高效赤紅球菌協(xié)同CpG ODN增強(qiáng)雞禽流感疫苗的免疫效力

潘偉雄，陳鈺怡，趙锃玨，馮賽祥，仇微紅，葉賀佳，張玲華*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；3.廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司， 廣州 511300)

CpG序列是一條含有未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸的微生物單鏈DNA片段,能夠通過Toll樣受體9(TLR 9)的識(shí)別刺激先天性免疫反應(yīng)[1]。CpG ODN是人工合成的CpG序列(synthetic oligodeoxynucleotide containing CpG motifs，簡(jiǎn)稱CpG ODN)，目前，在臨床和疫苗應(yīng)用中作為免疫增強(qiáng)劑[2-3]。前期，作者實(shí)驗(yàn)室在雞、魚和豬上對(duì)CpG ODN和CpG質(zhì)粒進(jìn)行了大量研究,有如下發(fā)現(xiàn)：CpG ODN能提升雞特異性免疫[4]；CpG ODN常溫和低溫下均能保護(hù)魚類免受細(xì)菌感染[5]；CpG質(zhì)粒也與ODN有同樣提升動(dòng)物體抗感染的先天性和適應(yīng)性免疫[6]。近來，三葉草生物公司研發(fā)的CpG聯(lián)合鋁佐劑的新冠疫苗的Ⅰ期臨床試驗(yàn)報(bào)告顯示，該疫苗可引發(fā)針對(duì) SARS-CoV-2 的強(qiáng)大體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[7]。以上研究證實(shí)了CpG制劑能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生顯著的免疫反應(yīng)，而長(zhǎng)期廣泛的應(yīng)用印證了CpG ODN具有極高的安全性。然而，CpG ODN作為禽用疫苗佐劑的生產(chǎn)成本高昂，即使采用更為廉價(jià)CpG質(zhì)粒，大規(guī)模生產(chǎn)中依舊無法負(fù)擔(dān)，這嚴(yán)重阻礙了CpG制劑在畜牧養(yǎng)殖中的推廣應(yīng)用。有研究表明，CpG制劑聯(lián)合其他免疫刺激物可以提升其作用效果[8]，因而，在本研究中，作者希望尋求生產(chǎn)成本低的生物制劑與CpG制劑協(xié)同，在實(shí)現(xiàn)良好的免疫刺激效應(yīng)的同時(shí)，減少CpG制劑的使用量，最終使成本可控。

赤紅球菌(Rhodococcusruber)是一類專性好氧革蘭陽性菌，能被負(fù)責(zé)識(shí)別細(xì)菌的TLR2來刺激機(jī)體免疫[8]。早在1984年，珊瑚紅球菌(Phodococcuscorrallina,RC)的細(xì)胞壁成分就被報(bào)道在動(dòng)物體內(nèi)具有抗腫瘤的免疫特性[9]。此外，還有研究顯示，赤紅球菌提取物能夠抵抗細(xì)菌和抗病毒感染，從而達(dá)到提高機(jī)體免疫的作用[10]。同時(shí)，相較于通過細(xì)菌單一成分給藥引發(fā)的應(yīng)答，通過完整菌體細(xì)胞的給藥具有增強(qiáng)Th1(T helper)應(yīng)答而不改變Th2引起的細(xì)胞免疫應(yīng)答的優(yōu)點(diǎn)，其調(diào)節(jié)作用還可以長(zhǎng)期持續(xù)[11]。而且，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，赤紅球菌作為免疫佐劑使用具有非特異性地增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高抗體峰值水平，延長(zhǎng)抗體維持期，增強(qiáng)動(dòng)物疫苗的免疫效果[12-13]。除了以上有關(guān)赤紅球菌良好的免疫刺激功效的報(bào)道之外，作者還考慮到赤紅球菌的生長(zhǎng)速度快、易培養(yǎng)，產(chǎn)業(yè)化成本低，在生產(chǎn)上具有極大的優(yōu)勢(shì)。另外，研究指出，TLR2和TLR9能協(xié)同刺激免疫反應(yīng)[14-16]，同時(shí)，哺乳動(dòng)物TLR9/禽類動(dòng)物TLR21存在著同源關(guān)系和功能相似性[17-18]，推斷赤紅球菌可以作為CpG制劑的聯(lián)合制劑使用來提升禽類疫苗的功效。

禽流感是由禽流感病毒 (avian influenza virus，AIV)引起的一種急性、高度接觸性的人獸共患傳染病[19]，如果在養(yǎng)殖早期不能對(duì)其進(jìn)行有效控制，將會(huì)在禽群中迅速傳播和繁殖，造成經(jīng)濟(jì)巨大損失和危害公共衛(wèi)生安全。禽流感疫苗對(duì)于我國(guó)禽流感的防控起著至關(guān)重要的作用。目前，在疫苗中常使用的佐劑有鋁佐劑、油乳佐劑、脂質(zhì)體佐劑、微生物類佐劑等，它們各有利弊，主要存在著免疫類型單一、抗體的產(chǎn)生時(shí)間長(zhǎng)和持續(xù)時(shí)間短、品種間和佐劑間效果不確切等問題[20]。近年來，免疫調(diào)節(jié)分子類佐劑(CpG ODN)，因其具有的免疫調(diào)節(jié)作用以及顯著的安全性[21]，日益受到人們的重視。隨著社會(huì)發(fā)展，禽類養(yǎng)殖場(chǎng)不斷規(guī)模化和產(chǎn)業(yè)化，成本低、免疫效力高、持久性良好是禽流感疫苗佐劑的發(fā)展趨勢(shì)。因此，在本研究中首次將CpG ODN 和赤紅球菌聯(lián)合使用作為禽流感疫苗的佐劑，希望在進(jìn)一步強(qiáng)化禽流感疫苗的免疫應(yīng)答效果的基礎(chǔ)上，既提高疫苗免疫持久性、安全性，又降低CpG ODN的使用成本。本研究檢測(cè)了赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復(fù)合佐劑對(duì)于提升禽流感疫苗的抗原特異性體液免疫和細(xì)胞免疫水平的能力，并通過檢測(cè)細(xì)胞表面受體的表達(dá)情況來探索其提升免疫功效的機(jī)制。此外，還研究了該復(fù)合佐劑對(duì)于系統(tǒng)和局部免疫的效果。本研究確認(rèn)赤紅球菌的共刺激能在降低CpG ODN用量的同時(shí)，進(jìn)一步強(qiáng)化CpG ODN的免疫增強(qiáng)功效。本研究為CpG制劑作為禽類疫苗佐劑提供高效且成本可控的應(yīng)用策略奠定了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)雞 1日齡普通黃羽肉雞，購自廣州華農(nóng)正大禽業(yè)有限公司，于廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心養(yǎng)至10日齡，使試驗(yàn)雞適應(yīng)該養(yǎng)殖環(huán)境。

1.1.2 試驗(yàn)抗原 H5N2亞型重組禽流感病毒rSD57株抗原由廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司制備及提供，血凝效價(jià)大于28。

1.1.3 試驗(yàn)佐劑 CpG ODN，實(shí)驗(yàn)室保存[22]；赤紅球菌(Rhodococcusruber)，菌株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院廖明教授提供，并按相關(guān)專利的方式制備[23]。

1.2 疫苗制備與分組情況

1.2.1 試驗(yàn)一 取10日齡普通黃羽肉雞100只，隨機(jī)分成5組，每組20只，分別經(jīng)頸部皮下注射以下免疫佐劑—疫苗組合，0.33 mL·只-1。每組處理3次重復(fù)，所有試驗(yàn)雞只免疫1次。

表1 免疫佐劑—疫苗分組情況

在接種后第7、14、21、28、35日，分別從雞群中隨機(jī)抽取5只進(jìn)行頸部采血檢測(cè)抗體滴度；接種后第0、7、14、21日，每組隨機(jī)選3只雞，宰殺取脾和支氣管。第0、7、14、21日所取的各組部分脾樣品用于細(xì)胞增殖試驗(yàn)測(cè)淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)和檢測(cè)特異性免疫產(chǎn)生的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的相對(duì)表達(dá)量；第0、7日所取的另一部分脾樣品快速冷凍于液氮中，在-80 ℃保存至分離RNA，檢測(cè)IL-12、IFN-γ、TLR2和TLR21的相對(duì)表達(dá)量。第0、7日所取的支氣管樣品也快速冷凍于液氮后在-80 ℃保存至分離RNA，檢測(cè)IL-12和IFN-γ的相對(duì)表達(dá)量。每組處理3次重復(fù)。

1.2.2 試驗(yàn)二 取10日齡普通黃羽肉雞20只，隨機(jī)分成4組，每組5只，分別經(jīng)頸部皮下注射相應(yīng)的疫苗，0.33 mL·只-1。每組處理3次重復(fù)，所有試驗(yàn)雞只免疫1次。4組所注射的免疫佐劑—疫苗組合分別是PBS組、對(duì)照組、CpG+赤紅球菌疫苗組和0.5CpG+赤紅球菌疫苗組。前三組的制備方法與試驗(yàn)一中的相同；50%CpG+赤紅球菌疫苗組疫苗制備方法：取3 mL rSD57抗原、0.75 mL無菌水和0.75 mLCpG ODN(60 μg·mL-1)，再與10.5 mL礦物油ISA71混合，赤紅球菌按0.5 mg·mL-1水相進(jìn)行添加(約2.25 mg)，用高剪切乳化機(jī)乳化10 min。在疫苗接種后第14、35天，各組分別采血測(cè)抗體滴度(HI)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抗體滴度 進(jìn)行HI試驗(yàn)。

試驗(yàn)一，各組接種后第7、14、21、28、35天，分別采血分離血清。制備1%雞紅細(xì)胞懸液，用H5N2亞型重組禽流感病毒rSD57株血凝抑制抗原制備4單位抗原(HAU)；在96孔板的1～11孔中加入25 μL PBS，第12孔中加入50 μL PBS；吸取25 μL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸25 μL于第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25 μL棄去；1～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液25 μL，靜置30 min；每孔加入25 μL 1 %雞紅細(xì)胞懸液，混勻并封板，靜置30 min(可適當(dāng)延長(zhǎng))，直至對(duì)照組(第11孔)紅細(xì)胞呈明顯的紐扣狀沉于孔底，每組至少設(shè)3個(gè)重復(fù)。結(jié)果以完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，用2的指數(shù)表示[24]。每組處理3次重復(fù)。

試驗(yàn)二，各組接種后第14、35天，分別采血分離血清。按上述方法檢測(cè)抗體滴度。每組處理3次重復(fù)。

1.3.2 細(xì)胞增殖和特異性IFN-γ和IL-4誘生試驗(yàn) 取試驗(yàn)一疫苗接種后第0、7、14、21天各組的脾臟樣品，制備單細(xì)胞懸液，利用淋巴細(xì)胞分離液(翌圣，廣州)分離脾淋巴細(xì)胞，用不含酚紅指示劑，含10%胎牛血清(Gbico，美國(guó))、0.15%碳酸氫鈉和1%抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gbico，美國(guó))調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液達(dá)2.5 × 106個(gè)細(xì)胞·mL-1，細(xì)胞懸液以100 μL·孔-1加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入PBS作為陰性對(duì)照?？乖越K濃度10 μg·mL-1加入，每組重復(fù)3次，在37 ℃、5%CO2孵育24 h。其中，一半的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)，另一半細(xì)胞保留作為后續(xù)試驗(yàn)的材料。每孔加入20 μL MTT(5 mg·mL-1，華奇盛，廣州)，在37 ℃、5%CO2二次孵育6 h。離心機(jī)離心除去未反應(yīng)的MTT,然后每孔加入100 μL二甲亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570 nm讀取吸光值。淋巴細(xì)胞增殖以刺激指數(shù)(SI)表示，SI定義：試驗(yàn)孔的平均OD值/陰性對(duì)照孔的平均OD值[22]。每組處理3次重復(fù)。

1.3.3 熒光定量PCR 把按上述細(xì)胞增殖試驗(yàn)操作培養(yǎng)好的細(xì)胞懸液(未加MTT和DMSO)和-80 ℃冷凍保存的脾和支氣管樣品提取RNA，然后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按試劑盒說明書操作(RNA提取試劑盒，翌圣，廣州；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，碧云天，上海)；利用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫,使用β-actin對(duì)每個(gè)靶基因(引物見表2)的值進(jìn)行歸一化處理。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算表達(dá)值[25]。

表2 本研究中熒光定量PCR中使用到的引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復(fù)合佐劑提升系統(tǒng)免疫應(yīng)答

2.1.1 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN提升抗原特異性體液免疫應(yīng)答 為了直觀地了解不同免疫佐劑——疫苗組合的免疫效力，試驗(yàn)一注射疫苗后第7、14、21、28、35天，對(duì)各組分別采血進(jìn)行HI試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1)，與對(duì)照組相比，自第14天起，各佐劑的抗體滴度都有明顯的上升趨勢(shì)，而赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的效果最顯著；在第35天，與對(duì)照組和CpG佐劑疫苗組相比，赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的抗體滴度都有高度顯著性差異(P<0.01)。這些數(shù)據(jù)都表明，赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN介導(dǎo)了更強(qiáng)的特異性體液免疫應(yīng)答且抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。

組間差異，*.P<0.05，**.P<0.01*. P<0.05, **. P<0.01, vs other groups圖1 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN提升疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度水平Fig.1 Rhodococcus combined with CpG ODN enhances vaccine-induced antibody titers

2.1.2 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN提升抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答 研究指出，禽流感疫苗單獨(dú)使用產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫水平不高，需要輔助遞送物質(zhì)或佐劑來誘生良好的細(xì)胞免疫，進(jìn)而提升疫苗免疫效果[29]。因而，既能夠誘導(dǎo)體液免疫又能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的疫苗是研究人員的普遍追求。于是，作者對(duì)接種后不同時(shí)間分離出的脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)SI值(圖2A)，并給予二次的抗原刺激，檢測(cè)其特異性細(xì)胞免疫產(chǎn)生的IFN-γ(圖2B)和IL-4(圖2C)的相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組相比，CpG+赤紅球菌佐劑疫苗組中IFN-γ在第14、21天極顯著上調(diào)(P<0.01),Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4略有下降但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SI指數(shù)的比較中，在第7、21天，CpG佐劑疫苗組和赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的SI值均高于對(duì)照組，且赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的SI峰值更高，與對(duì)照組差異更顯著；盡管第14天赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的SI指數(shù)較CpG佐劑疫苗組低，但就赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的整體表現(xiàn)，并綜合IFN-γ上調(diào)結(jié)果來看，赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN發(fā)揮了更良好的細(xì)胞免疫刺激效果。疫苗抗原的免疫應(yīng)答可分為Th1型和Th2型，IFN-γ/IL-4比值(圖2D)反映Th1型免疫的相對(duì)強(qiáng)度，數(shù)值升高，Th1型免疫增強(qiáng)。該比值結(jié)果顯示，赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組在第14、21日時(shí)，IFN-γ/IL-4比值較對(duì)照組更高, 表明聯(lián)合使用赤紅球菌和CpG ODN作為疫苗佐劑可誘導(dǎo)更強(qiáng)的Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而提高疫苗整體的免疫調(diào)節(jié)功能。

A.脾細(xì)胞的刺激指數(shù)(SI)；B. IL-4的相對(duì)表達(dá)量; C. IFN-γ的相對(duì)表達(dá)量；D. IFN-γ/IL-4的比值。組間差異，*.P<0.05，**.P<0.01A. Stimulation index (SI); B. The relative expression of IL-4; C. The relative expression of IFN-γ; D. The ratio of IFN-γ/IL-4. *. P<0.05, **. P<0.01, vs other groups圖2 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN刺激脾細(xì)胞增殖和Th1型免疫反應(yīng)Fig.2 Rhodococcus combined with CpG ODN stimulates proliferation of spleen cells and Th1-type immune response

2.2 赤紅球菌與CpG ODN的協(xié)同關(guān)系

2.2.1 赤紅球菌與CpG ODN協(xié)同上調(diào)TLR2和TLR 21的表達(dá)量 Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)型抗原識(shí)別受體，既可以參與固有免疫，又可以連通適應(yīng)性免疫和固有免疫之間的關(guān)系，而且還參與抗病毒免疫反應(yīng)[30]。TLR2是動(dòng)物體內(nèi)識(shí)別細(xì)菌的關(guān)鍵受體，TLR21是雞體內(nèi)識(shí)別CpG ODN的受體，作者通過檢測(cè)疫苗接種后各組這兩種受體的表達(dá)量來探索赤紅球菌和CpG ODN協(xié)同的關(guān)系。結(jié)果顯示(圖3)，在第7天赤紅球菌疫苗佐劑組較對(duì)照組會(huì)上調(diào)TLR2表達(dá)量且差異極顯著(P<0.01)，而TLR21表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)；CpG疫苗佐劑組較對(duì)照組會(huì)極顯著上調(diào)TLR21表達(dá)量(P<0.01)，而對(duì)TLR2表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)；CpG+赤紅球菌佐劑疫苗組與對(duì)照組相比，TLR2和TLR21表達(dá)量均有明顯上調(diào)，差異極顯著(P<0.01)。由此推斷，此前得到的良好的結(jié)果，可能是由于這兩種免疫刺激物分別通過TLR2和TLR21的識(shí)別，同時(shí)來增強(qiáng)免疫應(yīng)答的。但可以肯定的是，CpG ODN與赤紅球菌之間存在潛在的協(xié)同關(guān)系，具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

A. TLR21的相對(duì)表達(dá)量；B.TLR2的相對(duì)表達(dá)量。組間差異，*.P<0.05，**.P<0.01A. The relative expressions of TLR21; B. The relative expressions of TLR2. *. P<0.05, **. P<0.01, vs other groups圖3 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN通過提高TLR2和TLR21的表達(dá)形成協(xié)同F(xiàn)ig.3 Rhodococcus combined with CpG ODN forms synergy by increasing the expression of TLR2 and TLR21

2.2.2 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN強(qiáng)化局部免疫 動(dòng)物體的黏膜是接觸到病原體的第一道防線，提升疫苗的局部免疫反應(yīng)能力是一個(gè)重要的優(yōu)化免疫策略[31]。支氣管是動(dòng)物體的重要黏膜之一，是面對(duì)禽流感病毒的“前沿”部位[32]，作者選擇雞的支氣管檢測(cè)其Th1型相關(guān)細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)量，檢驗(yàn)該復(fù)合佐劑的局部免疫刺激效果。如圖4結(jié)果顯示，CpG+赤紅球菌疫苗組的IL-12和IFN-γ的相對(duì)表達(dá)量有高度顯著差異(P<0.01vs. vaccine control)，也優(yōu)于單獨(dú)的CpG ODN佐劑組。這些結(jié)果表明，赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN能夠強(qiáng)化動(dòng)物體局部產(chǎn)生的Th1型免疫反應(yīng)，在“第一道防線”就發(fā)揮抗病毒功能。

A.IL-12的相對(duì)表達(dá)量；B.IFN-γ的相對(duì)表達(dá)量。組間差異，*.P<0.05，**.P<0.01A. The relative expressions of IFN-γ; B. The relative expressions of IL-12. *. P<0.05, **. P<0.01, vs other groups圖4 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復(fù)合佐劑刺激局部免疫反應(yīng)Fig.4 Rhodococcus combined with CpG ODN compound adjuvant stimulates local immune response

2.2.3 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN強(qiáng)化系統(tǒng)免疫 研究指出，局部免疫反應(yīng)的發(fā)生依賴于系統(tǒng)免疫的協(xié)助和維持[33]，脾中免疫細(xì)胞接受抗原刺激之后可以參與到局部免疫的抗外源物質(zhì)的反應(yīng)之中[34]。因此，檢測(cè)了第0、7天所取脾中細(xì)胞的IFN-γ和IL-12的相對(duì)表達(dá)水平，來檢驗(yàn)赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN聯(lián)合佐劑刺激系統(tǒng)免疫的效果。從試驗(yàn)結(jié)果來看(圖5)，赤紅球菌+CpG佐劑疫苗組的IFN-γ和IL-12表達(dá)量在第7天大幅上調(diào)，與對(duì)照組和CpG疫苗相比差異極顯著(P<0.01)，表明了該復(fù)合佐劑能誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫，并產(chǎn)生與局部相同的Th1型免疫反應(yīng)，更有利于病毒清除。

A.IL-12的相對(duì)表達(dá)量；B. IFN-γ的相對(duì)表達(dá)量。組間差異，*.P<0.05，**.P<0.01A. The relative expressions of IL-12; B. The relative expressions of IFN-γ. *. P<0.05, **. P<0.01, vs other groups圖5 赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復(fù)合佐劑刺激全身免疫反應(yīng)Fig.5 Rhodococcus combined with CpG ODN compound adjuvant stimulates systematic immune response

2.3 赤紅球菌聯(lián)合半劑量CpG ODN的免疫佐劑效果

CpG ODN的安全性是公認(rèn)的，但是作為動(dòng)物疫苗來說價(jià)格高、成本貴，而赤紅球菌價(jià)格低廉、易于培養(yǎng)，同時(shí)，從上面的數(shù)據(jù)結(jié)果可以得知，赤紅球菌和CpG ODN之間存在協(xié)同機(jī)制，能夠提高疫苗的免疫效力和免疫持久性。作者想知道能否通過赤紅球菌來彌補(bǔ)降低CpG ODN用量帶來的免疫效果損失，在保證免疫效果的同時(shí)又降低成本。因此，在試驗(yàn)二中設(shè)計(jì)了50%劑量的CpG+赤紅球菌佐劑疫苗試驗(yàn)組，通過檢測(cè)各組在第14、35天的抗體滴度來檢驗(yàn)疫苗的免疫效果。結(jié)果顯示(圖6)，全劑量和半劑量的CpG ODN分別與等量的赤紅球菌聯(lián)合作為疫苗佐劑，在第14、35天的抗體滴度并無顯著差異(P>0.05)，證實(shí)了此前的猜想。

3 討 論

當(dāng)前，常用的禽流感疫苗存在著免疫效率低、免疫保護(hù)維持時(shí)間短、細(xì)胞免疫水平低等問題[35]，而疫苗佐劑被認(rèn)為是提高疫苗免疫效率并豐富免疫類型的解決策略[36]。免疫佐劑的類型多樣、制價(jià)不盡相同，其中具備卓越安全性的免疫調(diào)節(jié)分子類佐劑(CpG ODN)備受關(guān)注。降低CpG ODN作為疫苗佐劑的制備和使用成本，是使之在養(yǎng)殖業(yè)中推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。

CpG ODN在禽類動(dòng)物中經(jīng)由TLR21的識(shí)別，可以誘發(fā)動(dòng)物體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[2-3,37]。它被廣泛應(yīng)用于畜牧疫苗佐劑，而且用于人類疫苗的制劑也已經(jīng)問世。此外，在作者此前的研究發(fā)現(xiàn)了CpG ODN作為疫苗佐劑具有刺激特異性免疫的功效。大量的動(dòng)物試驗(yàn)研究表明，相較于疫苗單獨(dú)使用，添加佐劑能誘導(dǎo)更強(qiáng)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，提升疫苗的免疫效力[29]。同樣的，在本研究中，通過HI試驗(yàn)、細(xì)胞增殖試驗(yàn)和檢測(cè)IFN-γ和IL-4的相對(duì)表達(dá)量再次確證了：CpG ODN作為禽流感疫苗的佐劑一樣有提升抗原特異性的體液和細(xì)胞免疫功效；并且在HI試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，免疫后有持續(xù)且較高的抗體滴度水平，表明CpG ODN的免疫保護(hù)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符，赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復(fù)合佐劑試驗(yàn)組顯示，赤紅球菌的存在增強(qiáng)了這種提升功效。許多研究證實(shí)，赤紅球菌是通過TLR2的識(shí)別來刺激機(jī)體免疫的，無論是它的提取物還是全菌都具有免疫刺激作用，而全菌更有定向增強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答的能力，其免疫調(diào)節(jié)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。另外，已有報(bào)道指出，TLR2與TLR21同源且功能相似的TLR9存在著協(xié)同調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的關(guān)系。據(jù)此，作者希望通過檢測(cè)赤紅球菌和CpG ODN各自的TLR受體的相對(duì)表達(dá)水平，探究?jī)烧叩膮f(xié)同關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果顯示，它們之間的協(xié)同關(guān)系可能是通過上調(diào)TLR2和TLR21的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。但該協(xié)同關(guān)系還可能是通過其他多個(gè)作用累積達(dá)到的，就此需要更深入的探究。在進(jìn)一步的試驗(yàn)中，通過分別檢測(cè)脾細(xì)胞和支氣管細(xì)胞的IFN-γ和IL-12的相對(duì)表達(dá)量，作者發(fā)現(xiàn)這種協(xié)同關(guān)系還誘發(fā)了顯著的系統(tǒng)免疫和局部免疫反應(yīng)。這表明該復(fù)合佐劑滿足當(dāng)前研究人員中普遍的追求，疫苗及其佐劑的開發(fā)應(yīng)當(dāng)同時(shí)實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)和局部免疫[31]。通過檢測(cè)IFN-γ/IL-4的比值以及IFN-γ和IL-12的相對(duì)表達(dá)量，該復(fù)合佐劑更傾向于誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答，而研究顯示那些觸發(fā)Th1型免疫與高中和抗體誘生反應(yīng)的佐劑更有可能具有保護(hù)作用，并且能夠避免免疫病理的風(fēng)險(xiǎn)[38]。因此，這些結(jié)果為進(jìn)一步探究CpG ODN與赤紅球菌的協(xié)同關(guān)系提供了研究基礎(chǔ)。

圖6 赤紅球菌聯(lián)合低劑量CpG ODN仍具有良好的免疫效應(yīng)Fig.6 Rhodococcus combined with low-dose CpG ODN still has good immune effect

在確認(rèn)了赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復(fù)合佐劑具有良好的免疫刺激功效之后，進(jìn)一步探究了如何降低該復(fù)合佐劑的使用成本。通過設(shè)置半劑量CpG ODN+赤紅球菌的佐劑組合，作者發(fā)現(xiàn)與原劑量組合相比半劑量組合的試驗(yàn)結(jié)果并未顯示出顯著差異。這表明該復(fù)合佐劑通過赤紅球菌和CpG ODN之間的協(xié)同關(guān)系彌補(bǔ)了CpG ODN劑量降低帶來的免疫效果下降的代價(jià)，并達(dá)到與原劑量組合同等程度的免疫效果。從成本角度出發(fā)，赤紅球菌具有成本上的顯著優(yōu)勢(shì)，它可以經(jīng)由全菌給藥發(fā)揮作用，而且還可以提供長(zhǎng)效免疫作用，另外其培養(yǎng)成本低，作用劑量少，完全符合最初選擇它作為CpG ODN輔助佐劑的目標(biāo)。在使用更低劑量的CpG ODN與赤紅球菌共同發(fā)揮免疫功效這個(gè)思路上，由于試驗(yàn)中只設(shè)置了半劑量組，作者認(rèn)為還可以據(jù)此進(jìn)一步探索最佳劑量。此外，作者前期的工作已證實(shí)制備CpG質(zhì)粒的價(jià)格要低于直接使用CpG ODN[22]，因此擬通過CpG質(zhì)粒代替ODN 進(jìn)一步降低成本。

4 結(jié) 論

本研究提出了一種高效、成本可控的赤紅球菌聯(lián)合CpG ODN復(fù)合佐劑作為禽流感疫苗的免疫佐劑來解決該疫苗存在的免疫效率等問題。作者通過試驗(yàn)確認(rèn)了該復(fù)合佐劑優(yōu)良的免疫提升效果，并且從成本角度出發(fā)，探究了降低該復(fù)合佐劑使用成本的方法。如此，不僅可以減少抗原和CpG佐劑的用量，節(jié)約成本，而且對(duì)于養(yǎng)殖周期40 d左右的肉雞來說，疫苗免疫效力持久性的提高還能減少養(yǎng)殖期間疫苗的注射次數(shù)，更進(jìn)一步地降低成本。本研究為高效、低成本地應(yīng)用CpG制劑作為禽類疫苗佐劑奠定了研究基礎(chǔ)。本研究還先行探索了赤紅球菌與CpG ODN的協(xié)同關(guān)系，為后續(xù)采用CpG質(zhì)粒來進(jìn)一步控制制備和使用成本規(guī)劃了方向。