1株豬源ST-35型肺炎克雷伯菌的致病性和藥物敏感性分析

李華明，項(xiàng) 維，盧文兵，劉 峰，雷連成，3，張付賢*

(1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州 434023；2.天門市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天門 431700；3.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae, Kp)作為一種人獸共患傳染病病原體，在動(dòng)物體表和自然環(huán)境中廣泛分布[1]，可引起人和動(dòng)物的肺、肝、腦﹑眼部的炎癥[2]，其中，以尿路和呼吸道的發(fā)病率最高[3]。豬肺炎克雷伯菌也可寄居動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)各種疾病，豬感染肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出氣喘、呼吸困難等癥狀；剖檢以化膿性纖維素性肺炎為主要病理變化，常伴有肝、腎、脾等臟器腫大和出血[4]；病豬呼吸困難，精神不振，食欲迅速下降、甚至廢絕，常在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生死亡，嚴(yán)重危害生豬養(yǎng)殖生產(chǎn)。當(dāng)前臨床分離的肺炎克雷伯菌呈現(xiàn)復(fù)雜的多重耐藥，存在無(wú)藥可治的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)生豬健康養(yǎng)殖具有潛在的危害[5]。掌握細(xì)菌的毒力和耐藥性是開(kāi)展針對(duì)性治療的基礎(chǔ)。近年來(lái)，不同動(dòng)物源的肺炎克雷伯菌被成功分離和鑒定，并在不同程度上對(duì)其毒力、耐藥性進(jìn)行了分析，研究成果對(duì)肺炎克雷伯菌的防控具有重要意義[5-7]。本研究從病豬肺組織中分離到1株ST-35型肺炎克雷伯菌，并進(jìn)行了生物學(xué)特性、致病性、耐藥性和藥物敏感性分析，為臨床上肺炎克雷伯菌感染的精準(zhǔn)施治和合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑 LB培養(yǎng)基(Tryptone、Yeast extract購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；NaCl購(gòu)自上海滬試化工有限公司)；瓊脂糖、革蘭染色試劑購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；PCR檢測(cè)套裝和DNA Marker購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；組織和細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；抗生素紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；中藥購(gòu)自長(zhǎng)春市同仁堂大藥房。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)選擇健康SPF昆明系小鼠(雌)，共64只，體重18～22 g，購(gòu)自湖北宜昌三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 樣品來(lái)源 自2021年6月—2022年3月不定期無(wú)菌采集貴州地區(qū)同一規(guī)模化豬場(chǎng)具有呼吸道癥狀病豬的口鼻拭子(31份)、病死豬的肺組織(17份)，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.4 菌株來(lái)源 鼠傷寒沙門菌ATCC14028、金黃色葡萄球菌ATCC25923均由長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物重大病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及染色 將口鼻拭子加入適量無(wú)菌PBS，無(wú)菌條件下使用接種環(huán)在LB固體平板上進(jìn)行劃線分離；將采集的肺組織剪碎后加入適量無(wú)菌PBS，使用研磨器進(jìn)行研磨，無(wú)菌條件下使用接種環(huán)在LB固體平板上進(jìn)行劃線分離，其后將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h；觀察平板上的菌落形態(tài)，挑取典型菌落再次劃線、培養(yǎng)，重復(fù)3次后涂片，進(jìn)行革蘭染色觀察。

1.2.2 生化鑒定 無(wú)菌挑取分離菌株的純培養(yǎng)物接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 180 r·min-1培養(yǎng)過(guò)夜，吸取10 μL細(xì)菌培養(yǎng)物至細(xì)菌微量生化鑒定管內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h，觀察和記錄生化鑒定管的反應(yīng)變化。

1.2.3 PCR鑒定和16S rRNA基因測(cè)序 根據(jù)肺炎克雷伯菌特有的khe基因合成特異性引物[8-9]，以細(xì)菌純培養(yǎng)物為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)；采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株DNA，以通用引物27F與1492R進(jìn)行擴(kuò)增，純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析；結(jié)合NCBI BLAST比對(duì)結(jié)果，利用MEGA11構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 多位點(diǎn)序列分析(MLST) 根據(jù)MLST官網(wǎng)提供的肺炎克雷伯菌信息，合成其7個(gè)管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)的引物并進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，上傳至MLST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取等位基因信息，通過(guò)eBURST程序分析并繪圖。

1.2.5 生物被膜形成能力測(cè)定 將分離菌株KP-0728的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待菌液濃度達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠞舛?1.5×108CFU·mL-1)時(shí)取200 μL菌液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌96孔板中置于37 ℃靜止培養(yǎng)24 h，設(shè)置6個(gè)重復(fù)，并以鼠傷寒沙門菌ATCC14028作為對(duì)照菌株，以LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，棄除培養(yǎng)基，PBS洗滌3次以清除雜質(zhì)和浮游菌，棄液后加入0.1%的結(jié)晶紫200 μL染色5 min，并使用無(wú)菌蒸餾水洗去殘余染液，洗至無(wú)色時(shí)每孔加入200 μL無(wú)水乙醇，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)590 nm處的吸光度值。結(jié)果判定時(shí)，依據(jù)臨界的ODc值(ODc等于空白孔的平均值)將生物被膜形成能力分類如下：OD≤ODc為無(wú)(-)；ODc4ODc為強(qiáng)(+++)。

1.2.6 毒力基因擴(kuò)增 提取分離菌株的基因組，利用特異性PCR方法檢測(cè)分離菌株的7種毒力基因：wabG、菌素、magA、kfu、fimH、rmpA、uge[10-13]。

1.2.7 小鼠致病性試驗(yàn) 32只小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只；取凍存于-80 ℃冰箱的分離菌株KP-0728，無(wú)菌條件下使用接種環(huán)在LB固體平板上進(jìn)行劃線并置于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取平板上的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，待鑒定正確后挑取單個(gè)菌落置于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃ 180 r·min-1培養(yǎng)；培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600 nm為0.6)時(shí)取分離菌株菌液用于攻毒試驗(yàn)，3 500 r·min-1離心5 min收集菌體，并使用生理鹽水洗滌兩次，經(jīng)梯度稀釋后平板計(jì)數(shù)，最后使用生理鹽水將菌液濃度分別調(diào)整為3.0×108、3.0×107、3.0×106CFU·mL-1；試驗(yàn)組小鼠分別腹腔注射0.2 mL不同稀釋度的菌液，即攻毒劑量分別為6.0×107、6.0×106、6.0×105CFU·鼠-1，對(duì)照組注射0.2 mL生理鹽水。觀察感染小鼠的臨床狀癥，剖檢死亡小鼠并無(wú)菌采集病變組織；死亡小鼠的病變組織和器官經(jīng)研磨勻漿后，在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，以肺炎克雷伯菌的特異性引物對(duì)臟器的分離菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.8 藥敏試驗(yàn) 采用抗生素紙片法檢測(cè)分離菌株對(duì)常見(jiàn)抗生素的敏感程度。在超凈工作臺(tái)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液均勻涂布在LB固體平板上，在平板的合適位置均勻放置不同抗生素的藥敏片，37 ℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)24 h，測(cè)定并記錄抑菌圈直徑大小，并參照試劑盒說(shuō)明書判定分離菌株對(duì)不同抗菌藥物的敏感性。試驗(yàn)同時(shí)以金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控菌株進(jìn)行平行試驗(yàn)以確保試驗(yàn)有效性。

1.2.9 耐藥基因擴(kuò)增 參考文獻(xiàn)合成肺炎克雷伯菌常見(jiàn)的抗生素耐藥基因的引物，采用PCR方法篩查分離菌株的耐藥基因[14-18]。

1.2.10 中藥體外敏感試驗(yàn) 稱量連翹、金銀花、桂枝、甘草、麻黃、茯苓、荷葉、黃芩、薄荷9味中藥材，分別制備成終濃度為1 g·mL-1的中藥藥液[19-20]；無(wú)菌條件下，取分離株的菌液均勻涂布在LB固體平板上，在牛津杯中加入不同的中藥藥液，以加入滅菌水的孔作為空白對(duì)照。37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，測(cè)定不同中藥藥液的抑菌圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為該中藥的抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)[20]：抑菌圈直徑≥20 mm，判定為菌株對(duì)藥物高度敏感，標(biāo)注“++”；抑菌圈直徑介于10～20 mm判定為菌株對(duì)藥物中度敏感，標(biāo)注“+”；無(wú)抑菌圈或者抑菌圈直徑<10 mm，判定為菌株對(duì)藥物耐藥，標(biāo)注“-”。

1.2.11 中藥體內(nèi)治療試驗(yàn) 將32只小鼠隨機(jī)分為4組：頭孢氨芐組、茯苓組、甘草組、PBS組，每組8只。取凍存于-80 ℃冰箱的分離菌株KP-0728，經(jīng)活化和鑒定后使用接種環(huán)在LB固體平板上進(jìn)行劃線并置于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單個(gè)菌落置于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600 nm為0.6)，3 500 r·min-1離心5 min收集菌體，并使用生理鹽水洗滌兩次，調(diào)整菌量到2.28×106CFU對(duì)所有小鼠進(jìn)行腹腔注射構(gòu)建KP-0728感染模型。感染6 h后，參照藥敏結(jié)果選取敏感抗生素頭孢氨芐、敏感中藥茯苓以及非敏感中藥甘草對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃治療?？股仡^孢氨芐水溶后以30 μg·鼠-1的劑量灌胃小鼠(參照藥敏片藥物含量)；中藥藥液制備同“1.2.10”，每次灌胃200 μL·鼠-1；對(duì)照組以同樣劑量的PBS進(jìn)行灌胃；連續(xù)灌胃3 d。治療3 d后，無(wú)菌采集小鼠肺稱重、研磨，組織懸液稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)各組小鼠肺載菌量。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離鑒定及MLST序列分析

對(duì)所采集的病料樣本進(jìn)行增菌并擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，可見(jiàn)白色、光滑、圓形凸起的菌落(圖1A)；革蘭染色后，在顯微鏡下可見(jiàn)呈單個(gè)、成雙或鏈狀排列、紅色桿狀菌(圖1B)，判斷分離菌為革蘭陰性菌；生化特性分析發(fā)現(xiàn)，分離菌株具有賴氨酸脫羧酶活性，不具有鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性；能夠發(fā)酵阿拉伯糖、鼠李糖、麥芽糖、蔗糖、D-葡萄糖；能夠利用甘露醇、山梨醇，而H2S試驗(yàn)為陰性，分離菌的生化特性與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第8版)中肺炎克雷伯菌的生化特性一致。以肺炎克雷伯菌khe基因引物對(duì)菌株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖1C所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在428 bp處有特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期片段大小一致，表明分離菌株為肺炎克雷伯菌。在48份病料樣本中，經(jīng)PCR檢測(cè)肺炎克雷伯菌陽(yáng)性的樣品有17份，檢出率為35.42%，其中，8份來(lái)源于口鼻拭子，9份來(lái)源于肺組織。采用相同的方法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行細(xì)菌的分離、純化和鑒定，最終獲得3株肺炎克雷伯菌，均來(lái)自肺組織；經(jīng)16S rRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，3株分離菌株序列一致，判斷其處于同一進(jìn)化分支；測(cè)序結(jié)果顯示，分離菌株與GenBank中肺炎克雷伯菌參考株(KX636139.1)的16S rRNA序列的相似性達(dá)99%以上；對(duì)由同一豬場(chǎng)分離的3株菌進(jìn)行生化特性以及生物學(xué)特性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，3株菌具有相類似的特征，因此本研究隨機(jī)選擇了2021年7月28日從肺組織中分離的菌株作為后續(xù)研究的試驗(yàn)菌株。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，分離菌株與肺炎克雷伯菌處于同一進(jìn)化分支(圖1D)。結(jié)合分離菌株的生物學(xué)特性和16S rRNA序列分析，確定分離菌株為肺炎克雷伯菌，命名為KP-0728。

對(duì)肺炎克雷伯菌KP-0728的7個(gè)管家基因進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，如表1所示，KP-0728的7個(gè)等位基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)編號(hào)分別為2、1、2、1、10、1、19，與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中的ST-35型相匹配；在數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相關(guān)分離株MLST信息，分析繪圖，發(fā)現(xiàn)ST-35型與ST-875型匯聚在一支(圖1E)，具有較近的親緣關(guān)系。

根據(jù)結(jié)晶紫染色法測(cè)得分離菌株KP-0728的OD590 nm為0.079 8，如圖2所示，鼠傷寒沙門菌ATCC14028的OD590 nm為0.066 8，分離菌株的生物被膜形成能力強(qiáng)于鼠傷寒沙門菌生物被膜形成能力；而ODc的值為0.045 1，分離菌株的590 nm處的OD值為ODc～4ODc，依據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)，分離菌株KP-0728具有中等的生物被膜形成能力，這一數(shù)據(jù)或提示該菌株具有較強(qiáng)的抵抗外界環(huán)境和抵抗抗生素殺菌作用的能力。

表1 中國(guó)ST-35型肺炎克雷伯菌部分信息

A.分離菌株菌落形態(tài)；B.分離菌株革蘭染色(1 000×)；C. PCR鑒定(M. DL2000 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；-.陰性對(duì)照；1.分離株)D.分離菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；E. MLST分析A. Colony morphology of isolated strains; B. Gram staining of isolated strains (1 000×); C. Identification by PCR (M. DL2000 marker; -. Negative control; 1. Isolated strains); D. Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of the isolate; E. MLST analysis圖1 分離菌株形態(tài)學(xué)觀察、PCR鑒定結(jié)果及序列分析結(jié)果Fig.1 Morphological observation, PCR identification and sequence analysis of isolated strains

圖2 生物被膜形成能力Fig.2 Biofilm-forming ability

2.2 分離菌株致病性分析

對(duì)肺炎克雷伯分離株KP-0728攜帶的毒力基因情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3A～D所示，7種毒力基因中肺炎克雷伯分離株KP-0728共檢測(cè)出4個(gè)毒力基因：uge(535 bp)、wabG(683 bp)、fimH(550 bp)和kfu(797 bp)。

為進(jìn)一步了解該菌株的致病性，本研究采用腹腔注射的方式感染小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)小鼠經(jīng)腹腔注射菌液后，小鼠出現(xiàn)活動(dòng)性減弱、嗜睡、被毛凌亂等臨床癥狀；腹腔注射菌液24 h后，6.0×107CFU·鼠-1組小鼠全部死亡，6.0×106CFU·鼠-1組的小鼠死亡1只；48 h后，6.0×106CFU·鼠-1組的小鼠死亡3只，其余小鼠癥狀有所緩解；72 h后，其余小鼠均恢復(fù)正常。在攻毒期間，6.0×105CFU·鼠-1組的小鼠在48 h后出現(xiàn)1只死亡的情況，其余小鼠僅表現(xiàn)為輕微的精神沉郁，對(duì)照組小鼠未見(jiàn)異常(圖4A)。死亡小鼠的肺病變最為顯著，出現(xiàn)明顯腫大、出血現(xiàn)象；肝和脾也有不同程度的腫大，局部有出血；從死亡小鼠的肺、肝和脾組織均可分離出透明、光滑的菌株，經(jīng)PCR鑒定分離菌株與攻毒菌株一致(圖4B)。根據(jù)攻毒后小鼠死亡情況，計(jì)算出分離菌株KP-0728的半數(shù)致死量(LD50)為4.56×106CFU。

A～D. 毒力基因uge、wabG、fimH和kfu的PCR鑒定結(jié)果；M. DL2000 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照；2. KP-0728A-D. PCR identification results of virulence genes uge, wabG, fimH and kfu, respectively; M. DL2000 marker; 1. Negative control; 2. KP-0728圖3 毒力基因檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of virulence genes

A.小鼠生存曲線；B.感染小鼠各臟器的病原分離和鑒定(M. DL2000 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陽(yáng)性對(duì)照；2. 陰性對(duì)照；3.脾；4.心；5.肺；6.肝；7.腎；8.腸)A. Mouse survival curve; B. Isolation and identification of pathogens infecting various organs of mice (M. DL2000 marker; 1. Positive control; 2. Negative control; 3. Spleen; 4. Heart; 5. Lung; 6. Liver; 7. Kidney; 8. Intestinal)圖4 小鼠生存曲線及感染小鼠各臟器的病原分離和鑒定結(jié)果Fig.4 Mouse survival curve and isolation and identification of pathogens infecting various organs of mice

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 常用抗生素藥敏結(jié)果 以質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和分離菌株KP-0728一起進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，質(zhì)控菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果在質(zhì)控規(guī)定范圍內(nèi)。進(jìn)一步藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株KP-0728對(duì)氨芐西林、亞胺培南、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明耐藥；對(duì)頭孢曲松、頭孢氨芐、頭孢美唑、阿奇霉素、氧氟沙星、多黏菌素B、替考拉寧敏感；對(duì)丁胺卡那和克林霉素中度敏感(表2)。

表2 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 分離株KP-0728的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，分離株KP-0728攜帶sul2(722 bp)、bla-SHV(713 bp)、tetA(730 bp)和aadA1(282 bp)4種耐藥基因(圖5)，具有一定的耐藥性。

A～D. 耐藥基因sul2、bla-SHV、tetA和aadA1；M. DL2000 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照；2. KP-0728A-D. Resistance genes sul2, bla-SHV, tetA and aadA1; M. DL2000 marker; 1. Negative control; 2. KP-0728圖5 耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Detection results of resistance genes

2.3.3 中藥抑菌試驗(yàn)結(jié)果 9味中草藥對(duì)肺炎克雷伯菌的抑菌效果如表3所示，茯苓對(duì)該肺炎克雷伯菌分離株的抑菌效果最好，抑菌圈達(dá)10 mm以上，為中度敏感；其次是黃芩，抑菌圈直徑為8 mm；金銀花、麻黃對(duì)肺炎克雷伯菌也有一定的的抑菌作用；連翹、桂枝、甘草、荷葉以及薄荷這5味中藥對(duì)肺炎克雷伯菌分離株抑菌圈直徑均為0，無(wú)抑菌作用。

表3 9味中草藥對(duì)肺炎克雷伯菌抑菌效果的檢測(cè)結(jié)果

2.3.4 中藥對(duì)肺炎克雷伯菌感染小鼠肺載菌量的影響 分離菌株KP-0728腹腔注射小鼠后6 h，感染小鼠均出現(xiàn)活動(dòng)性減弱、被毛凌亂等明顯的臨床癥狀；在使用抗生素和中藥對(duì)感染肺炎克雷伯菌的小鼠治療3 d后，4組小鼠仍表現(xiàn)出不同程度的嗜睡、被毛凌亂等臨床癥狀，以PBS組小鼠的臨床癥狀最為嚴(yán)重；PBS組出現(xiàn)1只小鼠死亡的情況，其他組小鼠未出現(xiàn)死亡。統(tǒng)計(jì)各組小鼠肺載菌量情況發(fā)現(xiàn)，如圖6所示，頭孢氨芐組小鼠肺的載菌量最低，PBS組小鼠的肺載菌量最高；與PBS對(duì)照組相比，頭孢氨芐治療組小鼠的肺載菌量極顯著降低(P<0.01)，中藥茯苓治療組和甘草治療組小鼠的肺載菌量均低于PBS組，且茯苓治療組小鼠的肺載菌量較PBS組顯著降低(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，中藥茯苓在小鼠體內(nèi)具有抑制KP-0728的作用。

*. P<0.05，**. P<0.01，ns. P>0.05圖6 藥物治療后小鼠肺載菌量Fig.6 Bacterial load in mice lung after treatment of drugs

3 討 論

目前，豬場(chǎng)分離的肺炎克雷伯菌通常表現(xiàn)為多重耐藥和較強(qiáng)的致病性，對(duì)公共衛(wèi)生和畜牧養(yǎng)殖業(yè)具有潛在威脅[24-26]，因此厘清肺炎克雷伯菌的毒力基因、耐藥性、致病力和藥物敏感性等對(duì)于肺炎克雷伯菌感染的防控具有重要指導(dǎo)意義。本研究從具有呼吸道癥狀病豬的組織中分離到肺炎克雷伯菌，經(jīng)形態(tài)觀察、生化鑒定和16S rRNA基因測(cè)序分析得到確認(rèn)，進(jìn)一步通過(guò)多位點(diǎn)序列分析確定分離株為ST-35型。如表1所示，國(guó)內(nèi)分離到的肺炎克雷伯菌ST-35型均來(lái)源于人和環(huán)境樣品，本研究首次分離到豬源的肺炎克雷伯菌ST-35型，提示肺炎克雷伯菌作為一種人獸共患病病原，在人、動(dòng)物和環(huán)境中均可傳播，而為防止其對(duì)人及動(dòng)物造成進(jìn)一步的危害，對(duì)其進(jìn)行深度、系統(tǒng)性研究尤為重要。

本研究分離的豬源肺炎克雷伯菌ST-35型菌株的毒力基因篩查發(fā)現(xiàn)，其攜帶參與脂多糖合成的毒力基因uge和wabG，以及參與黏附素合成的毒力基因fimH和kfu；人工感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，豬源肺炎克雷伯菌ST-35型菌株可致小鼠出現(xiàn)肺、肝出血等多器官損傷，高劑量感染(6.0×107CFU·鼠-1)可導(dǎo)致小鼠死亡，半數(shù)致死量(LD50)為4.56×106CFU；同時(shí)從死亡小鼠的脾、肺、肝等器官中均可分離到攻毒菌株，印證了肺炎克雷伯菌分離株KP-0728與貴州地區(qū)豬場(chǎng)暴發(fā)的呼吸道疾病的關(guān)聯(lián)性。

鑒于養(yǎng)殖場(chǎng)呼吸道疾病抗生素治療效果不理想的情況，本研究通過(guò)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌KP-0728是1株多重耐藥菌，對(duì)氨芐西林、亞胺培南、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明均耐藥；耐藥基因檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，其對(duì)磺胺類藥物的耐藥性可能與sul2基因有關(guān)、對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性可能與bla-SHV基因有關(guān)、對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥性可能與tetA基因有關(guān)、對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥可能與aadA1基因有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜的形成與細(xì)菌耐藥有著密切關(guān)系，生物被膜的特殊屏障滲透作用使得肺炎克雷伯菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生強(qiáng)的耐藥性[27]。在本研究中通過(guò)結(jié)晶紫染色法發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌KP-0728具有中等的生物被膜形成能力，這與其在藥敏試驗(yàn)中表現(xiàn)的多重耐藥情況相符；同時(shí)，肺炎克雷伯菌KP-0728表現(xiàn)出的耐藥情況與許多國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道的肺炎克雷伯菌耐藥性不盡相同，這可能是用藥習(xí)慣不同以及地域差異等原因造成的[26-28]，也與關(guān)鍵蛋白的缺失、基因突變等因素相關(guān)[29-30]?？傊?，肺炎克雷伯菌的復(fù)雜耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步深入、系統(tǒng)地研究。

如何預(yù)防和治療肺炎克雷伯菌感染是養(yǎng)殖生產(chǎn)亟待解決的問(wèn)題。研究表明，應(yīng)用中藥藥物治療細(xì)菌性疾病其最大的優(yōu)點(diǎn)在于避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[31]。目前，對(duì)于中藥藥物治療細(xì)菌或病毒性疾病的研究依舊處于初步探索的階段，已知應(yīng)用中藥治療肺炎克雷伯菌感染的研究也停留在體外試驗(yàn)[32]。本研究通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌對(duì)中藥茯苓敏感；進(jìn)一步構(gòu)建肺炎克雷伯菌感染的小鼠模型，通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)初步證實(shí)中藥茯苓能夠顯著減少感染小鼠肺的載菌量，具有良好的治療肺炎克雷伯菌感染的效果。雖然中藥茯苓在小鼠模型中的抑菌效果不如抗生素，但這僅僅是茯苓單味中藥的作用效果。在中獸醫(yī)臨床用藥中，中藥藥劑多以復(fù)方的形式依據(jù)“君、臣、佐、使”進(jìn)行組合配伍，起到兼顧多方面、系統(tǒng)性提高藥效的作用。中藥的種類繁雜，更多能發(fā)揮抑菌作用的中藥有待進(jìn)一步發(fā)掘和組方驗(yàn)證，為抗菌中藥聯(lián)合抑菌作用分析、抗耐藥菌感染的治療和中西聯(lián)合用藥等研究提供依據(jù)和新的思路[33]。本研究經(jīng)藥物敏感性試驗(yàn)證實(shí)，中藥茯苓對(duì)肺炎克雷伯菌KP-0728有一定的治療效果，因此臨床上針對(duì)肺炎克雷伯菌感染的治療方案，應(yīng)充分考慮細(xì)菌的流行特點(diǎn)、致病性和耐藥性，兼顧抗生素和中藥的使用，做到合理用藥和綜合施治。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)分離出1株豬源ST-35型肺炎克雷伯菌，該菌攜帶uge、wabG、fimH和kfu4種毒力基因，可致感染小鼠多個(gè)器官的不同程度出血，甚至死亡；其攜帶sul2、bla-SHV、tetA和aadA1 4種耐藥基因，對(duì)氨芐西林、亞胺培南、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明耐藥，對(duì)頭孢曲松、頭孢氨芐、頭孢美唑等抗菌藥敏感；中藥茯苓在體外、體內(nèi)試驗(yàn)中對(duì)分離菌株KP-0728均具有顯著的抑菌作用。