英夫利西單抗對腦出血模型小鼠的改善作用及機制研究

羅瑞琦 嚴美茹 王思媛 張燕平

出血性腦卒中占所有腦血管病的20%～30%，具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點。目前尚缺乏有效的干預方法。研究發(fā)現，炎癥是繼發(fā)性腦損傷的基本要素。在腦出血發(fā)生后，活化的小膠質細胞釋放促炎細胞因子和趨化因子，引起血腫周圍炎癥細胞的大量聚集，從而造成腦實質的繼發(fā)性損傷[1]。因此，抑制炎癥反應的發(fā)生可能是減弱腦出血后繼發(fā)性損傷的有效途徑。

英夫利昔單抗作為腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的單克隆抗體，具有明確的抗炎作用，對克羅恩病、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病均有一定的療效。近年來，有研究發(fā)現英夫利昔單抗在缺血性腦卒中中能夠通過調控小膠質細胞的轉化、改善血腦屏障、減輕炎癥反應從而發(fā)揮改善神經功能的作用，但其在出血性腦卒中中是否能夠減輕炎癥損傷尚無明確研究。故本研究擬通過膠原酶法構建小鼠腦出血模型，通過尾靜脈注射英夫利昔單抗，探究英夫利西單抗對腦出血小鼠腦部炎癥反應及預后的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：10月齡SPF級雄性C57BL/6小鼠144只，體重為24～26 g，購自鄭州市華興實驗動物公司，動物合格證號為SCXK(豫)2019-0002。

1.1.2主要試劑和儀器：英夫利西單抗(HY-P9970，上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司)；Ⅶ型膠原酶(美國Sigma-Aldrich公司)；星形膠質細胞表面標志物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)兔一抗(貨號GB11096)、小膠質細胞表面標志物鈣離子接頭蛋白(IBA-1)(貨號GB113502)、中性粒細胞表面標志物髓過氧化物酶(MPO)兔一抗(貨號GB11224)，相應CY3標記的山羊抗兔熒光二抗(貨號GB21303)，以及ACTIN抗體(貨號GB12001)、白細胞介素6(IL-6)抗體(貨號GB11117)、TNF-α抗體(貨號GB11188)、DAPI(貨號G1012)均購自武漢servicebio公司；白細胞介素1β(IL-1β)抗體(貨號AF5103，美國AFFinity公司)；輕便小鼠腦立體定位儀(瑞沃單臂數顯定位儀；深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；Ni-U正置熒光顯微鏡(日本尼康公司)；微量進樣針(SYR 1 μL；瑞士漢斯爾頓公司)；CM1860冰凍切片機(德國徠卡公司)；Advenyurer AV 264 AV萬分之一天平、Starter 2C PH計購自美國奧豪斯公司；蘇靜SW-CJ-1FD超凈工作臺(江蘇蘇靜公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠分組和處理：144只小鼠隨機分為假手術組、假手術+英夫利西單抗組、腦出血組及腦出血+英夫利西單抗組四組，每組36只。腦出血組及腦出血+英夫利西單抗組均在左側尾狀核處顱骨打孔，微量注射器進針并泵入0.5 μL Ⅶ型膠原酶(0.075 U)，制作腦出血模型，以術后第1天NDS評分≥4分視為造模成功；假手術組及假手術+英夫利西單抗組上述同樣方法進針，但不泵入膠原酶。假手術+英夫利西單抗組及腦出血+英夫利西單抗組術后按體重10 mg/kg予英夫利西單抗尾靜脈給藥，之后每天相同時間給藥，連續(xù)用藥3 d。

1.2.2小鼠肛溫及體重檢測：小鼠的肛溫即小鼠的中心溫度，于術后第1天、3天、7天、14天及28天每日清晨8點在小鼠安靜狀態(tài)下測量并記錄假手術組、假手術+英夫利西單抗組、腦出血組及腦出血+英夫利西單抗組小鼠的肛溫及體重。

1.2.3Western blot法檢測血腫周圍TNF-α、IL-1β、IL-6的相對表達水平：于造模成功后第1天，隨機選取假手術組、假手術+英夫利西單抗組、腦出血組及腦出血+英夫利西單抗組小鼠每組各6只，以含3%(體積分數)異氟烷的氧氣通過鼻導管吸入，小鼠深度麻醉后迅速頸椎脫臼處死取腦組織，取血腫灶周圍5 mm以內腦組織為樣本，假手術組取同部位腦組織，按照腦組織(mg)∶蛋白酶裂解液(μL)=1∶10的比例加入蛋白酶裂解液，使用研磨棒研磨腦組織，裂解后勻漿離心收集所得上清液，酶標儀測定各樣品的分光光度值，計算樣品蛋白濃度，將配置好的SDS-PAGE凝膠夾入電泳儀中，按順序加樣蛋白樣品并電泳，PVDF膜和濾紙、凝膠精確對齊后放入轉膜槽，轉膜槽設置為300 mA即可轉膜，PVDF膜經脫脂牛奶封閉后，在1×TBST(100 mL 10×TBS+1 mL Tween-20，加超純水定容至 1000 mL)搖床中洗滌15 min，用含5%(質量濃度)BSA的1×TBST按1∶1000稀釋IL-6抗體、IL-1β抗體、TNF-α抗體及ACTIN抗體(內參)，于4℃孵育過夜，裁剪PVDF膜至合適大小后放在含有一抗稀釋抗體的抗體孵育盒中，用1×TBST洗滌15 min后加入稀釋后的二抗(1∶5000)，將ECL底物充分混勻后，均勻涂于PVDF膜上，使用Bio-RAD拍照后采用Image J軟件定量分析各組蛋白與內參的灰度值，目的蛋白的相對水平=目的蛋白的灰度值/相應內參的灰度值。

1.2.4干濕重法測定腦含水量(BWC)：于造模術后第3天，隨機抽取假手術組、假手術+英夫利西單抗組、腦出血組及腦出血+英夫利西單抗組小鼠各8只，使用3%異氟烷通過鼻導管吸入麻醉，小鼠進入深度麻醉后立刻頸椎脫臼處死取腦，沿縱裂及中腦水平切斷獲取左大腦半球、右大腦半球及小腦，并立即用微量天平分別進行稱重，此為濕重(wet wight，WW)，將稱量過的鼠腦放入烤箱中，60℃烘烤12 h后再用100℃烘烤12 h，取出再次稱重，此為干重(dry weight，DW)，然后根據Eliot公式計算BWC：BWC=(WW-DW)/WW×100%。

1.2.5免疫熒光染色測小膠質細胞、星形膠質細胞和中性粒細胞的浸潤情況：腦出血組及腦出血加用英夫利西單抗組小鼠于造模后第3天，隨機選取6只，使用3%異氟烷通過鼻導管吸入，小鼠深度麻醉后迅速頸椎脫臼處死，取腦組織固定脫水包埋后，在冰凍切片機中自視交叉平面開始收片，連續(xù)切12張30 μm厚腦組織為1個循環(huán)，共連續(xù)切10個循環(huán)，各腦組織選相同3個循環(huán)的組織切片各1張，所選切片漂洗封閉后再分別在含有GFAP一抗(1∶400)、IBA-1一抗(1∶400)及MPO一抗(1∶200)的1%(質量濃度)BSA中4℃搖床過夜，之后用含有0.3%(體積濃度)Triton X-100的0.01 mol/L PBS洗滌后，在避光條件下，將組織切片置于含有相應二抗的1%(質量濃度)BSA室溫孵育(均1∶300)；細胞核染色用DAPI再次洗滌后貼片封片并用熒光顯微鏡觀察拍照及Image J軟件定量統(tǒng)計每個200倍視野中GFAP、IBA-1及MPO的熒光強度，計算血腫的上、下、左、右4個視野每mm2中目標細胞的平均熒光強度，作為該切片中目標細胞的細胞數量。

1.2.6小鼠行為學評估：隨機抽取4組小鼠各12只，于術后第1天、3天、7天、14天及28天，通過轉角試驗及改良神經功能缺陷評分表(NDS)[2]評估各組小鼠術后行為學情況，并記錄總分。具體評分細則：其中每項評分為0～4分，0分表示正常，4分表示神經功能缺陷非常嚴重(表1)。

表1 NDS觀察項目及評分細則

2 結果

2.1 小鼠死亡率假手術組及假手術+英夫利西單抗組無死亡，腦出血組小鼠死亡4只，腦出血+英夫利西單抗組小鼠死亡4只，死亡小鼠均在術后的第1天及第2天死亡，考慮該死亡率為造模導致的正常死亡率，與是否使用英夫利西單抗關系不大。

2.2 小鼠的體重及肛溫四組小鼠術后體重略下降，但很快呈正常生長發(fā)育趨勢，四組小鼠間體重變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；術后四組小鼠肛溫并無明顯變化且均在正常范圍內，四組小鼠間肛溫變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 各組小鼠腦出血周圍組織炎癥因子及c-Jun N末端激酶通路相關蛋白表達術后第1天，與假手術組小鼠相比，腦出血組血腫周圍TNF-α、IL-1β、IL-6表達明顯升高，假手術+英夫利西單抗組TNF-α、IL-1β、IL-6表達降低(P<0.05)；與假手術+英夫利西單抗組相比，腦出血+英夫利西單抗組小鼠術后第1天血腫周圍TNF-α、IL-1β、IL-6的表達明顯升高(P<0.05)；與腦出血組相比，腦出血+英夫利西單抗組小鼠術后第1天血腫周圍TNF-α、IL-1β、IL-6的表達有所降低(P<0.05)。這表明英夫利西單抗可能通過下調TNF-α、IL-1β、IL-6表達減輕腦出血后血腫周圍炎癥反應。具體見圖1、表2。

注：IL-6：白細胞介素6；IL-1β：白細胞介素1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；ACTIN：內參圖 1 四組小鼠腦出血周圍組織炎癥因子表達永圖(Western blot)

2.4 各組小鼠腦含水量比較術后第3天，各組小鼠手術側(左側)大腦半球含水量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，非手術側大腦半球(右側)和小腦的含水量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與假手術組小鼠相比，腦出血組、腦出血+英夫利西單抗組腦出血側(左側)的含水量均明顯增高(P<0.05)；與假手術+英夫利西單抗組及相比，腦出血+英夫利西單抗組小鼠術后第3天腦出血側(左側)的含水量均明顯增高(P<0.05)；與腦出血組相比，腦出血+英夫利西單抗組小鼠術后腦出血側(左側)的含水量減輕(P<0.05)。結果見表3。

表2 各組小鼠腦出血周圍炎癥因子相對表達 水平比較

表3 各組小鼠術后第3天腦含水量比較

2.5 腦出血小鼠血腫部位周圍小膠質細胞、星形膠質細胞的活化和中性粒細胞浸潤情況術后第3天，腦出血組及腦出血+英夫利西單抗組小鼠術后血腫周圍均有星形膠質細胞、小膠質細胞的活化及外周血中中性粒細胞的浸潤，如圖2所示，其中GFAP、IBA-1及MPO均被染為紅色熒光。與腦出血組相比，腦出血+英夫利西單抗組小鼠血腫周圍活化的星形膠質細胞、小膠質細胞及外周血中中性粒細胞的浸潤數量有所減少(P<0.05，表4)。上述結果表明英夫利西單抗可減少腦出血小鼠腦部血腫周圍的星形膠質細胞、小膠質細胞的活化及外周血中中性粒細胞的浸潤。

表4 腦出血小鼠血腫周圍活化的星形膠質細胞、小膠質細胞及外周血中中性粒細胞熒光強度比較

2.6 各組小鼠神經功能缺損評分結果具體見表5。四組各組小鼠術后第1天、3天、7天、14天和28天的NDS評分總分比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。假手術組第7天及第28天較第1天比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，假手術+英夫利西單抗組第7天、第14天及第28天較第1天比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組術后NDS評分整體呈快速恢復趨勢。腦出血組及腦出血+英夫利西單抗組小鼠NDS評分總分在術后第1天最高，第3天、7天、14天和28天的NDS評分均較第1天呈逐漸減低趨勢(P<0.05)，呈穩(wěn)步恢復的狀態(tài)。與假手術組小鼠相比，腦出血組、腦出血+英夫利西單抗組術后第1天、3天、7天、14天和28天的NDS評分總分明顯增高(P<0.05)；與假手術+英夫利西單抗組相比，腦出血+英夫利西單抗組小鼠術后第1天、3天、7天、14天和28天的NDS評分總分明顯增高(P<0.05)。與腦出血組相比，腦出血+英夫利西單抗組小鼠術后第3天、7天及14天的NDS評分總分比較有所降低 (P<0.05)，第1天及28天的NDS評分總分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在第28天，腦出血+英夫利西單抗組的NDS評分雖與腦出血組相比無統(tǒng)計學差異，但英夫利西單抗組仍有一定程度減低，病情有好轉趨勢，后續(xù)治療效果尚不明確，需增加觀察時間。

注：GFAP：膠質纖維酸性蛋白；IBA-1：鈣離子接頭蛋白；MPO：髓過氧化物酶圖 2 腦出血小鼠血腫部位周圍小膠質細胞、星形膠質細胞的活化和中性粒細胞浸潤情況(免疫熒光×200)

表5 各組小鼠NDS評分比較

3 討論

腦出血作為一個世界性的健康難題，具有高致殘率與高死亡率的特點，現今的原發(fā)性治療方法包括神經保護劑、調控血壓目標值、止血藥物和微創(chuàng)手術等，這些治療方法都不能完全解決腦出血早期腦損害，患者總體預后較差。由于目前針對原發(fā)性腦損傷的大型臨床試驗未取得預期的效果，研究腦出血繼發(fā)性損傷成為關注的焦點[4]。因此，進一步深入對腦出血損傷機制的研究，尋找安全有效治療腦出血的方法意義重大，探索腦出血新的治療領域仍有必要。已有研究表明，TNF-α、IL-1β及IL-6等炎癥因子都影響了腦出血急性期的病理生理過程[3]。英夫利昔單抗是一種嵌合單克隆抗體也是一種抗TNF-α的生物藥物，其可通過阻斷c-Jun N-末端激酶通路，進一步降低IL-1β及IL-6[17]等炎癥因子的釋放。

英夫利昔單抗已廣泛應用于炎癥性腸病、多發(fā)性硬化、急性移植物抗宿主病、急性腎小管間質性腎炎等自身免疫性疾病的治療[5-8]。已有研究證實，其能夠通過顯著減弱小膠質細胞的遷移，降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達來發(fā)揮神經保護作用[3]。但其在腦出血中的應用尚未有研究報道，因此，本研究對其進行探索。

本研究結果顯示，與腦出血組相比，腦出血+英夫利西單抗組小鼠血腫周圍TNF-α、IL-1β、IL-6表達有所降低，腦出血+英夫利西單抗組小鼠腦部血腫周圍的小膠質細胞、星形膠質細胞的活化及外周血中中性粒細胞的浸潤數量減少，即英夫利西單抗可能通過減輕腦出血小鼠腦部早期炎癥因子的滲出及血腫周圍的星形膠質細胞、小膠質細胞的活化、外周血中中性粒細胞的浸潤而對小鼠腦出血早期的病理生理過程有一定的改善。與腦出血組相比，腦出血+英夫利西單抗組小鼠第1天、第28天的NDS評分總分差異均無統(tǒng)計學意義，但術后第3天、第7天、第14天的NDS評分總分相比腦出血組有所降低，而第28天NDS評分雖無統(tǒng)計學差異，但仍有一定程度減低，病情有好轉趨勢，最終治療效果尚需增加觀察時間。

腦出血引起的腦損傷包括出血早期血腫機械壓迫和占位效應造成的原發(fā)性損傷，以及免疫炎癥、自由基等引起的繼發(fā)性損傷[4]。TNF-α、IL-1β及IL-6屬于前炎癥細胞因子，通常是由炎癥、腫瘤細胞和其他受損組織刺激巨噬細胞而產生，具有促進炎癥細胞黏附、浸潤的作用，在腦出血急性期的病理生理過程有一定的影響[3]，英夫利西單抗可能會通過降低TNF-α、IL-1β及IL-6而減輕腦出血急性期的炎癥反應，降低腦出血小鼠急性期神經功能損害，進而改善腦出血的預后。小膠質細胞是腦內廣泛分布的固有免疫細胞，占中樞神經系統(tǒng)細胞總數的10%，與腦出血后炎性反應密切相關[9、10]，小膠質細胞作為大腦最主要的免疫細胞，可以對大腦的損傷迅速作出反應[11]。已有研究表明，小膠質細胞有助于炎癥微環(huán)境的產生[12-14]，在腦的炎癥反應中，小膠質細胞一般起主導作用，星形膠質細胞和中性粒細胞起輔助作用，英夫利西單抗可能會通過減輕腦出血血腫周圍的小膠質細胞、星形膠質細胞的活化及外周血中中性粒細胞的浸潤而對腦出血早期有一定改善作用，促進神經功能的恢復。

對于急性腦出血的治療，在臨床實踐和試驗中針對血腫周圍水腫、炎癥、神經保護等，最近的一項數據薈萃分析顯示，血腫擴大與從癥狀發(fā)作到基線成像的時間、基線成像時的腦出血量和早期的抗炎治療顯著相關[15]。高達47%的患者在最初出血后的某個階段惡化，但大多在最初的24 h內[16]，因此腦出血患者的早期治療顯得至關重要。英夫利西單抗可通過降低TNF-α、IL-1β及IL-6等炎癥因子的滲出，減輕血腫周圍的小膠質細胞、星形膠質細胞的活化及外周血中中性粒細胞的浸潤對腦出血早期的治療提供一些指導。

綜上，本研究結果顯示英夫利昔單抗在小鼠腦出血治療中具有一定潛力。本研究使用英夫利昔單抗干預腦出血小鼠模型，發(fā)現其可引起腦血腫周圍炎癥因子表達下降、小膠質細胞活化數量降低，對小鼠神經功能具有改善作用，推測其可能通過減輕炎癥因子滲出及炎癥細胞浸潤而對腦出血早期有一定治療的作用。但未來英夫利西單抗應用于腦出血的臨床治療，仍需進一步的動物實驗及臨床試驗探討。