‘晉農(nóng)1號(hào)’達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生解磷菌的鑒定及特性研究

楊凱元， 黃 臣， 高 鵬， 梁銀萍， 韓玲娟， 趙 祥

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 山西 太谷 030801)

土壤中廣泛分布的根瘤菌可以通過誘導(dǎo)植物根、莖皮層細(xì)胞增生形成具有固氮功能的共生體，將空氣中游離態(tài)的氮還原成銨態(tài)氮，加速植物對(duì)氮素的吸收和利用[1]。其中，豆科植物和根瘤菌共生體的固氮量約占生物固氮總量的65%[2]，在提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)方面發(fā)揮重要作用[3]。根瘤菌固氮是一個(gè)高耗能過程，每還原一個(gè)N2分子需要消耗16分子三磷酸腺苷(ATP)[4]，因此固氮過程對(duì)磷元素的需求量大。磷缺乏不僅直接導(dǎo)致豆科植物生長(zhǎng)受限，而且抑制了根瘤活性及其固氮能力，造成植物產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅降低[5-6]。研究表明，在低磷條件下，根瘤菌可以通過根瘤表面吸收周圍土壤中的可溶性磷[7]，而土壤中95%以上的磷為難溶性磷[8]，不能被根瘤菌直接吸收利用。因此，一些兼具解磷能力的根瘤菌或者根瘤內(nèi)生非結(jié)瘤解磷菌，通過構(gòu)建復(fù)合菌群的方式在根瘤中共存，分解周圍的難溶性磷供固氮菌使用[9-10]，從而促進(jìn)結(jié)瘤，提高根瘤固氮能力。

目前，已從豆科植物根瘤中分離出許多非結(jié)瘤內(nèi)生菌(Non-rhizobial endophytes,NRE)，如葉桿菌屬Phyllobacterium、泛菌屬Pantoea、芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas和農(nóng)桿菌屬Agrobacterium等[11]，證實(shí)不僅具有解磷、聯(lián)合固氮的功能[12]，而且具有促生、防病等廣泛的生物學(xué)作用[13-14]。與根際解磷菌不同，根瘤內(nèi)生解磷菌能夠?yàn)楦鼍Y(jié)瘤固氮提供磷[9]，目前已有研究通過根瘤菌和根瘤內(nèi)生解磷菌雙接種試驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了大豆Glycinemax、鷹嘴豆Cicerarietinum等豆科植物的結(jié)瘤固氮能力顯著增強(qiáng)，并促進(jìn)根系生長(zhǎng)，顯著提高了作物的產(chǎn)量[15-17]。不同豆科植物與根瘤內(nèi)生菌建立的共生體中，解磷菌的類型和解磷能力存在差異，趙龍飛等[14]從大豆根瘤內(nèi)分離出7株解磷能力較強(qiáng)的內(nèi)生菌，其中惡臭假單胞菌Pseudomonasputida的解磷量最高可達(dá)452 μg·mL-1；Rajput等[18]從綠豆Vignaradiata根瘤內(nèi)分離出1株解木聚糖類芽胞桿菌Paenibacillusxylanilyticus，但解磷量較低，為134.48 μg·mL-1。因此，在豆科植物栽培過程中，挖掘和應(yīng)用具有較強(qiáng)解磷能力的根瘤內(nèi)生菌是促進(jìn)植物結(jié)瘤固氮，增加產(chǎn)量，改善品質(zhì)，保證農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。

達(dá)烏里胡枝子是豆科(Leguminomase)胡枝子屬(Lespedeza)的多年生植物，能與根瘤菌共生，是山西、陜西等黃土高原地區(qū)優(yōu)良的鄉(xiāng)土牧草和水土保持先鋒植物[19]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)胡枝子屬植物根瘤內(nèi)生菌的研究較多，如Palaniappan等[20]從韓國(guó)的胡枝子屬植物根瘤中共分離出13個(gè)種共39株內(nèi)生菌，其中24株具有解磷能力；Subramanian等[21]進(jìn)一步將其中具有解磷能力的巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium與水稻Oryzasativa葉片內(nèi)生菌微枝桿菌Methylobacteriumoryzae和大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobiumjaponicum共接種，發(fā)現(xiàn)大豆的結(jié)瘤固氮能力顯著提升；Busby等[22]利用高通量測(cè)序?qū)Ρ攘巳肭治锓N截葉鐵掃帚(Lespedezacuneata)與本地L.virginica、L.repens、L.procumbens、L.capitata、L.stuevei和L.violacea等6個(gè)胡枝子種的根瘤內(nèi)生菌多樣性，發(fā)現(xiàn)后者的種類更為豐富，其中伯克氏菌目Burkholderiales和腸桿菌科Enterobacteriaceae細(xì)菌為常見的解磷菌?？梢?，胡枝子屬植物根瘤中存在具有解磷和共生固氮能力的內(nèi)生菌，且種類與寄主生長(zhǎng)的地理位置密切相關(guān)。然而，目前尚未見關(guān)于山西省種植的達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生菌，尤其是解磷菌的研究報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)于2014年獲得1個(gè)國(guó)家審定草新品種‘晉農(nóng)1號(hào)’達(dá)烏里胡枝子，該品種適應(yīng)性強(qiáng)、耐旱、耐貧瘠且品質(zhì)優(yōu)良，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，對(duì)于黃土高原地區(qū)生態(tài)修復(fù)以及飼草生產(chǎn)發(fā)揮著重要作用[23]。本文通過分離和鑒定‘晉農(nóng)1號(hào)’達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生菌，篩選解磷菌并分析其抗逆和促生特性，以期為研發(fā)適合于黃土高原地區(qū)甚至退化鹽堿地胡枝子建植的根瘤微生物復(fù)合菌劑提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1根瘤樣品采集 2021年8月中旬，在山西省晉中市太谷區(qū)(112°35′25″E，37°26′1″N)的‘晉農(nóng)1號(hào)’達(dá)烏里胡枝子種植田采集盛花期[24]的植株樣品，種植田面積為0.3 ha，采用“五點(diǎn)取樣法”在種植田設(shè)置5個(gè)5 m×5 m的重復(fù)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)在對(duì)角線上每間隔5 m隨機(jī)選取3株達(dá)烏里胡枝子，共采集15株。用75%乙醇表面消毒的鐵鏟挖取完整的根系土胚，抖落根系表面的土壤，挑選具有根瘤的植株帶回室內(nèi)。用滅菌剪刀剪取根瘤部位根系，置于75%酒精中消毒30 s，無菌蒸餾水漂洗3次，放入底部盛有干燥劑、中間用滅菌脫脂棉隔離的5 mL離心管中，置于4℃低溫冰箱中保存，3 d內(nèi)進(jìn)行根瘤內(nèi)生菌的分離。

1.1.2培養(yǎng)基 參考不同的文獻(xiàn)方法配制：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、YMA(Yeast mannitol agar)培養(yǎng)基、PKO(Pikovaskaia's)無機(jī)磷培養(yǎng)基、蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基[14]，TY液體培養(yǎng)基[25]，淀粉瓊脂培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基、1%胰胨水溶液[26]，CAS(Chrome azurol S)鐵載體檢測(cè)培養(yǎng)基[27]，葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基[28]。

培養(yǎng)基均于121℃高溫高壓滅菌20 min，其中明膠培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基、1%胰胨水溶液分裝于試管，TY液體培養(yǎng)基分裝于錐形瓶，其余培養(yǎng)基均制備成平板備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生菌的分離 使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離根瘤內(nèi)生菌。將干燥的根瘤樣品用無菌水浸泡2 h使其完全吸脹，置于95%乙醇中處理30 s，5% NaClO溶液消毒5 min，無菌水沖洗5～7次。用無菌刀片沿根瘤中間部位切開，將根瘤切面在培養(yǎng)基表面劃線，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱(MJ-I型，上海一恒公司)中培養(yǎng)。待菌落出現(xiàn)后，挑取單菌落繼代劃線純化培養(yǎng)，直至獲得純菌株，在斜面培養(yǎng)基上4℃低溫保存。

1.2.2根瘤內(nèi)生解磷菌的初篩及其解磷能力和堿性磷酸酶活性的測(cè)定 解磷菌初篩：將保存的根瘤內(nèi)生菌菌株活化后，制備成菌懸液(OD600=2.0)。吸取5 μL菌懸液，接種在定量20 mL的PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株4次重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)，第7 d采用“十字交叉法”測(cè)定透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)，將可溶性指數(shù)(D/d)≥1.1的解磷菌用于開展后續(xù)試驗(yàn)。

解有機(jī)磷和無機(jī)磷能力測(cè)定：將上述篩選的解磷菌活化后，制備成菌懸液(OD600=0.8)。吸取1 mL菌懸液接種在60 mL蒙金娜液體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株3次重復(fù)，接種無菌水為對(duì)照，28℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)(ZQLY-180E型，上海知楚公司)5 d，混勻取10 mL培養(yǎng)液，10 000 r·min-1離心(H2050R型，湖南湘儀公司)15 min，采用“鉬銻抗比色法”測(cè)定上清液有效磷含量[29]，確定菌株解有機(jī)磷能力，使用pH計(jì)測(cè)定上清液pH值[14]。以磷酸鈣為磷源，定量測(cè)定菌株解無機(jī)磷能力，方法同解有機(jī)磷能力測(cè)定。將解有機(jī)磷和無機(jī)磷試驗(yàn)中上清液有效磷含量顯著高于對(duì)照的菌株確定為有效解磷菌。

堿性磷酸酶活性測(cè)定：使用堿性磷酸酶(AKP/ALP)活性檢測(cè)試劑盒對(duì)上述上清液的堿性磷酸酶活性進(jìn)行測(cè)定。主要步驟有，在37℃，遮光條件下與上清液反應(yīng)15 min，每mL上清液每min催化產(chǎn)生1 μmol酚定義為1個(gè)酶活力單位。

1.2.3根瘤內(nèi)生解磷菌的鑒定 解磷菌形態(tài)特征觀察：將篩選的有效解磷菌接種在YMA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)特征，測(cè)量菌落直徑；參考伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)手冊(cè)(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，Second Edition，2004)進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色，使用顯微鏡(BX50F-3型，日本Olympus公司)觀察菌體形態(tài)、測(cè)量大小，每個(gè)菌株測(cè)量50個(gè)。

解磷菌的生理生化反應(yīng)：參考沈萍等[30]的方法，對(duì)篩選的有效解磷菌進(jìn)行接觸酶反應(yīng)、淀粉水解反應(yīng)、明膠液化反應(yīng)和甲基紅反應(yīng)的測(cè)定。

解磷菌的16S rDNA序列相似性與系統(tǒng)發(fā)育分析：挑取篩選的有效解磷菌單菌落置于盛有20 μL無菌水的PCR八連排管中，在PCR儀上95℃加熱7 min，離心取上清液作為模板DNA備用。利用通用引物P1(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3’)和反向引物P6(5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3’)對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃/3 min；94℃/30 s，55℃/30 s，72℃/1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃/5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。獲得的16S rDNA序列編輯后提交NCBI數(shù)據(jù)庫獲得登錄號(hào)，并利用EZBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/identify/)進(jìn)行序列比對(duì)。使用MEGA 7.0軟件將序列與EZBioCloud數(shù)據(jù)庫中的模式菌株序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值(bootstrap)為1 000次。

1.2.4根瘤內(nèi)生解磷菌抗逆性測(cè)定 有效解磷菌耐鹽、耐酸堿性測(cè)定：分別制備NaCl含量為0.01%，0.1%，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%和pH值為4，5，6，7，8，9，10，11，12的YMA培養(yǎng)基，吸取5 μL有效解磷菌菌懸液(OD600=2.0)接種在不同處理的培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株3次重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)，第3 d測(cè)定菌落直徑。

有效解磷菌高低溫度耐受性測(cè)定：吸取5 μL有效解磷菌菌懸液(OD600=2.0)接種在YMA培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株3次重復(fù)，分別置于溫度為4℃，20℃，28℃，37℃和60℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3 d測(cè)定菌落直徑。

1.2.5根瘤內(nèi)生解磷菌其它促生特性測(cè)定 有效解磷菌其它促生特性測(cè)定：對(duì)有效解磷菌進(jìn)行產(chǎn)鐵載體能力[25]、產(chǎn)有機(jī)酸能力[26]和吲哚反應(yīng)[28]測(cè)定；其中，產(chǎn)鐵載體能力和產(chǎn)有機(jī)酸能力測(cè)定方法如下，將有效解磷菌分別接種在CAS培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株4次重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)，第5 d采用“十字交叉法”測(cè)定透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)，以可溶性指數(shù)(D/d)表示菌株產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)有機(jī)酸能力。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2019整理數(shù)據(jù)，繪制根瘤內(nèi)生菌屬組成的餅圖；使用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)菌株的可溶性指數(shù)、液體培養(yǎng)基中有效磷含量、堿性磷酸酶活性以及其它促生特性等指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和LSD法多重比較(P<0.05)。采用Origin 2021 統(tǒng)計(jì)軟件繪制根瘤內(nèi)生解磷菌的解磷能力柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生菌屬的組成

從達(dá)烏里胡枝子根瘤中分離出88株內(nèi)生菌，共13屬，其中農(nóng)桿菌屬Agrobacterium分離頻率最高，為19.3%，短桿菌屬Brevibacterium和近芽孢桿菌屬Peribacillus次之，分離頻率分別為18.2%和17.1%；其它菌株如普里斯特氏菌屬Priestia、根瘤菌屬Rhizobium、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium、芽孢桿菌屬Bacillus、新根瘤菌屬Neorhizobium、黃單胞菌屬Xanthomonas、假單胞菌屬Pseudomonas、鏈霉菌屬Streptomyces、葉桿菌屬Phyllobacterium和泛菌屬Pantoea的分離率均小于10.0%(圖1)。

圖1 達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生菌屬的組成Fig.1 Genus composition of nodule endophytic bacteria of Lespedeza daurica

2.2 達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生解磷菌的初篩及其解磷能力和堿性磷酸酶活性

2.2.1根瘤內(nèi)生解磷菌的初篩 初步確定88株內(nèi)生菌中有11株具有解磷能力，其中1株可單解無機(jī)磷(圖2B)，8株可單解有機(jī)磷(圖2A)，2株可兼解無機(jī)磷和有機(jī)磷(圖2)。其中，TG7，TG41，TG42，TG43，TG44，TG47和TG68在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基以及TG47和TG68在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基上的可溶性指數(shù)大于1.1。

圖2 達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生解磷菌的可溶性指數(shù)Fig.2 Solubility index of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica 注：A，根瘤內(nèi)生解磷菌在蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上的可溶性指數(shù)；B，根瘤內(nèi)生解磷菌在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基上的可溶性指數(shù)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note:A,Solubility index of nodule endophytic phosphate-solubilizing bacteria on organic phosphorus medium;B,Solubility index of nodule endophytic phosphate-solubilizing bacteria on inorganic phosphorus medium;different lowercase letters indicates significant difference at the 0.05 level. The same as below

2.2.2根瘤內(nèi)生解磷菌解有機(jī)磷和無機(jī)磷能力及其堿性磷酸酶活性 TG7，TG41，TG42，TG43，TG44，TG47和TG68在蒙金娜液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，TG41，TG43，TG47和TG68的培養(yǎng)液有效磷含量顯著高于對(duì)照(P<0.05)，分別比對(duì)照提升了128.1%，159.4%，303.1%和168.8%(圖3A)。培養(yǎng)液pH僅TG47比對(duì)照高0.03，TG7，TG41，TG42和TG43的培養(yǎng)液pH顯著低于對(duì)照(P<0.05)，分別比對(duì)照下降了0.41，0.33，0.42和0.72(圖3B)。TG47和TG68在PKO無機(jī)磷液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，TG47的培養(yǎng)液有效磷含量顯著高于對(duì)照(P<0.05)，比對(duì)照提高了234.39倍(圖4A)。TG47的培養(yǎng)液pH顯著低于對(duì)照(P<0.05)，比對(duì)照下降了1.04(圖4B)。因此，TG41，TG43，TG47和TG68為有效解磷菌。

圖3 根瘤內(nèi)生解磷菌解有機(jī)磷能力(A)、培養(yǎng)液pH(B)以及堿性磷酸酶活性(C)Fig.3 Phosphate-solubilizing ability to organic phosphorus (A),pH of culture solution (B) and alkaline phosphatase activity (C) of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

圖4 根瘤內(nèi)生解磷菌解無機(jī)磷能力(A)及培養(yǎng)液pH(B)Fig.4 Phosphate-solubilizing ability to inorganic phosphorus (A) and pH of culture solution (B) of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

TG7，TG41，TG42，TG43，TG44，TG47和TG68在蒙金娜液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，TG41，TG42，TG43，TG44和TG47的堿性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照(P<0.05)，分別比對(duì)照提升了337.9%，303.5%，466.8%，388.7%和1209.8%(圖3C)，其中，TG47的堿性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照和其它菌株(P<0.05)。

2.3 根瘤內(nèi)生解磷菌的鑒定

2.3.1達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生解磷菌的形態(tài)特征 有效解磷菌的菌落均為圓形、邊緣完整且中心隆起。其中，TG41和TG43菌落白色，生長(zhǎng)2 d的菌落直徑分別為6.94和6.99 mm(圖5A-a，b)，革蘭氏染色陽性(圖5B-a，b)，有芽孢(圖5C-a，b)，菌體桿狀，大小分別為(1.06～1.78)×(1.95～4.11)μm和(1.17～1.55)×(2.60～4.00) μm(表1)；TG47和TG68的菌落分別為乳白色和黃色，生長(zhǎng)2 d的菌落直徑分別為6.77和5.66 mm(圖5A-c，d)，革蘭氏染色陰性(圖5B-c，d)，無芽孢(圖5C-c，d)，菌體直桿狀，大小分別為(0.66～0.75)×(1.40～1.79)μm和(0.55～0.91)×(1.18～2.64)μm(表1)。

圖5 根瘤內(nèi)生解磷菌的形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica注：A，有效解磷菌的菌落形態(tài)特征，a ～ d分別為TG41，TG43，TG47和TG68的菌落；B，有效解磷菌的革蘭氏染色結(jié)果，a ～ d分別為TG41，TG43，TG47和TG68；C，有效解磷菌的芽孢染色結(jié)果，a ～ d分別為TG41，TG43，TG47和TG68；標(biāo)尺=5 μmNote:A,Colony morphological characteristics of effective phosphate-solubilizing bacteria,a ～ d show the colonies of TG41,TG43,TG47 and TG68,respectively;B,Gram staining results of effective phosphate-solubilizing bacteria,a ～ d show the results of TG41,TG43,TG47 and TG68,respectively;C,Spore staining results of effective phosphate-solubilizing bacteria,a ～ d show the results of TG41,TG43,TG47 and TG68,respectively;scale = 5 μm

表1 根瘤內(nèi)生解磷菌的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

2.3.2達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生解磷菌的生理生化特性 TG41和TG43的過氧化氫酶反應(yīng)、淀粉水解反應(yīng)和明膠液化反應(yīng)均呈陽性，甲基紅反應(yīng)均呈陰性；TG47和TG68過氧化氫酶反應(yīng)、淀粉水解反應(yīng)和明膠液化反應(yīng)均呈陰性；TG47甲基紅反應(yīng)呈陰性，TG68甲基紅反應(yīng)呈陽性(表2)。

表2 根瘤內(nèi)生解磷菌的生理生化特性Table 2 Biochemical reaction of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

2.3.3達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生解磷菌16S rDNA序列相似性與系統(tǒng)發(fā)育分析 TG41，TG43，TG47和TG68的GenBank登錄號(hào)分別為ON529568，ON529570，ON529572和ON529573，16S rDNA序列長(zhǎng)度分別為1 458 bp，1 460 bp，1 469 bp和1 506 bp。通過EZBioCloud數(shù)據(jù)庫比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析(圖6)，TG41和TG43與模式菌株辣椒芽孢桿菌Bacilluszanthoxyli1433T(登錄號(hào)：KX865140)的同源性均為99.58%；TG47與模式菌株尊杜克葉桿菌PhyllobacteriumzundukenseTri 48T(登錄號(hào)：KX426256)的同源性為96.28%；TG68與模式菌株成團(tuán)泛菌PantoeaagglomeransDSM 3493T(登錄號(hào)：AJ233423)的同源性為99.10%。結(jié)合菌株生理生化特性及培養(yǎng)特征，確定TG41和TG43為辣椒芽孢桿菌Bacilluszanthoxyli，TG47為尊杜克葉桿菌Phyllobacteriumzundukense，TG68為成團(tuán)泛菌Pantoeaagglomerans。

圖6 根瘤內(nèi)生解磷菌的最大相似性種系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of max similar species of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

2.4 達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生解磷菌的抗逆性

TG41，TG43和TG68具有較好的耐鹽、耐酸堿能力，分別在鹽濃度0.01%～9.00%和pH4～ pH12的培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)；TG47次之，可在鹽濃度2.00%和pH5～pH10的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(表3)。

表3 根瘤內(nèi)生解磷菌在不同脅迫下的菌落直徑Table 3 Colony diameter of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica under different stresses 單位：mm

所有有效解磷菌在60℃均未生長(zhǎng)，不耐高溫；TG47和TG68在4℃仍可生長(zhǎng)，具有一定的耐低溫能力。其中，TG41和TG43在20℃～37℃生長(zhǎng)良好，TG47和TG68在20℃～28℃生長(zhǎng)良好。

2.5 達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生解磷菌的其它促生特性

4株有效解磷菌吲哚反應(yīng)呈陰性，均具有分泌鐵載體能力，TG47的分泌能力較強(qiáng)；除TG47的3株有效解磷菌均具分泌有機(jī)酸的能力，TG68的分泌能力較強(qiáng)(表4)。

表4 根瘤內(nèi)生解磷菌的其它促生特性Table 4 Other plant growth-promoting characteristics of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

3 討論

3.1 達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生菌屬的組成

豆科植物根瘤是植物-微生物共生的特殊微環(huán)境，蘊(yùn)含著豐富的內(nèi)生菌資源[31]。達(dá)烏里胡枝子具有較高的飼用價(jià)值和水土保持能力，是山西省的優(yōu)良鄉(xiāng)土植物，其根瘤內(nèi)生菌具有較高的研究?jī)r(jià)值。Palaniappan等[20]從韓國(guó)的胡枝子屬植物根瘤中分離出39株內(nèi)生菌，其中伯克氏菌屬Burkholderia、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium和根瘤菌屬Rhizobium為優(yōu)勢(shì)屬；Busby等[22]對(duì)北美6種胡枝子屬植物的根瘤進(jìn)行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)生菌種類豐富，共63屬，其中慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium、類固醇桿菌屬Steroidobacter和紅微菌屬Rhodomicrobium為優(yōu)勢(shì)屬；冀玉良等[32]對(duì)商洛地區(qū)多花胡枝子分離的根瘤內(nèi)生菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)根瘤菌屬Rhizobium和中華根瘤菌屬Sinorhizobium為優(yōu)勢(shì)屬。本研究從山西省種植的達(dá)烏里胡枝子根瘤中分離出88株內(nèi)生菌，共13屬，其中根瘤菌屬Rhizobium和(或)慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium等在已報(bào)道的胡枝子屬植物根瘤中均有發(fā)現(xiàn)。包括胡枝子在內(nèi)的豆科植物上，這些根瘤菌也是形成根瘤，產(chǎn)生固氮功能的必要物種[33]。與上述研究有所不同，本研究中農(nóng)桿菌屬Agrobacterium、短桿菌屬Brevibacterium和近芽孢桿菌屬Peribacillus為優(yōu)勢(shì)屬，這表明不同地區(qū)的胡枝子屬植物根瘤內(nèi)生菌多樣性豐富，但優(yōu)勢(shì)屬存在差異，這可能是胡枝子物種、生長(zhǎng)的地理位置、氣候和土壤條件[34]以及人類活動(dòng)[35]共同作用所致。此外，本研究還分離出胡枝子屬植物根瘤中尚未報(bào)道的內(nèi)生菌，包括新根瘤菌屬Neorhizobium、短桿菌屬Brevibacterium、近芽孢桿菌屬Peribacillus、普里斯特氏菌屬Priestia、假單胞菌屬Pseudomonas、鏈霉菌屬Streptomyces、葉桿菌屬Phyllobacterium和泛菌屬Pantoea等，極大地豐富了胡枝子屬植物的根瘤內(nèi)生菌資源庫。

3.2 達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生解磷菌的類型、解磷能力及解磷方式

不同功能的內(nèi)生菌以構(gòu)建復(fù)合菌群的方式在根瘤內(nèi)共存[10]，其中包括兼具固氮和解磷能力的內(nèi)生菌[36]和具有解磷能力的非固氮內(nèi)生菌[40]等，能夠分解土壤中的難溶性磷供其自身構(gòu)建細(xì)胞和植物生長(zhǎng)利用[37]或者分解根瘤內(nèi)部的難溶性磷供根瘤菌利用[40]。陳曉琳等[38]從花櫚木Ormosiahenryi根瘤中分離篩選出1株解磷能力較強(qiáng)的內(nèi)生菌，解有機(jī)磷和無機(jī)磷量分別為71.2和31.1 μg·mL-1，固氮酶活性為2.54 μmol·g-1·h-1，經(jīng)回接試驗(yàn)確定為根瘤菌；韓梅等[39]從大豆根瘤中篩選出1株兼具固氮和解磷能力的快生型根瘤菌，第7 d解磷量為35.5 μg·mL-1；本研究中TG47和TG68兼具固氮(未發(fā)表數(shù)據(jù))和解磷能力，經(jīng)鑒定分別為尊杜克葉桿菌Phyllobacteriumzundukense和成團(tuán)泛菌Pantoeaagglomerans，表明達(dá)烏里胡枝子根瘤中還存在除根瘤菌以外的其它兼具固氮能力的解磷菌，這可能是在協(xié)同進(jìn)化過程中發(fā)生了共生基因的橫向轉(zhuǎn)移[41]。此外，根瘤中還存在具有解磷能力的非固氮內(nèi)生菌，Mohsin等[42]從豌豆Pisumsativum根瘤中篩選出4株具有解磷能力的非固氮內(nèi)生菌，解無機(jī)磷量為5.57～11.73 μg·mL-1，分別為蒼白桿菌屬Ochrobactrum和腸桿菌屬Enterobacter；鐘宇舟等[43]從大豆根瘤中分離了5株為非固氮內(nèi)生菌，解磷量為7.47～10.62 μg·mL-1，分別為芽孢桿菌屬Bacillus、腸桿菌屬Enterobacter和假單胞菌屬Pseudomonas；本研究中TG41和TG43解有機(jī)磷量為0.73和0.83 μg·mL-1，無固氮能力，經(jīng)鑒定均為辣椒芽孢桿菌Bacilluszanthoxyli，這表明不同豆科植物與根瘤內(nèi)生菌建立的共生體中，解磷菌的類型和解磷能力存在差異。本研究已從胡枝子根瘤中分離出具有解磷能力的內(nèi)生菌，其能否為根瘤菌固氮作用提供磷元素，這還需要通過同位素標(biāo)記等方法，對(duì)內(nèi)生菌磷轉(zhuǎn)化和吸收的途徑進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.3 達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生解磷菌的抗逆和促生潛力

達(dá)烏里胡枝子是黃土高原地區(qū)的代表性植物之一，能與根瘤菌共生，具有良好的環(huán)境適應(yīng)性[19]。內(nèi)生菌在與宿主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過程中，能夠通過誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性以及增強(qiáng)對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性來促進(jìn)植物生長(zhǎng)[49]。本研究從達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)分離的芽孢桿菌屬Bacillus和泛菌屬Pantoea具有解磷能力和良好的耐鹽、耐酸堿能力，并且與Palaniappan等[21]的研究相比，本研究中達(dá)烏里胡枝子根瘤內(nèi)生解磷菌的屬組成也更加豐富，這可能是達(dá)烏里胡枝子具有良好適應(yīng)性的原因之一。此外，在豆科植物-根瘤菌共生體中，鐵參與固氮酶、豆血紅蛋白和鐵氧化還原蛋白等關(guān)鍵物質(zhì)的合成[50]，對(duì)于維持根瘤的固氮活性具有重要意義[51]，本研究篩選的4株有效解磷菌兼有分泌鐵載體能力，可螯合周圍環(huán)境中的鐵改善自身營(yíng)養(yǎng)狀況，還能供給植物或與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)鐵營(yíng)養(yǎng)，達(dá)到促生防病的目的[52]，但其能否為根瘤菌固氮酶等關(guān)鍵物質(zhì)的合成提供鐵元素仍有待進(jìn)一步研究。因此，4株有效解磷菌具有較好的抗逆能力和促生潛力，為黃土高原甚至退化鹽堿地建植達(dá)烏里胡枝子使用的根瘤微生物復(fù)合菌劑提供了菌種資源。因此，后續(xù)將進(jìn)一步開展根瘤菌屬Rhizobium、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium和新根瘤菌屬Neorhizobium的結(jié)瘤固氮能力及田間促生效果研究，并進(jìn)行根瘤內(nèi)生解磷菌與根瘤菌的復(fù)合接種試驗(yàn)，探究其對(duì)根瘤菌結(jié)瘤固氮所發(fā)揮的作用。

4 結(jié)論

山西省種植達(dá)烏里胡枝子的根瘤內(nèi)生菌資源豐富，分屬13屬，除豆科植物形成根瘤的常見根瘤菌屬Rhizobium和慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium外，農(nóng)桿菌屬Agrobacterium、短桿菌屬Brevibacterium和近芽孢桿菌屬Peribacillus也是其優(yōu)勢(shì)根瘤內(nèi)生菌。其中，4株為有效解磷菌，分別為辣椒芽孢桿菌Bacilluszanthoxyli(TG41和TG43)、尊杜克葉桿菌Phyllobacteriumzundukense(TG47)和成團(tuán)泛菌Pantoeaagglomerans(TG68)，解有機(jī)磷量為0.73～1.29 μg·mL-1，TG47和TG68解無機(jī)磷量為72.97和1.29 μg·mL-1，菌株分泌磷酸酶為解磷的主要方式。4株解磷菌均能分泌鐵載體，TG41、TG43和TG68還能分泌有機(jī)酸，具有一定的促生潛力。此外，這些菌株具有較強(qiáng)的耐鹽和耐酸堿能力，可用于后續(xù)研發(fā)適合黃土高原甚至退化鹽堿地建植達(dá)烏里胡枝子使用的根瘤微生物復(fù)合菌劑。