基于非洲豬瘟病毒p30與p54蛋白表位串聯(lián)多肽的間接ELISA抗體檢測方法的建立

馬 俊，王志遠(yuǎn)，梁杏玲，鄭澤中，楊漢春，張桂紅,4，王 衡,5*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣東省臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2.國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室(廣州)，廣州 510642； 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；4.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名 525000；5.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)非洲豬瘟防控技術(shù)研究中心與國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種對家豬和野豬具有高發(fā)病率與致死率的高度接觸性傳染病[1]。不同年齡的家豬與野豬，包括非洲疣豬、叢林豬與歐亞野豬等均易感，軟蜱是ASFV傳播過程中重要的生物媒介與儲存宿主[2]。家豬急性感染的最初臨床表現(xiàn)為發(fā)熱(體溫40～42 ℃)、食欲減退及嗜睡，隨后病情可發(fā)展為嘔吐、出血性腹瀉，以及懷孕母豬流產(chǎn)等。臨床檢查可見與血管炎相關(guān)的典型病理改變，包括皮膚紅斑、肺水腫、充血性脾腫大、出血性淋巴結(jié)炎，以及各器官的點(diǎn)狀出血。幾乎90%～100%有這些癥狀的豬將在7 d內(nèi)死亡[3]。1921年，ASF首次報道于非洲肯尼亞，在過去的一個世紀(jì)，該病在世界五大洲范圍內(nèi)陸續(xù)被報道，已成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一，被世界動物衛(wèi)生組織列為法定報告的動物疫病[4-6]。自2018年傳入我國東北地區(qū)以來，該病在各省迅速傳播蔓延，給我國生豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大挑戰(zhàn)，是我國的一類動物疫病[7]。

ASFV是非洲豬瘟病毒家族已知的唯一成員，屬于有囊膜的雙鏈DNA病毒，基因組大小為170～193 kb，編碼68種結(jié)構(gòu)蛋白與超過100種非結(jié)構(gòu)蛋白[8]。其中，p30與p54蛋白作為病毒的囊膜蛋白，具有較強(qiáng)免疫原性，均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[9]。p30蛋白主要參與病毒內(nèi)化，在病毒感染早期即有較高水平表達(dá)[10]；p54蛋白主要參與病毒粒子的組裝，在病毒感染早期可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。

目前，在我國山東與河南等地已經(jīng)分離出了不同程度的減毒變異毒株，在臨床常造成慢性潛伏性感染[12-13]，且尚無針對ASFV的有效上市疫苗，因此對ASFV的監(jiān)測及早期精準(zhǔn)診斷成為疫情防控的重點(diǎn)工作內(nèi)容。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是世界動物衛(wèi)生組織推薦的常規(guī)血清學(xué)診斷方法之一。目前，基于p30與p54等蛋白的血清學(xué)診斷方法被廣泛建立[14-17]，但傳統(tǒng)的重組蛋白作為診斷抗原局限于大規(guī)模表達(dá)與純化等生產(chǎn)工藝，在臨床的應(yīng)用效果各異。因此，本研究利用噬菌體展示十二肽庫篩選ASFV p30與p54蛋白抗原表位，并設(shè)計(jì)合成表位串聯(lián)多肽為包被抗原，建立能夠特異性檢測ASFV血清抗體的間接ELISA方法，對現(xiàn)有檢測方法進(jìn)行補(bǔ)充，為建立精準(zhǔn)、穩(wěn)定的ASFV檢測技術(shù)提供思路。

1 材料與方法

1.1 血清、菌株及主要試劑材料

ASFV陰性參考血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并應(yīng)用法國ID-VET ASFV 間接ELISA抗體檢測試劑盒檢測確認(rèn)；ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；經(jīng)典豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)參考陽性血清與小鼠陰性血清均為本實(shí)驗(yàn)室收集保存。ASFV p30蛋白mAb由本實(shí)驗(yàn)室制備與保存；ASFV p54蛋白mAb由普萊柯生物工程股份有限公司惠贈。Ph.D.-12噬菌體展示肽庫試劑盒為NEB公司產(chǎn)品；HRP-羊抗豬IgG為KPL公司產(chǎn)品，HRP-羊抗鼠IgG購自博士德生物公司；可溶性單組份TMB底物溶液購自天根生化科技有限公司；可拆卸ELISA酶標(biāo)板購自廣州潔特公司；商品化的ASFV間接ELISA抗體檢測試劑盒購自北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司。多肽由上海強(qiáng)耀生物科技公司完成合成及純化。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 p30與p54蛋白抗原表位鑒定

1.2.1 p30與p54蛋白mAbs特異性親和噬菌體的生物淘選與測序分析 針對p30蛋白mAb的生物淘選與表位肽鑒定方法見本課題組已發(fā)表文章[18]。參照該方法對另一株針對ASFV p54蛋白的mAb(1B11)進(jìn)行特異性親和噬菌體的淘選與測序分析。試驗(yàn)采用固相淘選的方法，將靶分子用0.1 mol·L-1NaHCO3溶液(pH 8.6)稀釋至100 μg·mL-1，包被酶標(biāo)板，每孔150 μL；樣品于濕盒中4 ℃孵育過夜；使用2%BSA溶液封閉，于4 ℃孵育1 h；以0.1%TBST溶液作為第1、2輪洗滌液，0.5%TBST溶液作為第3、4洗滌液；每輪淘選加入100 μL噬菌體文庫(滴度控制在1×1011CFU)，于室溫下孵育1 h；快速洗板10次；加入100 μL 0.2 mol·L-1Glycine-HCl溶液(pH 2.2)，于室溫下孵育15 min，以洗脫特異性結(jié)合的噬菌體；加入15 μL mol·L-1Tris-HCl溶液(pH 9.1)，以中和洗脫液；取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行滴度測定，余下產(chǎn)物擴(kuò)增后用于下一輪淘選。隨機(jī)挑取第3、4輪淘選洗脫產(chǎn)物進(jìn)行單克隆噬菌體的擴(kuò)增及純化鑒定，將陽性噬菌體單克隆的PCR產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司測序(引物如下，F(xiàn)-M13：5′-TCACCTCGAAAGCAAGCTGA-3′；R-M13：5′-CCCTCATAG-TTAGCGTAACG-3′)，運(yùn)用MegAlign(Version 11.0)進(jìn)行比對分析，篩選獲得與p54蛋白氨基酸序列同源性高的十二肽序列，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成多肽。

1.2.2 ELISA鑒定合成多肽與p54蛋白mAb的反應(yīng)原性 試驗(yàn)方法參照已發(fā)表文章[18]。多肽以碳酸鹽緩沖液稀釋至0.2 μg·孔-1，以100 μL·孔-1包被酶標(biāo)板，4 ℃孵育過夜，設(shè)置空白與陰性小鼠血清對照孔，p54蛋白mAb(初始濃度為0.2 mg·mL-1)用PBST進(jìn)行10-3倍～10-5倍稀釋，小鼠陰性血清10-3倍稀釋，其他操作參照間接ELISA常規(guī)程序。

1.2.3 ASFV不同基因型毒株間p54蛋白氨基酸同源性比較分析 通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)下載獲取21種不同基因型ASFV毒株的p54蛋白氨基酸序列，以及12株ASFV基因Ⅱ型毒株序列，利用MegAlign(Version 11.0)進(jìn)行同源比對，分析上述鑒定的表位多肽氨基酸位點(diǎn)的保守性。

1.2.4 ASFV p30與p54蛋白空間構(gòu)象分析 使用QUARK(https://zhanggroup.org/QUARK/)從頭算法預(yù)測ASFV/HLJ/2018株p30與p54蛋白的空間構(gòu)象，分析試驗(yàn)鑒定的p30與p54蛋白表位多肽在空間上的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1.3 間接ELISA檢測方法的建立

1.3.1 包被抗原種類的確定 以本研究通過生物淘選獲得與鑒定的抗原多肽結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)合成以氨基酸GGG為接頭的ASFV p30與p54蛋白表位串聯(lián)多肽，分別在N端偶聯(lián)BSA與OVA，參照“1.2.2”的間接ELISA方法，將ASFV陰、陽性血清做1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋，設(shè)置空白與陰性對照孔，比較不同種類包被抗原與血清樣本的反應(yīng)效果，選擇最佳的ELISA的包被抗原用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用棋盤滴定法，按照間接ELISA常規(guī)程序分別對多肽包被濃度(1.25、2.5、5和10 μg·mL-1，100 μL·孔-1，4 ℃孵育過夜)，待檢血清稀釋度(1∶100、1∶200、1∶400和1∶800，100 μL·孔-1，37 ℃，1 h)，HRP標(biāo)記抗體稀釋度(1∶5 000、1∶10 000和1∶20 000，100 μL·孔-1，37 ℃，30 min)，封閉液(1%明膠溶液、2%BSA溶液、5%脫脂奶粉溶液和10%馬血清)，封閉時間(1、2和3 h)，血清稀釋液(0.05%PBST溶液、1%明膠溶液、2%BSA溶液和5%脫脂奶粉溶液)，血清反應(yīng)時間(45、60和90 min)進(jìn)行優(yōu)化，以P值接近1.0且P/N值最大為標(biāo)準(zhǔn)，確定該方法的最佳反應(yīng)條件。

1.4 特異性試驗(yàn)

用本研究建立的間接ELISA方法檢測已知的CSFV、PRRSV、PCV2、PPV與PRV抗體陽性血清各3份，每份血清設(shè)3個重復(fù)孔，設(shè)置陰、陽性對照孔，分析該方法特異性。

1.5 靈敏度試驗(yàn)

用本研究建立的間接ELISA方法檢測釋1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200倍比稀釋的陽性參考血清，分析該方法的檢測靈敏度。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)選取ASFV抗體強(qiáng)陽性、弱陽性與陰性血清各3份，使用同批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，檢驗(yàn)該方法的批內(nèi)穩(wěn)定性；使用3個不同批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行檢測，檢驗(yàn)該方法的批間穩(wěn)定性；分別計(jì)算出變異系數(shù)，分析該方法的重復(fù)性。

1.7 臨床樣品檢測與符合率試驗(yàn)

使用本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法檢測金宇保靈生物藥品有限公司所饋贈的ASFV感染試驗(yàn)的血清及本課題組2018年前收集的臨床血清，并與商品化的ASFV間接ELISA抗體檢測試劑盒(包被抗原為桿狀病毒表達(dá)的重組p30蛋白)的檢測結(jié)果相比較，利用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)并繪制ROC曲線來評價該方法相對的檢測敏感性與特異性，并計(jì)算兩者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 p30與p54蛋白mAbs特異性親和噬菌體的測序分析

針對p30蛋白mAb的生物淘選與表位多肽鑒定結(jié)果見本課題組已發(fā)表文章[18]。將與p54蛋白mAb特異性親和的噬菌體PCR產(chǎn)物送公司測序，測序結(jié)果與ASFV/HLJ/2018株p54蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果提示該蛋白mAb對應(yīng)表位分布于146PAEPYTT152之間(圖1)。在此基礎(chǔ)上，前后延長合成一段多肽進(jìn)行活性分析，多肽序列見表1。

圖1 p54蛋白mAb特異性親和噬菌體測序分析Fig.1 Sequencing analysis of p54 monoclonal antibody specific affinity phages

表1 合成肽信息

2.2 合成多肽與p54蛋白mAb的反應(yīng)原性

將合成多肽作為包被抗原與p54蛋白mAb進(jìn)行結(jié)合力驗(yàn)證，間接ELISA結(jié)果顯示，多肽在0.2～5 μg·孔-1的包被區(qū)間與p54蛋白mAb具有相似的結(jié)合力，隨著mAb稀釋倍數(shù)增加，結(jié)合能力下降，而陰性小鼠血清與多肽幾乎不反應(yīng)(圖2)。

Peptide-SA在N端與BSA相連Peptide-SA was coupled with BSA in N terminal圖2 多肽與p54蛋白mAb結(jié)合能力Fig.2 Binding activities of the synthetic peptides to p54 monoclonal antibody

2.3 ASFV不同基因型毒株間p54蛋白氨基酸同源性比較分析

ASFV p54蛋白氨基酸序列比對結(jié)果顯示：141SAPAHPAEPYTT152多肽序列在ASFV 21種不同基因型毒株間相對保守，其中，145與149位氨基酸位點(diǎn)存在一定程度變異(圖3)，但在12株ASFV基因Ⅱ型毒株間高度保守(圖4)。

2.4 QUARK預(yù)測p30與p54蛋白空間構(gòu)象

ASFV/HLJ/2018株p30與p54蛋白空間構(gòu)象預(yù)測結(jié)果顯示，p30蛋白116—124位多肽主要位于α螺旋區(qū)域，而p54蛋白141—152位多肽主要位于不規(guī)則卷曲區(qū)域，但兩者均暴露于蛋白表面(圖5)。

2.5 多肽間接ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

2.5.1 包被抗原種類的確定 根據(jù)上述結(jié)果設(shè)計(jì)合成的表位串聯(lián)多肽序列信息見表2。間接ELISA結(jié)果顯示，以O(shè)VA作為N端偶聯(lián)物的多肽抗原與BSA相比具有較低的非特異性血清結(jié)合背景，且陰性對照組(OVA)均不與血清反應(yīng)(表3)。

2.5.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 通過對間接ELISA方法的優(yōu)化，最終確定：最佳抗原包被濃度為2 μg·mL-1，血清稀釋度為1∶100，HRP標(biāo)記抗體稀釋度為1∶5 000(表4)；最佳封閉條件為1%明膠溶液封閉1 h(表5)；最佳血清反應(yīng)條件為使用封閉液稀釋并作用60 min(表6)；綜上，得到ELISA檢測的基本流程見表7。

圖3 ASFV不同基因型毒株間p54蛋白氨基酸同源性比較分析Fig.3 Comparative analysis of amino acid homology of p54 protein among ASFV genotypes

圖4 ASFV基因Ⅱ型毒株間p54蛋白氨基酸同源性比較分析Fig.4 Comparative analysis of amino acid homology of p54 protein among ASFV genotype Ⅱ strains

a. ASFV/HLJ/2018株 p30蛋白；b. ASFV/HLJ/2018株 p54蛋白a. ASFV/HLJ/2018 strain p30 protein; b. ASFV/HLJ/2018 strain p54 protein圖5 ASFVp30和p54蛋白空間構(gòu)象Fig.5 Conformational structure of ASFV p30 and p54 protein

表2 合成的表位串聯(lián)多肽信息

表3 包被抗原種類的確定(OD450 nm)

2.5.3 間接ELISA閾值的確立 利用本研究建立的間接ELISA方法對90份豬陰性血清進(jìn)行檢測(表8)，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果計(jì)算可得：檢測結(jié)果的陽性臨界值為0.339；即設(shè)立間接ELISA檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：在陰性對照兩孔平均OD450 nm值<0.286，陽性對照兩孔平均OD450 nm≥0.571的情況下檢測結(jié)果成立，當(dāng)OD450 nm<0.286判為陰性，0.286≤OD450 nm<0.339判為可疑，OD450 nm≥0.339判為陽性，可疑樣品復(fù)檢，若仍小于0.339，則判為陰性。

表4 抗原包被濃度、血清稀釋度及HRP標(biāo)記抗體稀釋度的確定

表5 最佳封閉液條件的確定

表6 最佳血清稀釋液及作用時間的確定

表7 間接ELISA的操作流程

2.6 間接ELISA方法的特異性分析

采用本研究建立的間接ELISA方法分別檢測CSFV、PRRSV、PCV2、PPV與PRV抗體陽性血清樣本，結(jié)果如圖6a所示，該方法能特異性檢測ASFV抗體血清，具有良好的特異性。

2.7 間接ELISA方法的敏感度分析

利用建立的間接ELISA方法檢測倍比稀釋的ASFV陽性血清(稀釋倍數(shù)為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200)，結(jié)果顯示，該方法最低可檢測到1∶1 600稀釋的陽性血清樣本(圖6b)。

表8 陰性血清樣本在優(yōu)化條件下檢測的OD值

圖6 間接ELISA特異性(a)和敏感度(b)試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 The specificity (a) and sensitivity (b) test results by the indirect ELISA

2.8 間接ELISA方法的重復(fù)性分析

利用建立的間接ELISA方法對9份血清樣本的批內(nèi)及批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%(表9)，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

表9 間接ELISA方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 臨床樣本檢測與符合率試驗(yàn)

用本研究建立的間接ELISA方法與北京金諾公司生產(chǎn)的ASFV抗體檢測試劑同時檢測320份豬血清樣品。統(tǒng)計(jì)結(jié)果并利用SPSS軟件分析評估，圖7結(jié)果顯示，該方法與商品化試劑盒的相對敏感性為97.3%；相對特異性為97.6%(P<0.001)；兩者總體符合率達(dá)97.5%(表10)。

a. 間接ELISA檢測的散點(diǎn)圖，“0”和“1”分別表示商品化試劑盒檢測為陰性和陽性的血清樣本(n0=244，n1=76)；b. 間接ELISA檢測結(jié)果的ROC分析a. Dot plot of the indirect ELIS, “0” and “1” represent negative and positive samples detected by commercial kit, respectively (n0=244，n1=76); b. ROC analysis of indirect ELISA result圖7 臨床血清樣品的間接ELISA檢測結(jié)果Fig.7 Indirect ELISA results of clinical serum samples

表10 間接ELISA與商品化試劑盒符合率試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

僅依據(jù)感染豬的臨床癥狀對ASF進(jìn)行診斷，容易和經(jīng)典豬瘟(CSF)、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)等具有相似臨床癥狀的疫病混淆，因此要輔助采取實(shí)驗(yàn)室檢測方法進(jìn)行最終診斷[19-20]。其中，以抗體ELISA檢測為代表的血清學(xué)診斷方法具備良好的診斷特異性與敏感性，已被廣泛應(yīng)用于非洲豬瘟的監(jiān)測和防控工作中[21-22]。當(dāng)豬被低毒力毒株感染時，高特異性與靈敏度的血清學(xué)診斷可能是監(jiān)測被感染動物的最佳方法。因此，研發(fā)出高質(zhì)量的血清學(xué)診斷試劑具有十分重要的意義。

ELISA作為世界動物衛(wèi)生組織推薦的ASFV血清學(xué)檢測方法，目前常用p30、p54、p72與p62等蛋白作為商業(yè)化試劑盒主要的包被抗原，且常見的診斷抗原分子多為全蛋白[14, 23]，表達(dá)與純化等生產(chǎn)工藝煩瑣，容易造成非特異性識別。本研究應(yīng)用合成的表位串聯(lián)多肽分子作為診斷抗原，抗原成分單一，合成工藝成熟，保證了檢測的敏感性與特異性，常被用于相關(guān)病原的ELISA診斷方法研究。

ASFV p30和p54蛋白作為重要的抗原結(jié)構(gòu)蛋白，其抗原核心區(qū)域已被廣泛研究。Wu等[24]利用抗原截短與表位作圖的方法鑒定出了ASFV Georgia/2007株p30蛋白的4個獨(dú)立的線性表位，其中位于116—125 aa的抗原區(qū)在宿主抗體反應(yīng)中具有免疫優(yōu)勢。Murgia等[25]聯(lián)合使用ASFV OURT88/3株及真核表達(dá)ASFV BA71V株p30蛋白的免疫血清鑒定了位于111—130 aa的免疫優(yōu)勢區(qū)域。曹琛福[17]利用生物信息分析工具結(jié)合ASFV標(biāo)準(zhǔn)血清驗(yàn)證了TAN/08株p54蛋白的抗原位點(diǎn)為114HPTEPYT120。高瞻[26]利用生物信息預(yù)測與合成多肽驗(yàn)證鑒定了與ASFV陽性血清具有較高反應(yīng)原性的ASFV/HLJ/2018株p54蛋白145—151 aa區(qū)域。本研究通過新型的生物淘選方法篩選得到的p30(116TSSFETLFE124)和p54(143PAHPAEPYTT152)蛋白表位多肽再次驗(yàn)證了上述結(jié)果，且兩段表位多肽序列在不同基因型毒株間的保守度高，有利于發(fā)展免疫學(xué)診斷方法。

本試驗(yàn)以上述鑒定的兩段表位為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)串聯(lián)多肽抗原，驗(yàn)證并選取了N端偶聯(lián)OVA的表位串聯(lián)多肽為診斷抗原，成功建立了能夠特異性檢測ASFV抗體的間接ELISA方法。

4 結(jié) 論

以噬菌體生物淘選方法獲得1株ASFV p54蛋白mAb所識別的抗原表位(143PAHPAEPYTT152)，結(jié)合本課題組已發(fā)表的p30蛋白抗原表位篩選結(jié)果，建立了以ASFV p30與p54蛋白的表位串聯(lián)多肽作為診斷抗原的間接ELISA方法。應(yīng)用該方法檢測臨床血清樣本，與商品化試劑盒檢測結(jié)果的符合率為97.5%。該研究結(jié)果可為ASFV免疫學(xué)診斷方法提供新的思路，為ASFV的防控提供科學(xué)工具。