超聲輔助-分散液液微萃取結(jié)合超高效液相色譜
——串聯(lián)質(zhì)譜分析馬尿中痕量氨魯米特

陳 茜，馬智超

（武漢商學(xué)院馬科學(xué)研究及馬匹違禁物品檢測中心，湖北武漢 430056）

芳香酶是生物體內(nèi)催化雄激素前體轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵限速酶，而芳香酶抑制劑可以特異性地降低芳香酶的活性，抑制雄性激素的芳構(gòu)化，從而有效阻斷雌二醇的合成，降低生物體內(nèi)雌激素水平，引發(fā)性類固醇負反饋，促使下丘腦促性腺激素釋放激素和黃體生成素分泌增加，從而刺激睪酮的生物合成和分泌[1]。因此，在賽馬運動中，濫用芳香酶抑制劑被認為是間接服用雄激素的一種手段。國際馬術(shù)聯(lián)合會（Federation Equestre Internationale，F(xiàn)EI）公布的《2019國際馬聯(lián)興奮劑禁用清單》中明確規(guī)定芳香酶抑制劑作為激素與代謝調(diào)節(jié)中的一類，屬于賽內(nèi)外均禁用的物質(zhì)[2]。氨魯米特（Aminoglutethimide）是第一代非甾體類芳香酶抑制劑，其代謝途徑主要以50%的原型隨尿排出，因此氨魯米特在馬術(shù)興奮劑檢測中以尿檢為主。在WADA的技術(shù)文件中規(guī)定，芳香化酶抑制劑類藥物的最低檢測能力要求（MRPL）為20ng/mL，但是對于陽性樣品的判定未設(shè)定下限，這代表對檢測靈敏度的要求越來越高[3]。

國內(nèi)外研究小組已相繼報道過多種檢測氨魯米特的方法，Mareck等開發(fā)了GC/MS法對尿液中氨魯米特進行鑒定的方法[4]，Kang等用LC-MS/MS法對包括氨魯米特在內(nèi)的抗雌激素物質(zhì)進行興奮劑篩查[5]，然而上述方法對尿液的前處理方法一般采用酶解后提取的方法，由于尿液組成復(fù)雜、基質(zhì)干擾大，傳統(tǒng)的富集方法會存在耗時長、富集效率低、響應(yīng)靈敏度低、有機溶劑消耗大等缺點。近年來Lai等合成了分子印跡納米微球進行固相萃取富集人尿中的氨魯米特并結(jié)合HPLC法進行測定[6]，選擇性和靈敏度有所提高，但過程較為煩瑣，成本高，易交叉污染。

分散液液微萃?。―LLME）是一種操作方便、設(shè)備簡單、價格經(jīng)濟、節(jié)約時間、環(huán)境友好且具有高富集率的前處理方法，自2006年Rezaee提出以來，已廣泛應(yīng)用于食品分析、農(nóng)藥殘留分析、藥物分析、毒品分析等領(lǐng)域[7-9]。根據(jù)文獻調(diào)研，未見報道采用DLLME前處理方法從馬尿樣本中提取和檢測氨魯米特的研究。因此，本文旨在建立一種超聲輔助分散液液微萃取結(jié)合超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UA-DLLME-UPLC-MS/MS）方法，用于痕量測定馬尿中的氨魯米特，為國內(nèi)馬術(shù)運動檢測氨魯米特提供高靈敏檢測方法。

1 實驗部分

1.1 試劑

氨魯米特標準品購自美國Selleck公司；甲喹酮標準品購自上海Anpel公司；乙腈，甲醇，甲酸（LCMS級）均購自美國Themo公司；異丙醇，四氫呋喃（HPLC級）均購自上海Macklin公司；四氯乙烯、氯苯、鄰二氯苯，四氯化碳，溴乙烷，溴苯（分析純）均購自上海Macklin公司；二氯甲烷，二硫化碳（分析純）均購自上海Aladdin公司；空白尿樣來自武漢商學(xué)院國際馬術(shù)學(xué)院的無藥物濫用史的實驗馬。

1.2 儀器

TSQ Altis Plus三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Themo Fisher Scientific公司）；超純水機（美國Millipore公司）；臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，5810R）；超微量天平（德國Sartorius公司）；pH計（德國Sartorius公司，PB-30L）；漩渦混勻器（德國IKA公司，Vortex 3）；超聲清洗儀（中國昆山舒美公司，KQ-100 VDV）；金屬浴氮吹儀（武漢恒信世紀科技有限公司）。

1.3 色譜條件

色 譜 柱 ：Thermo Hypersil Gold C18柱（2.1mm×100mm×3mm）；流動相：A相為0.1%（體積分數(shù)，下同）甲酸水，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0 ~ 2.0min，保持5%B；2.0~6.0min，從5%B變?yōu)?5%B，6.0~8.0min，保持95%B，8.0~8.1min，從95%B變?yōu)?%B，8.1~10.0min，保持5%B；流速：0.3mL/min；進樣量：5.0μL；時間：10min；柱溫：30 ℃。

1.4 質(zhì)譜條件

多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；離子化方式：電噴霧（ESI）；離子極性：正離子模式；正離子掃描，噴霧電壓3 500V；鞘氣：30Arb；輔助氣體：10Arb；離子傳輸管溫度：350 ℃；霧化溫度：400 ℃；氨魯米特的定量離子對、定性離子對、碰撞能量分別為233.00/188.04（m/z）、233.00/146.00（m/z）、14.86/20.96（eV），甲喹酮的定量離子對、定性離子對、碰撞能量分別為251.10/91.08（m/z）、251.10/132.03（m/z）、35.58/26.82（eV）。氨魯米特和甲喹酮的保留時間分別為4.30、6.20min。

1.5 標準溶液和陽性尿的制備

標準溶液：準確稱取氨魯米特標準品1.0g（精確至0.0001g），加入10.0mL乙腈配制成1.0mg/mL的標準儲備溶液，于-80℃下儲存，再依次按比例稀釋成100ng/mL的標準工作溶液，于4℃下儲存?zhèn)溆?。準確量取1.0mL甲喹酮標準品溶液（1.0mg/mL），加入10.0mL甲醇配制成0.1mg/mL的內(nèi)標儲備溶液，于-80℃下儲存，再依次按比例稀釋成100ng/mL的內(nèi)標工作溶液，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

陽性尿：取定量氨魯米特標準工作溶液加入空白尿樣，配制一系列濃度的陽性尿用于DLLME的優(yōu)化和方法驗證。

1.6 樣品預(yù)處理

精確吸取3mL陽性尿于15mL尖底離心管中，加入50μL甲喹酮內(nèi)標工作溶液，用約150μL 1mol/L氨水溶液調(diào)節(jié)pH至10.5，將400μL鄰二氯苯和500μL四氫呋喃的混合物用1mL胰島素注射器快速注入樣品溶液，在整個樣品中分散形成了非常細小的液滴，然后使用超聲頻率80Hz超聲處理1min形成均勻的乳濁液體系，接著在4 000r/min下4℃離心10min，上層用移液槍除去水相并棄去，下層沉淀相在40 ℃的水浴下氮吹近干，用1mL流動相（乙腈-0.1%甲酸，5∶95，體積分數(shù)）復(fù)溶。最后，用0.22μm尼龍濾膜過濾上述溶液，用于UPLC-MS/MS上樣分析。

2 結(jié)果與討論

為獲得較高的萃取回收率，需進行各項因素的優(yōu)化實驗，包括萃取劑和分散劑的種類、體積比，樣品的pH、離子強度、超聲時間和超聲頻率。在本次優(yōu)化過程中，馬尿樣品固定為3mL，氨魯米特和內(nèi)標甲喹酮的濃度固定為5ng/mL。無特殊說明，所有數(shù)據(jù)點做三次平行實驗。

2.1 萃取劑與分散劑的選擇

選擇合適的萃取劑-分散劑組合是提高萃取效率的關(guān)鍵，因此本實驗選用二氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烯、氯苯、鄰二氯苯、溴乙烷、溴苯和二硫化碳作為萃取劑，甲醇、乙腈、異丙醇、四氫呋喃作為分散劑，進行樣本提取回收率的考察，以選取最佳組合。結(jié)果顯示，當(dāng)分散劑為四氫呋喃時，相比分散劑，回收率普遍較高，其中氯苯和鄰二氯苯的平均回收率分別為96.2%和97.7%，綜合考慮選擇萃取劑-分散劑組合為鄰二氯苯-四氫呋喃。

2.2 萃取劑與分散劑體積比的確定

為找到最佳萃取劑與分散劑體積比，固定分散劑的體積為500mL，依次增加萃取劑的體積，控制兩者之間的比例為1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5、6∶5、7∶5、8∶5、9∶5、10∶5，考察它們對氨魯米特回收率的影響，發(fā)現(xiàn)回收率隨萃取劑體積的增加而提高，當(dāng)萃取劑與分散劑的體積比達到4∶5時，回收率最高，隨后回收率值保持較高水平。考慮到節(jié)省試劑和氮吹濃縮的時間，最終選擇萃取劑與分散劑體積比為4∶5進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

2.3 pH影響

氨魯米特的pKa為11.6，因此，應(yīng)將樣品調(diào)整到堿性狀態(tài)，這樣可降低氨魯米特在水中的溶解度。為確定最佳pH，使用1mol/L氨水調(diào)整樣品溶液的pH至 5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5。 隨 著pH的增加，萃取率增加，直至pH為10.5時萃取率最高。當(dāng) pH >10.5時，pH的萃取率降低，因為當(dāng)pH為4.0時，氨魯米特更多處于分子狀態(tài)，有利于向有機相轉(zhuǎn)移，增大萃取率。因此，選擇pH為10.5進行下一步的優(yōu)化。

2.4 鹽的影響

為了研究鹽添加的影響，本實驗按0、5%、10%、15%、20%比例添加NaCl來考察萃取效果。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl用量的增多，離心后得到的沉淀相體積有著明顯的降低，這說明鹽的添加提高了萃取劑在水溶液中的溶解度。萃取后得到的回收率數(shù)據(jù)也證明了這點，隨著NaCl添加量的增加，萃取率持續(xù)降低。因此，后續(xù)實驗中不添加鹽。

2.5 超聲時間及頻率的影響

本實驗考察了0~5min時間萃取率的變化，萃取率在1min達到最大，隨著時間的增加，萃取率逐漸降低，這可能是因為長時間超聲會造成超聲儀器內(nèi)以及萃取容器內(nèi)的溫度升高，加速萃取溶劑的揮發(fā)，損失部分待分析物。因此，選擇超聲時間為1min作為最優(yōu)條件。

進一步考察了三種不同超聲頻率45Hz、80Hz、100Hz對3個平行馬尿樣品中氨魯米特的提取效果，結(jié)果表明，超聲頻率對萃取率基本無影響，但80Hz下RSD最低。因此，考慮到萃取過程的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，超聲頻率選擇80Hz。

2.6 方法驗證

用初始流動相將氨魯米特工作溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40ng/mL的系列標準樣品，甲喹酮內(nèi)標濃度均為5ng/mL，然后按照上述優(yōu)化后的前處理步驟進行處理并進行UHPLC-MS/MS測定，每種濃度做三次平行實驗，取平均值。得出的數(shù)據(jù)以氨魯米特與內(nèi)標甲喹酮的進樣濃度比x為橫坐標，氨魯米特與甲喹酮定量離子的積分面積比y進行線性擬合，求得線性回歸方程為y=0.03345x-0.00271，r=0.9994，線性范圍是0.1 ~50ng/mL，證明氨魯米特的標準曲線線性關(guān)系良好。檢出限（LOD）和定量限（LOQ）采用向空白尿樣中逐級降低加標濃度的方法來確定，分別以3倍和10倍信噪比（S/N）對應(yīng)的目標物濃度作為LOD和LOQ，分別為0.05ng/mL和0.1ng/mL。

選擇日內(nèi)和日間精密度來衡量方法的精密度，用相對標準偏差（RSD）來表示，測試選用5ng/mL氨魯米特進行，測得結(jié)果日內(nèi)精密度RSD為2.1，日間精密度RSD為4.3，證明該方法精確度良好。為了評估方法的重復(fù)性，六個平行加標濃度為5ng/mL的尿液經(jīng)過上述優(yōu)化后的前處理，用UHPLC-MS/MS法測得RSD為5.8，證明該方法的重復(fù)性良好。

為考察前處理過程的萃取效率，配制低（1ng/mL）、中（5ng/mL）、高（10ng/mL）三種濃度的加標尿樣，進行優(yōu)化后的UA-DLLME-UHPLC-MS/MS法測得數(shù)據(jù)，每種濃度做六次平行實驗。結(jié)果表明，氨魯米特的回收率在81.4% ~ 113.2%，RSD < 5.6%，證明該前處理方法可以有效提取馬尿中的氨魯米特。

為考察方法的選擇性，配制20份空白尿樣，按照優(yōu)化后的前處理方法上樣測定，未發(fā)現(xiàn)假陽性結(jié)果，證明該方法的選擇性良好。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)評估

由于尿液基質(zhì)復(fù)雜，會影響測定結(jié)果的精密度和準確度。為考察基質(zhì)的檢測結(jié)果，本實驗采用標準曲線法計算基質(zhì)效應(yīng)，公式為：

基質(zhì)效應(yīng)（ME）=（SA-SB）/SB×100%

式中：SA是指基質(zhì)溶液加標物的標準曲線斜率，SB是指超純水溶液加標物的標準曲線斜率。

結(jié)果算得基質(zhì)效應(yīng)為-4.9%，|ME|小于20%，表現(xiàn)出弱基質(zhì)效應(yīng)，基本可忽略不計?？梢姴捎梅稚⒁阂何⑤腿∏疤幚矸椒ǎ梢杂行Ц纳岂R術(shù)興奮劑檢測中基質(zhì)效應(yīng)的干擾。

2.8 方法比較

與其他測定尿樣中氨魯米特的檢測方法（文獻5、文獻6）相比，UA-UPLC-MS/MS方法具有明顯的優(yōu)勢：萃取時間短、線性范圍寬、檢出限低，能滿足馬術(shù)運動興奮劑檢測要求中的快速、靈敏度高。

3 結(jié)束語

本研究利用檢測中心現(xiàn)有的儀器設(shè)備，建立了超聲輔助分散液液微萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定FEI禁用物質(zhì)氨魯米特的定量方法并進行了方法驗證。與傳統(tǒng)溶劑提取方法相比，整個實驗過程無須酶解，減少了有機溶劑的用量，縮短了檢測周期，降低了檢測成本。實驗結(jié)果表明，本方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，無基質(zhì)效應(yīng)干擾，完全滿足馬術(shù)運動興奮劑檢測的要求。