消化道中其他物質(zhì)的產(chǎn)生，如膽汁酸、膽固醇和短鏈脂肪酸等，從而對人體產(chǎn)生益生作用。膽汁酸是膽汁的重要組分，由肝臟分泌至消化道中，幫助消化吸收飲食中的脂質(zhì)，但食用豆?jié){會顯著增加次級膽汁酸的產(chǎn)生，如脫氧膽酸和ω-鼠李酸，這會影響消化道環(huán)境，不利于機體的消化吸收，并提高肝臟和結(jié)腸的癌癥風(fēng)險[59]。但是，凝結(jié)芽孢桿菌和豆?jié){的一起服用可以抑制次生膽汁酸的產(chǎn)生，改善了消化道中膽汁酸的代謝，改善了消化道環(huán)境，進而促進機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[60]。凝結(jié)芽孢桿菌還可以降低人體消化道中膽固醇的含量。凝結(jié)芽孢桿菌MTCC 5856通過多種機制，包括膽鹽去結(jié)合、吸收膽固醇、促進膽固醇與靜息細(xì)胞和死亡細(xì)胞結(jié)合等，在消化道中幫助去除富含膽固醇的食物（蛋黃、肝臟和黃油）中的膽固醇，從而降低膽固醇[61]。除此之外，凝結(jié)芽孢桿菌還可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，如丁酸和丙酸，丁酸能夠抑制肝臟中膽固醇的生物合成，丙酸可以抑制脂肪酸的合成，最終降低膽固醇的生物合成速率，從而降低膽固醇水平[62]，改善了消化道中的膽固醇代謝[63]。

5 結(jié)論與展望

鑒于有效的益生作用和產(chǎn)芽孢賦予的極強抗逆性，凝結(jié)芽孢桿菌被認(rèn)為是一種具有廣闊開發(fā)前景的益生菌。研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌的益生特性是多種機制綜合協(xié)調(diào)過程的結(jié)果，涉及機體消化道微生態(tài)、代謝和免疫系統(tǒng)。通過對機制的深入探究，逐漸形成機制網(wǎng)絡(luò)，有利于為未來凝結(jié)芽孢桿菌的廣泛應(yīng)用提供全面的理論支持。但是，凝結(jié)芽孢桿菌的益生特性機制探究的還不夠深入，未來可以在小分子代謝產(chǎn)物、影響免疫功能的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌素等互作機制方面進一步探究。評估菌株的安全性和益生特性是在食品行業(yè)應(yīng)用的前提條件，因此作為益生菌，不同來源的凝結(jié)芽孢桿菌安全性的評估仍需要受到關(guān)注，盡管有部分關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌安全性的研究，但相關(guān)研究還不夠全面。后續(xù)研究中，可以通過對基因組中活性抗生素耐藥基因、毒力因子基因和毒素編碼基因的檢測，進一步探究凝結(jié)芽孢桿菌的安全性，以滿足不同應(yīng)用場景的需要。