心臟類器官研究進(jìn)展

劉鵬 李凱園 王淑亞 趙明明 杜鳳立 蘇國海

自2009 年成功構(gòu)造出具有微絨毛結(jié)構(gòu)的腸道類器官（organoid）后，類器官的研究一直在推進(jìn)[1]。類器官是具有類似人體生理組織功能的三維組織培養(yǎng)物（3D organoid），可以在體外模擬人體的正常生理和病理變化，并在一定程度上模仿器官功能，因此，類器官成為從基礎(chǔ)研究到個(gè)性化醫(yī)療的理想模型[2]。

與傳統(tǒng)的二維（2D）細(xì)胞模型相比，類器官能夠形成復(fù)雜的組織和器官樣結(jié)構(gòu)[3-4]，且能模擬人體組織細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用。

與動(dòng)物模型相比，類器官克服了人類與動(dòng)物在種源上的差異，突破了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成果向臨床轉(zhuǎn)化過程中的諸多瓶頸[5]。

全世界每年死于心血管疾病的人數(shù)高達(dá)1 500 萬，居各種死因的首位[6-7]。近年來，各種心臟類器官模型研發(fā)迅速[8]，最常見的是人類胚胎干細(xì)胞（HESC）和人類誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（HiPSC）構(gòu)造的心臟類器官模型[9-11]。心臟類器官作為新一代藥物心臟毒性評(píng)估模型和心臟疾病診療模型，有利于深入探索心臟的生理功能和心血管疾病的病理機(jī)制，也有利于探索腫瘤等相關(guān)藥物的心臟毒性。

1 心臟類器官培養(yǎng)過程

心臟類器官培養(yǎng)主要需要人多功能干細(xì)胞、基質(zhì)膠以及維持和誘導(dǎo)分化的相關(guān)因子。例如，通過各種生長因子誘導(dǎo)HiPSC 轉(zhuǎn)錄分化，激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路及其他參與心臟發(fā)育的信號(hào)通路，可產(chǎn)生不同的心肌細(xì)胞群，如竇房結(jié)細(xì)胞、房室細(xì)胞和浦肯野細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上，利用成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外間質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)心室和心房特有的心肌電生理特性[12]。在已證實(shí)的轉(zhuǎn)錄因子中，矮小同源盒基因亞型2（SHOX2）編碼蛋白、胰島因子1（ISL1）、T-框蛋白3（TBX3）等可誘導(dǎo)竇房結(jié)分化，雞卵白蛋白上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子Ⅰ、Ⅱ（COUPTF Ⅰ、COUP-TF Ⅱ）可誘導(dǎo)心房分化。在基質(zhì)膠中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行選擇性誘導(dǎo)分化，可得到不同類型模型，用于疾病模型研究、藥物評(píng)估模型研究[13-14]。

結(jié)構(gòu)柱、水凝膠模具、重力懸垂法以及多材料3D 打印等新技術(shù)的興起，使生理性心臟類器官模型的構(gòu)建成為可能。Kupfer 等[15]用3D 生物打印制造出可灌注的心腔仿真體，該仿真體具有較大的血管管道和間隔通道，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)、單向流動(dòng)。Zou等[16]研究發(fā)現(xiàn)，“valentine heart”型構(gòu)造可以通過使用水凝膠材料和3D 生物打印技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。使用定制的基于細(xì)胞外基質(zhì)的生物墨水，可以構(gòu)造出同步收縮的人體心室式肌泵，肌泵的細(xì)胞密度與天然心臟組織的細(xì)胞密度具有相同的數(shù)量級(jí)。

目前，心臟類器官培養(yǎng)最常用的方法是獲取患者血液樣本、皮膚活組織甚至尿液樣本，利用規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列及其相關(guān)核酸酶9（CRISPR/Cas9）等技術(shù)，經(jīng)修復(fù)基因突變、重建細(xì)胞功能及重編程，獲得新型人工多能干細(xì)胞，進(jìn)而構(gòu)造出特定的心臟類器官模型。

2 心臟類器官模型的應(yīng)用

心臟類器官模型的研究相對(duì)其他疾病類器官模型較為滯后，原發(fā)性結(jié)腸癌、肝癌和胃癌等類器官模型已能進(jìn)行功能測(cè)試（如藥物敏感性研究等），并能將所得數(shù)據(jù)與個(gè)體基因相關(guān)聯(lián)，這證明類器官有助于研究基因靶向精準(zhǔn)治療。心臟是不可再生器官，細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)相對(duì)保守，利用基因編輯技術(shù)，在人類心臟類器官干細(xì)胞中引入不同的序列突變，模擬各種心肌突變序列，可以有效從分子水平研究各種心臟疾病的發(fā)病機(jī)制。

2.1 遺傳性心臟病模型

遺傳性心臟病是由攜帶基因突變的心肌細(xì)胞引起的，隨著時(shí)間的推移，這些突變引發(fā)心臟功能異常和慢性疾病進(jìn)展，較常見的即1 個(gè)基因的突變導(dǎo)致大范圍遺傳性和/或獲得性心肌病變。將CRISPR/Cas9 突變基因組編輯技術(shù)應(yīng)用到心臟類器官中，根據(jù)已知特定基因，糾正突變基因或去除異?；颍尚迯?fù)細(xì)胞的生理功能[17]。編碼心臟鈉離子通道α 亞基（SCN5A）、環(huán)化核苷酸調(diào)控陽離子通道蛋白亞型4（HCN4）等離子通道的基因若發(fā)生突變，可引起先天性竇房結(jié)功能障礙。使用基因突變技術(shù)改變特異性竇房結(jié)樣細(xì)胞的基因，可構(gòu)造疾病模型。此外，已有學(xué)者利用HiPSC 構(gòu)造出心肌病相關(guān)性Duchenne 肌營養(yǎng)不良癥、肌聯(lián)蛋白基因截短突變相關(guān)擴(kuò)張型心肌病、BRAF基因突變相關(guān)肥厚型心肌病以及Barth 綜合征等心臟遺傳性疾病模型；在離子通道突變導(dǎo)致的各種心律失常中，家族性長QT 間期綜合征、QT 間期延長等疾病模型也已成功構(gòu)建[18]。

2.2 非遺傳性心臟病模型

急性心肌梗死、心力衰竭、心房顫動(dòng)、心室顫動(dòng)（室顫）等非遺傳性心臟病模型的構(gòu)建，不管是動(dòng)物模型還是細(xì)胞模型，一直都是高成本、低效率。

2.2.1 急性心肌梗死模型 在急性心肌梗死模型的研究中，Voges 等[19]利用HiPSC 建立心臟類器官，通過低溫?fù)p傷造成類器官局部創(chuàng)傷，模擬局部血管收縮導(dǎo)致的區(qū)域內(nèi)心肌細(xì)胞缺血和死亡，觀察心肌細(xì)胞梗死2 周以上的病理變化。此外，利用3D 微組織中固有的氧擴(kuò)散梯度和腎上腺素慢性刺激，心臟類器官可以模擬梗死后心臟的器官反應(yīng)，如心肌酶指標(biāo)（如肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I 等）變化，細(xì)胞-基質(zhì)的病理變化，在心肌梗死后心臟功能及后期病理性纖維化研究中具有優(yōu)勢(shì)[20]。

2.2.2 心力衰竭模型 Tiburcy 等[21]在無血清條件下誘導(dǎo)胚胎中的多能干細(xì)胞，使之衍生出大批量的人類心肌細(xì)胞，成功構(gòu)建細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能更成熟的心臟類器官，并探索兒茶酚胺慢性刺激對(duì)心肌細(xì)胞的作用。心力衰竭模型的構(gòu)建有利于深入研究心力衰竭的病理機(jī)制。

2.2.3 心律失常模型 心律失?？蓡为?dú)發(fā)病，亦可與其他心血管疾病伴發(fā)。利用人類多能干細(xì)胞（hPSC）衍生的心房樣心肌細(xì)胞，在外界快速起搏的誘導(dǎo)下，可以成功構(gòu)建室性心動(dòng)過速（室速）、室顫等心律失常模型，用于離子通道突變的研究。Libring 等[22]利用3D 生物打印膠原的方法和懸浮水凝膠可逆嵌入的特性，設(shè)計(jì)人體心臟組件，在心肌收縮高峰時(shí)，心臟類器官模型的心室可成功實(shí)現(xiàn)同步收縮，并可定向傳導(dǎo)動(dòng)作電位。Lee 等[23]利用層粘連蛋白/內(nèi)皮抑素（LN/ET）復(fù)合物和成纖維細(xì)胞生長因子4（FGF4）等構(gòu)建體外心臟器官樣組織，其中包含心肌細(xì)胞、傳導(dǎo)組織、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，心肌細(xì)胞具有收縮功能并可產(chǎn)生動(dòng)作電位，借助電生理設(shè)備可評(píng)估心臟疾病對(duì)心室功能的影響。心臟類器管在長QT 綜合征、房性心動(dòng)過速、室速、致心律失常性右心室心肌病等心律失常疾病的研究中顯示出巨大的潛力。

2.2.4 糖尿病引起的血管性疾病模型 糖尿病可引起血管病變，如基底膜擴(kuò)張、血管細(xì)胞丟失以及內(nèi)皮細(xì)胞損傷等，導(dǎo)致失明、腎功能衰竭、心血管疾病、卒中等。Wimmer 等[24]將人類胚胎干細(xì)胞系H9 和另外2 個(gè)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系相結(jié)合，生成血管網(wǎng)絡(luò)并成功構(gòu)造出功能性血管，并模擬糖尿病引起的基底膜增厚，其中Ⅳ型膠原顯著增加、各種炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）和白細(xì)胞介素（IL）-6 的異常表達(dá)，這為深入探索糖尿病引起的各種血管病變提供了理想模型。

2.3 藥物評(píng)估

動(dòng)物模型雖然在一定程度上可以滿足藥物安全性研究的要求，但種族差異、高額實(shí)驗(yàn)成本、周期長等缺點(diǎn)阻礙了藥物的研發(fā)進(jìn)程。類器官可以保持與來源組織高度相似的分子結(jié)構(gòu)和細(xì)胞構(gòu)成，滿足臨床前藥物開發(fā)和個(gè)體化治療選擇的迫切需要[25-26]。

通過誘導(dǎo)HPSC 分化，可以提供大批量、可替代、可再生的體外人類心肌細(xì)胞來源的心臟類器官。利用3D 打印技術(shù)，將PDMS 模具與康寧Sylgard 184 硅橡膠組織支架相結(jié)合，制造出硅膠模具，可以批量獲得心臟類器官模型。該模型在組織水平上與人體心肌細(xì)胞具有相似的同步收縮功能，利用非侵入性熒光標(biāo)記技術(shù)、實(shí)時(shí)視頻記錄和離線自動(dòng)量化心肌組織收縮特性，基本可以滿足藥物篩選要求。利用纖維黏連蛋白、明膠納米膜和3D-HiPSC-CT 同樣可以構(gòu)造心臟類器官，其心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如纖維連接蛋白、Ⅰ/Ⅲ型膠原和層粘連蛋白）呈肌節(jié)結(jié)構(gòu)，打破了人類Herg基因編碼通道研究中對(duì)非心肌細(xì)胞的使用限制[27]。

3 展望

目前，心臟類器官研究相比其他組織類器官尚處于起步階段，但在轉(zhuǎn)化研究中表現(xiàn)出巨大的潛力。然而，心臟類器官所構(gòu)建的疾病模型仍存在較為明顯的限制因素。一方面，類器官培養(yǎng)體系與活體相比，缺少與微環(huán)境成分（如免疫細(xì)胞、腎上腺激素、甲狀腺激素等）的相互作用，不能完全模擬細(xì)胞在體內(nèi)所處的狀態(tài)。心臟類器官模型后期培養(yǎng)過程較為復(fù)雜，手動(dòng)處理微組織和培養(yǎng)基相當(dāng)困難。另一方面，心臟類器官模型高度依賴干細(xì)胞的增殖能力和基因的修飾表達(dá)，建模耗時(shí)長等因素可能會(huì)影響細(xì)胞功能，且各個(gè)模型的功能認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)、心臟毒性篩選標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。

未來的研究方向是將誘導(dǎo)的心肌干細(xì)胞與微環(huán)境成分共培養(yǎng)，構(gòu)建出更符合人體生理狀態(tài)的心臟類器官模型。心臟類器官是基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的重要工具，通過多學(xué)科聯(lián)合研究，在培養(yǎng)皿中構(gòu)建出“個(gè)性化”心臟類器官疾病模型，有助于推動(dòng)各種心臟疾病個(gè)體化、精準(zhǔn)治療。