長(zhǎng)期高銅暴露通過影響線粒體自噬和細(xì)胞焦亡誘導(dǎo)大鼠肝組織損傷

梁文清，劉忠華,，常曉月，何 婷，陳 嘉，馬曉莉，唐兆新*，余文蘭,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510642)

銅是機(jī)體必需的微量元素之一，在增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)新陳代謝、參與解毒和造血等方面發(fā)揮重要作用[1]。自1945年銅被發(fā)現(xiàn)添加在飼料中對(duì)動(dòng)物具有促生長(zhǎng)作用后，含銅添加劑在養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，但是銅的過量或不合理使用不僅會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性作用，還會(huì)通過環(huán)境污染或食物鏈危害人類健康[2]。研究表明，過量的銅主要蓄積在肝組織，高水平銅暴露會(huì)造成肝細(xì)胞的出血、變性和壞死[3-4]，然而目前高銅對(duì)肝的損傷機(jī)制尚不清楚。

線粒體自噬是選擇性自噬的一種，可以將受損的線粒體及時(shí)清除，是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的重要途徑。正常生理?xiàng)l件下，線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)積極地發(fā)揮作用，保護(hù)線粒體免受應(yīng)激和損傷，當(dāng)線粒體發(fā)生損傷，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)開放，線粒體外膜膜電位丟失，線粒體自噬開始啟動(dòng)調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量。細(xì)胞焦亡是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，是Caspase 活化介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡的結(jié)果，表現(xiàn)為細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞腫脹并破裂，內(nèi)容物的釋放并引起強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)。線粒體自噬和細(xì)胞焦亡是程序性細(xì)胞死亡的不同形式，既是維持機(jī)體正常生命活動(dòng)的保護(hù)形式，也可能是機(jī)體發(fā)生損傷時(shí)的表現(xiàn)，它們可以被多種刺激共同激活，參與多種疾病的發(fā)生或發(fā)展，二者之間存在著復(fù)雜的相互調(diào)控，線粒體自噬和細(xì)胞焦亡通路在重金屬中毒性疾病中的研究也得到了廣泛關(guān)注。大量研究表明，線粒體自噬途徑和細(xì)胞焦亡參與了多種肝疾病的發(fā)生，并且在不同途徑誘導(dǎo)的肝損傷中發(fā)揮不同作用[5-6]。同時(shí)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高銅可以誘導(dǎo)線粒體自噬，促進(jìn)線粒體自噬相關(guān)基因的表達(dá)[7-8]。為進(jìn)一步探究高銅對(duì)大鼠肝毒性的作用機(jī)制，本研究通過對(duì)大鼠連續(xù)灌胃不同水平的銅建立銅的肝毒性模型，檢測(cè)線粒體自噬和細(xì)胞焦亡途徑相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，旨在為臨床銅中毒提供分子病理學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與設(shè)計(jì)

120只4周齡SPF級(jí)SD大鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為5組(每組24只)，以堿式氯化銅(tribasic copper chloride，TBCC)為銅源，灌胃銅含量分別為：0(對(duì)照組，灌胃不含銅的同體積分散劑溶液0.5%羧甲基纖維素鈉)、20(高銅Ⅰ組)、40(高銅Ⅱ組)、80(高銅Ⅲ組)、160 mg·kg-1(高銅 Ⅳ組)，各組大鼠自由飲水、采食，連續(xù)灌胃63 d。大鼠飼料符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(GB14924.3—2010)，基礎(chǔ)日糧中的銅含量為10 mg·kg-1。試驗(yàn)結(jié)束后，用1.5%戊巴比妥鈉按150 mg·kg-1腹腔注射安樂死，分離肝組織，用提前預(yù)冷的生理鹽水沖洗，吸干水后一部分組織用4%多聚甲醛溶液固定，剩余的組織立即儲(chǔ)存在-80 ℃下待用。本試驗(yàn)經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：2019e007)。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

TBCC來自北京金潤木豐生物營養(yǎng)科技有限公司。TRIzol、Prime ScriptRTMaster Mix購自TaKaRa公司；2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白一抗購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；蛋白二抗、預(yù)染Marker、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于廣州凱閣生物科技有限公司；蛋白定量測(cè)試盒購于南京建成生物工程研究所；多聚甲醛購于Sigma公司；切片石蠟、中性樹膠購于國藥集團(tuán)公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀ICP-MS，購自美國熱電公司；TDZ5-WS型冷凍離心機(jī)，購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；LightCycler480型熒光定量PCR儀，購自美國Bio-Rad公司；5200型凝膠成像系統(tǒng)，購自上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；Unique-R10型超純水儀，購自廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司；DM1000型光學(xué)顯微鏡，購自廣州德真科學(xué)儀器有限公司。

1.3 肝組織銅含量的測(cè)定

采集新鮮肝組織，將收集的組織用微波消解系統(tǒng)進(jìn)行消化，按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.268—2016《食品中多元素的測(cè)定》中ICP-MS法，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS分析樣品中的銅含量[9-10]。

1.4 肝組織病理學(xué)觀察

將組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中24 h，組織塊流水沖洗過夜，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片并烘干。二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木精核染，鹽酸酒精分色，自來水返藍(lán)，伊紅復(fù)染，酒精脫色脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠進(jìn)行封片，顯微鏡觀察組織病理變化。

1.5 透射電鏡觀察

各試驗(yàn)組肝組織切碎成小于1 mm3，用2.5%戊二醛固定，用0.1 mol·L-1PBS 緩沖液漂洗4次，每次漂洗15 min；再用1%鋨酸固定過夜后，再用0.1 mol·L-1PBS緩沖液漂洗4次，每次漂洗15 min； 乙醇進(jìn)行梯度脫水(30%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇)后，用100%丙酮進(jìn)行脫水2次，將丙酮與樹脂混合液(V/V=3/1)比例滲透4.5 h；丙酮與樹脂混合液(V/V=1/1)滲透過夜，再將丙酮與樹脂按1∶3的比例滲透7 h；用純樹脂進(jìn)行包埋過夜，用70 ℃聚合24 h。最后用超薄切片機(jī)修塊，切片，用醋酸雙氧鈾和與檸檬酸鉛雙染色，晾干后，美國FEI公司的Talos L120C型透射電鏡中觀察。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

所測(cè)基因序列從GenBank中獲得，選用管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，由上海生物工程有限公司(廣州合成部)合成，Primer Express 6.0軟件設(shè)計(jì)。引物序列如表1所示。TRIzol法提取肝總RNA，并用Nanodrop-2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的總濃度和純度，RNA反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，生成的cDNA用DEPC水稀釋10倍，采用染料法進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為10 μL：2×ChamQ SYBR premix Ex TaqTM5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

表1 基因名稱和引物序列

1.7 免疫印跡分析

取30 mg肝組織，RIPA裂解液(RIPA∶PSMF=100∶1)提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量，使用RIPA裂解液稀釋，稀釋后的樣品與4×Loading Buffer以3∶1比例混勻。SDS-PAGE凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白并轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育60 min，用發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行分析。所有組均進(jìn)行兩兩比較。采用單因素方差分析評(píng)價(jià)差異。數(shù)據(jù)以“平均值±SEM”表示(n=12)，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝組織銅含量結(jié)果

隨著灌胃銅濃度的升高，大鼠肝組織中的銅含量呈劑量依賴性增加，高銅Ⅳ組肝組織銅含量較對(duì)照組顯著上升(P<0.01，圖1)。

**. P<0.01；*. P<0.05。下同**. P<0.01; *. P<0.05. The same as below圖1 肝組織銅含量Fig.1 Cu content in liver

2.2 肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

肝組織病理切片HE染色見圖2。如圖2A所示，對(duì)照組的肝細(xì)胞排列整齊，以中央靜脈(central veins，CV)為中心，向四周呈放射狀排列，胞核明顯，門管區(qū)(portal area，PT)結(jié)構(gòu)完整。隨著銅含量的增加，門管區(qū)和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變，門管區(qū)小葉間靜脈上皮細(xì)胞出現(xiàn)脫落、管壁增厚、炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞空泡變性等變化。高銅Ⅱ組開始呈現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞排列紊亂，并出現(xiàn)肝細(xì)胞胞核溶解或消失、空泡變性(紅色箭頭)和出血(藍(lán)色箭頭)，PT小葉間靜脈上皮細(xì)胞逐漸脫落，特別是高銅Ⅳ組中的小葉間靜脈和小葉間膽管管壁明顯增厚，表現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(如圖2B～E)。結(jié)果表明，高水平的銅暴露會(huì)誘導(dǎo)肝組織出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)變化和病理學(xué)改變。

2.3 肝組織超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

由肝組織超微結(jié)構(gòu)(圖3)可知，銅處理組均出現(xiàn)不同程度的線粒體自噬，高銅Ⅱ組、高銅Ⅲ組出現(xiàn)明顯的線粒體自噬小體，對(duì)照組、高銅Ⅰ組、高銅Ⅱ組的線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)都比較正常，而高銅Ⅲ組和高銅Ⅳ組的線粒體出現(xiàn)線粒體空泡、變長(zhǎng)、腫脹，脊變少或消失，且高銅Ⅳ組線粒體數(shù)量減少，極少觀察到線粒體自噬小體。

2.4 高銅對(duì)肝細(xì)胞線粒體自噬的影響

如圖4所示，隨著銅暴露劑量增加，線粒體自噬相關(guān)基因Parkin、Pink1和LC3的mRNA和蛋白表達(dá)水平表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，底物蛋白p62的表達(dá)趨勢(shì)相反。高銅Ⅱ組和高銅Ⅲ組自噬相關(guān)基因PINK1、Parkin和LC3的mRNA和蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，且PINK1和LC3的表達(dá)量與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，而當(dāng)銅含量超過80 mg·kg-1時(shí)，高銅Ⅳ組自噬相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于高銅Ⅱ組(P<0.05)，p62的表達(dá)量表現(xiàn)為先下降后上升。結(jié)果表明，適量的銅可以激活自噬，但長(zhǎng)期高水平的銅暴露會(huì)抑制自噬通路。

2.5 高銅對(duì)肝細(xì)胞焦亡的影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，隨著肝組織中銅含量的增加，細(xì)胞焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白表達(dá)量呈劑量依賴性增加，與對(duì)照組相比，高銅Ⅲ組焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05)，高銅Ⅲ組NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-1β的蛋白表達(dá)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；與高銅Ⅲ組相比，高銅Ⅳ的Caspase-1、GSDMD和IL-18的mRNA相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

A～E. 分別為對(duì)照組(0 mg·kg-1)、高銅 Ⅰ 組(20 mg·kg-1)、高銅 Ⅱ 組(40 mg·kg-1)、高銅 Ⅲ 組(80 mg·kg-1)和高銅 Ⅳ組(160 mg·kg-1)。a. 不同組門管區(qū)病理變化(100×)，CV. 中央靜脈；PT. 門管區(qū)。b. 不同組的肝細(xì)胞病理學(xué)改變(400×)；黑色箭頭指向細(xì)胞核；紅色箭頭指向空泡變性；藍(lán)色箭頭指向肝出血A-E. Represent control group (0 mg·kg-1), high level copper group I (20 mg·kg-1), high level copper group Ⅱ (40 mg·kg-1), high level copper group Ⅲ (80 mg·kg-1) and high level copper group Ⅳ (160 mg·kg-1), respectively. a. Pathological changes of portal area in different groups (100×); CV. Central vein; PT. Portal area. b. Pathological changes of hepatocytes in different groups (400×); Black arrows point to nucleus; Red arrows point to vacuolar degeneration; Blue arrows point to liver hemorrhage圖2 肝組織病理切片HE染色圖Fig.2 Pathological section of liver tissues

A～E. 分別為對(duì)照組(0 mg·kg-1)、高銅 Ⅰ 組(20 mg·kg-1)、高銅 Ⅱ 組(40 mg·kg-1)、高銅 Ⅲ 組(80 mg·kg-1)和高銅 Ⅳ組(160 mg·kg-1)。N. 細(xì)胞核；M. 線粒體；黑色箭頭指向線粒體自噬小體A-E. Represent control group (0 mg·kg-1), high level copper group I (20 mg·kg-1), high level copper group Ⅱ (40 mg·kg-1), high level copper group Ⅲ (80 mg·kg-1) and high level copper group Ⅳ (160 mg·kg-1), respectively. N. Nucleus; M. Mitochondria; Black arrows point to mitophagosomes圖3 肝組織超微結(jié)構(gòu)圖(13 500×)Fig.3 Changes in ultrastructure of liver tissue of rats in each group (13 500×)

A～D. Parkin、Pink1 、LC3B、p62的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；E. Parkin、PINK1、LC3B、p62和內(nèi)參β-actin的蛋白條帶；F～I(xiàn). Parkin、PINK1、LC3B和p62的蛋白相對(duì)表達(dá)分析。P<0.001，下同A-D. Relative mRNA expression of Parkin, PINK1, LC3B and p62; E. Protein bands of Parkin, PINK1, LC3B, p62 and internal reference β-actin; F-I. The analysis of protein expression of Parkin, PINK1, LC3B and p62. P<0.001, the same as below圖4 不同水平銅暴露對(duì)大鼠肝線粒體自噬的影響Fig.4 Effect of different levels of copper exposure on mitochondrial autophagy in rat liver

A～E. NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；F. NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β及內(nèi)參actin和β-actin的蛋白條帶；G-J. NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β的蛋白相對(duì)表達(dá)分析A-E. Relative mRNA expression of NLRP3, Caspase-1, GSDMD, IL-1β and IL-18; F. Protein bands of NLRP3, Caspase-1, GSDMD, IL-1β, actin and β-actin; G-J. The analysis of protein expression of NLRP3, Caspase-1, GSDMD and IL-1β圖5 不同水平銅暴露對(duì)大鼠肝細(xì)胞焦亡的影響Fig.5 Effect of different levels of copper exposure on pyroptosis in rat liver

3 討 論

銅是一種常見的有毒重金屬，廣泛分布于各種流域、土壤、空氣等環(huán)境中，通過食物鏈的累積和放大，最終對(duì)人和動(dòng)物的健康造成威脅[11-12]。銅可通過血液循環(huán)，長(zhǎng)期銅暴露可對(duì)機(jī)體肝、腎、腦組織等器官和系統(tǒng)造成不可逆的毒性作用。雷鳴等[13]和趙春雨等[14]研究發(fā)現(xiàn)，銅會(huì)在肝組織蓄積并造成實(shí)質(zhì)損傷。研究發(fā)現(xiàn)，雞攝入過量納米氧化銅會(huì)造成肝局部出血[15]；大鼠連續(xù)食用高銅飼料(700 mg·kg-1)28 d，肝出現(xiàn)變性、纖維增生和炎性細(xì)胞浸潤[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著銅暴露劑量的增加，各組大鼠肝組織銅含量也隨之增加，且攝入過量的銅會(huì)對(duì)肝造成損傷。在正常生理耐受范圍內(nèi)，飼養(yǎng)63 d，高銅Ⅱ組和高銅Ⅲ組銅含量升高不明顯，機(jī)體通過正常的代謝可把多余的銅排出體外，但當(dāng)添加含量達(dá)到160 mg·kg-1時(shí)，過量的銅會(huì)大量蓄積在肝中，并造成肝細(xì)胞病變，發(fā)生大面積空泡變性，胞核濃縮甚至消失，門管區(qū)結(jié)締組織增生。

線粒體自噬是控制線粒體質(zhì)量的重要機(jī)制，可以清除細(xì)胞內(nèi)受損或多余的線粒體，與多種蛋白有關(guān)，其中Pink1/Parkin信號(hào)通路是線粒體自噬的經(jīng)典途徑[17-18]。線粒體正常時(shí)，Pink1通過線粒體外膜和內(nèi)膜復(fù)合物轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜，繼而被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解；線粒體在受到損傷時(shí)，內(nèi)膜復(fù)合物功能障礙，通透性發(fā)生改變并去極化，Pink1由線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)到線粒體外膜，Pink1在線粒體外膜集聚并招募胞質(zhì)的Parkin轉(zhuǎn)移至線粒體，Parkin通過磷酸化作用與其結(jié)合，進(jìn)而泛素化線粒體外膜蛋白，使線粒體被“標(biāo)記”，啟動(dòng)線粒體自噬[19-20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著銅劑量的增加，肝組織中Pink1和Parkin的mRNA和蛋白表達(dá)水平隨之增加，表明銅可誘導(dǎo)肝組織發(fā)生自噬，但隨著銅含量的進(jìn)一步升高，Pink1和Parkin 的mRNA和蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明線粒體自噬過程受到抑制或阻滯。微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3 (protein light chain3，LC3)通過接頭蛋白p62與被標(biāo)記的線粒體結(jié)合，分隔膜繼續(xù)彎曲延伸形成線粒體自噬體，最后與溶酶體融合并被降解[21]。自噬發(fā)生時(shí)，胞漿型(LC3B-Ⅰ)會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば?LC3B-Ⅱ)，而p62作為自噬底物，表達(dá)量會(huì)下降。因此，p62和LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值的可作為評(píng)估自噬流的標(biāo)志蛋白[22]。本試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，隨著銅暴露水平的增加，LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)量增加，而p62蛋白表達(dá)下降，而隨著銅的進(jìn)一步濃度加大，LC3B-Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白表達(dá)結(jié)果表現(xiàn)相反的趨勢(shì)，表明適量的銅可以促進(jìn)整個(gè)自噬過程的發(fā)生，但高水平的銅會(huì)抑制自噬的發(fā)生。推測(cè)銅的濃度已超過生理耐受范圍，銅對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用過強(qiáng)，導(dǎo)致線粒體功能障礙，線粒體自噬過程已無法完全抵抗銅誘導(dǎo)的損傷，這與Yang等[23-24]的研究結(jié)果一致。

細(xì)胞焦亡是另一種細(xì)胞程序性死亡的方式，細(xì)胞受到內(nèi)源性和外源性信號(hào)的刺激，與相關(guān)蛋白組裝成炎性小體，進(jìn)而激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割pro-IL-1β和pro-IL-18，產(chǎn)生成熟的IL-1β和IL-18，后者作為炎癥介質(zhì)，能誘導(dǎo)其他免疫細(xì)胞的聚集，進(jìn)而放大炎癥反應(yīng)；另一方面，Caspase-1切割GSDMD使其產(chǎn)生具有活性的N端結(jié)構(gòu)域，活化后的GSDMD-N與細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇特異性結(jié)合，形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變，大量水分子進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞腫脹破裂而死[25-26]。其中NLRP3炎性小體是目前研究比較廣泛的一種炎性小體，由NLRP3受體、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和 pro-Caspase-1 構(gòu)成，LRP3炎性小體激活產(chǎn)生活化的Caspase-1，從而誘導(dǎo)GSDMD蛋白的裂解，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，銅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡，用不同濃度的硫酸銅處理雞原代肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)顯著上調(diào)；NAC與銅聯(lián)合作用于肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)焦亡相關(guān)基因表達(dá)顯著下降，表明銅可通過活性氧誘導(dǎo)雞肝細(xì)胞發(fā)生焦亡[27]。由此可見，銅可以通過激活NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致肝炎性反應(yīng)，發(fā)揮銅的肝毒性效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著銅暴露濃度的升高，肝組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的基因表達(dá)水平升高，NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-1β的蛋白表達(dá)升高。試驗(yàn)結(jié)果提示銅通過誘導(dǎo)NLRP3炎性小體產(chǎn)生，激活Caspase-1，促進(jìn)IL-1β和IL-18釋放，從而GSDMD蛋白表達(dá)增加，引起肝細(xì)胞焦亡，對(duì)肝造成損傷。

近年來的研究表明，自噬與焦亡之間存在復(fù)雜的聯(lián)系。研究表明，自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin-1 的缺失可以激活炎癥小體，同時(shí)增強(qiáng)了Caspase-1的激活和IL-1β和IL-18的分泌；誘導(dǎo)線粒體功能障礙可通過活化NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，而阻斷線粒體功能障礙可以抑制NLRP3炎癥小體活化，減輕細(xì)胞損傷[28-30]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)灌胃銅濃度為80 mg·kg-1時(shí)，肝組織線粒體自噬水平開始下降，而細(xì)胞焦亡水平繼續(xù)升高，表明線粒體自噬的抑制可能可以激活細(xì)胞焦亡。然而當(dāng)銅濃度到達(dá)160 mg·kg-1時(shí)，線粒體自噬被進(jìn)一步抑制，但細(xì)胞焦亡水平并沒有繼續(xù)升高，也呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，推測(cè)高水平的銅可能通過抑制自噬和焦亡進(jìn)一步造成機(jī)體的損傷，但是具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。