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    微生物替代蛋白生物制造:進(jìn)展與展望

    2023-01-02 10:44:37劉延峰鄧夢(mèng)婷
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:鐵蛋白酵母蛋白質(zhì)

    劉延峰,鄧夢(mèng)婷,陳 堅(jiān)*

    (1 江南大學(xué)未來(lái)食品科學(xué)中心 江蘇無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇無(wú)錫 214122)

    1 微生物替代蛋白為可持續(xù)蛋白供給提供重要支撐

    食物蛋白是人類(lèi)最重要的營(yíng)養(yǎng)素,具有構(gòu)成和修補(bǔ)人體組織,構(gòu)成酶、抗體和激素,運(yùn)輸各類(lèi)物質(zhì),調(diào)節(jié)體液平衡,維持神經(jīng)系統(tǒng)功能和提供能量等作用。作為人體生理、生化的重要組成部分,蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者[1]。攝入蛋白質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量直接影響人類(lèi)健康[2-3]。根據(jù)《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量》中提出的建議,成年男性蛋白質(zhì)攝入量應(yīng)為65 g/d,女性蛋白質(zhì)攝入量為55 g/d。對(duì)于某些人群,包括運(yùn)動(dòng)員、老年人和孕婦,研究表明,由于蛋白質(zhì)對(duì)身體的積極作用,最佳的每日蛋白質(zhì)攝入量應(yīng)該高于普通人群的推薦量[4]。預(yù)計(jì)2050年世界人口將達(dá)到90 億,食品蛋白需求增量為30%至50%,達(dá)到2.65 億t(聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織,F(xiàn)AO,https://www.fao.org/news/story/en/item/35571/icode/)。然而,現(xiàn)有的蛋白質(zhì)獲取大量依賴(lài)于養(yǎng)殖業(yè),存在環(huán)境污染較嚴(yán)重、土地占用和水耗較多的問(wèn)題,面臨難以滿(mǎn)足人口持續(xù)增長(zhǎng)和生活水平不斷提升對(duì)蛋白質(zhì)需求增長(zhǎng)的巨大壓力。傳統(tǒng)蛋白質(zhì)生產(chǎn)方式不僅無(wú)法滿(mǎn)足人類(lèi)未來(lái)生活需求,而且難以達(dá)到環(huán)境友好和資源節(jié)約。大規(guī)模、低成本、可持續(xù)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方式亟需創(chuàng)新和發(fā)展。

    習(xí)近平總書(shū)記在2022年“兩會(huì)” 期間指出,“要樹(shù)立大食物觀(guān)”“發(fā)展生物科技、生物產(chǎn)業(yè),向植物、動(dòng)物、微生物要熱量,要蛋白”。針對(duì)可持續(xù)、健康地滿(mǎn)足全球日益增長(zhǎng)的蛋白質(zhì)需求,尋找可持續(xù)的蛋白來(lái)源是有效、可行的解決辦法,是未來(lái)食品科技研發(fā)的重要方向。替代蛋白(Alternative protein) 通過(guò)對(duì)環(huán)境影響較小的蛋白來(lái)源進(jìn)行蛋白生產(chǎn),以替代現(xiàn)有的蛋白質(zhì)來(lái)源。替代蛋白主要包括植物蛋白、藻類(lèi)蛋白、昆蟲(chóng)蛋白和微生物蛋白等。其中,微生物蛋白是利用可再生生物質(zhì)原料等為底物,通過(guò)在發(fā)酵罐中培養(yǎng)微生物的方式制造蛋白,能夠利用更少的資源產(chǎn)出更多的蛋白質(zhì)來(lái)源,具有制造效率高并且二氧化碳排放少的優(yōu)勢(shì)[5]。據(jù)測(cè)算,微生物蛋白合成效率是養(yǎng)殖方式獲取蛋白效率的上千倍,如果到2050年用真菌蛋白替代全球20%的牛肉消費(fèi),能夠減少每年56%的森林砍伐和相關(guān)二氧化碳排放[6]。

    高效微生物蛋白制造一方面可以保障蛋白供給數(shù)量,保障國(guó)家發(fā)展和食物安全;另一方面,通過(guò)微生物制造獲得高品質(zhì)蛋白能夠保障蛋白供給質(zhì)量,滿(mǎn)足人民美好生活的需求。高品質(zhì)蛋白主要體現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)與功能性質(zhì)方面,包括蛋白氨基酸組成與人體氨基酸模式相接近,蛋白性質(zhì)能夠提升食品的感官品質(zhì),并且調(diào)控食品及組分在制備、加工、儲(chǔ)存和銷(xiāo)售過(guò)程的物理特性。建立基于微生物蛋白高效生物制造的食品蛋白資源供給體系,對(duì)于保障國(guó)家食品蛋白供給安全,助力國(guó)家“碳達(dá)峰”和“碳中和”達(dá)成,具有十分重要的戰(zhàn)略地位。

    2 微生物替代蛋白生物制造進(jìn)展

    2.1 微生物菌體蛋白

    通過(guò)對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng),能夠獲得大量微生物細(xì)胞,進(jìn)一步對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行加工,能夠獲得微生物菌體蛋白。微生物細(xì)胞中,來(lái)源于鐮孢霉(Fusarium venenatum) 的真菌蛋白(Mycoprotein)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母蛋白(Yeast protein)是兩種代表性微生物菌體蛋白。

    來(lái)源于鐮孢霉的真菌蛋白具有胞質(zhì)富含蛋白,菌絲體富含纖維,細(xì)胞膜富含不飽和脂肪酸的特點(diǎn)。1984年,英國(guó)批準(zhǔn)其作為食品,目前已有真菌蛋白的替代蛋白產(chǎn)品上市。它具有以下優(yōu)勢(shì):真菌蛋白的蛋白消化率評(píng)分與牛肉糜、豌豆蛋白、昆蟲(chóng)蛋白、大豆蛋白相近,甚至更高;生產(chǎn)1 kg 真菌蛋白的碳排放量?jī)H為肉類(lèi)的10%,而且所需用水量和耕地面積顯著降低;在促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)和降低膽固醇水平方面具有潛在積極作用[7]。然而,霉菌發(fā)酵培養(yǎng)工藝控制和組織化加工工藝復(fù)雜是其劣勢(shì)。

    來(lái)源于釀酒酵母的酵母蛋白具有富含蛋白質(zhì),長(zhǎng)期應(yīng)用于食品加工,風(fēng)味被廣泛接受的特點(diǎn)。我國(guó)將酵母列為“其它食品”,屬于食品的一種。它的優(yōu)勢(shì)是:酵母蛋白含有全部必需氨基酸,屬于全價(jià)蛋白,營(yíng)養(yǎng)豐富,能夠滿(mǎn)足人體營(yíng)養(yǎng)的需求;發(fā)酵工藝成熟,制造效率高,適合于規(guī)?;圃欤栌盟亢透孛娣e顯著降低;酵母蛋白無(wú)致敏成分,適合人群廣泛;無(wú)豆腥味,并且風(fēng)味上能夠豐富肉味。然而,其在蛋白成纖、持水等質(zhì)構(gòu)和組織特性方面需要進(jìn)行調(diào)控,工藝較復(fù)雜。

    目前各類(lèi)菌體蛋白各有優(yōu)、缺點(diǎn),在生產(chǎn)成本、顏色氣味、質(zhì)構(gòu)加工等方面需根據(jù)各自特性有針對(duì)性地處理。例如,來(lái)源于鐮孢霉的真菌蛋白底物譜廣泛,制造成本低并且質(zhì)構(gòu)與真肉相仿;酵母蛋白制造過(guò)程的菌體培養(yǎng)主要是以糖類(lèi)為底物,成本較低,蛋白加工后幾乎無(wú)特殊氣味,易于加工處理。為了進(jìn)一步提升菌體蛋白制造數(shù)量與質(zhì)量,擴(kuò)展菌體蛋白應(yīng)用,主要從以下4 個(gè)方面開(kāi)展工作:1)建立可用于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白的菌種資源庫(kù);2)設(shè)計(jì)和改造微生物,使其成為優(yōu)質(zhì)蛋白的細(xì)胞工廠(chǎng);3) 研創(chuàng)微生物高效生物轉(zhuǎn)化蛋白關(guān)鍵核心技術(shù);4)通過(guò)食品組分的重組加工,開(kāi)發(fā)合成蛋白產(chǎn)品。

    2.2 微生物合成乳蛋白

    近年來(lái),隨著食品合成生物學(xué)的快速發(fā)展,大量的細(xì)胞工廠(chǎng)被設(shè)計(jì)和構(gòu)建用于高效合成重要的食品成分和食品功能因子,包括乳鐵蛋白和母乳寡糖等[8-13]。乳蛋白是天然奶的主要成分,具有高營(yíng)養(yǎng),易吸收,增強(qiáng)免疫力,抗氧化等特性,是非常重要的蛋白資源。與傳統(tǒng)牛奶的生產(chǎn)工藝相比,應(yīng)用合成生物學(xué)生產(chǎn)乳蛋白具有以下優(yōu)勢(shì):1) 通過(guò)在生物反應(yīng)器中合成乳蛋白,避免傳統(tǒng)養(yǎng)殖生產(chǎn)方式造成的環(huán)境污染以及乳蛋白的抗生素和激素污染;2) 生產(chǎn)乳蛋白的微生物細(xì)胞工廠(chǎng)可使用廉價(jià)的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,原料有葡萄糖、大豆蛋白胨、玉米糖漿、尿素和無(wú)機(jī)鹽,成本相對(duì)較低[14];3)微生物發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)是周期短,發(fā)酵不受環(huán)境和天氣的影響。

    通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)已實(shí)現(xiàn)利用畢赤酵母(Pichia pastoris)、大腸桿菌(Escherichia coli)等微生物來(lái)合成乳蛋白。完美日公司(https://www.perfectdayfoods.com/learn-more/#background) 對(duì)乳蛋白表達(dá)及人造奶的生產(chǎn)進(jìn)行了研究,核心技術(shù)包括將牛奶蛋白的DNA 序列導(dǎo)入酵母細(xì)胞,通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)酪蛋白和乳清蛋白。進(jìn)一步將牛奶蛋白、水和其它成分進(jìn)行混合,生產(chǎn)乳制品替代品。雖然利用微生物發(fā)酵法合成乳蛋白在國(guó)內(nèi)起步相對(duì)較晚,但是近年來(lái)也已取得顯著進(jìn)展。在乳蛋白的表達(dá)方面,已實(shí)現(xiàn)利用大腸桿菌成功表達(dá)牛奶中7種主要蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、白蛋白)的異源表達(dá)且未被降解[15],為后續(xù)乳蛋白高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。利用畢赤酵母實(shí)現(xiàn)了人來(lái)源α-乳白蛋白分泌表達(dá),產(chǎn)量達(dá)到56.3 mg/L[16]。

    乳鐵蛋白是重要乳蛋白,具有抑制腸道致病菌等生理功能,應(yīng)用領(lǐng)域廣泛。牛乳鐵蛋白是一種低濃度的抗菌劑和免疫調(diào)節(jié)劑,在牛奶中含量很低[17-19]。建立細(xì)胞工廠(chǎng)進(jìn)行生物合成是實(shí)現(xiàn)乳鐵蛋白合成的有效策略。目前研究中,已實(shí)現(xiàn)紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)成功表達(dá)牛乳鐵蛋白C 葉和N 葉[20]。Isui 等[21]采用硫氧還蛋白(Trx)和乳鐵蛋白作為轉(zhuǎn)錄融合蛋白的共表達(dá)策略,在大腸桿菌中表達(dá)和純化重組牛乳鐵蛋白,蛋白的質(zhì)量濃度達(dá)到15.3 mg/L,純度為90.3%。此外,RbLf 對(duì)大腸桿菌BL21(DE3)和Mach1-T1 菌株的生長(zhǎng)抑制率分別為87.7%和79.8%[21]。通過(guò)對(duì)密碼子使用的優(yōu)化和強(qiáng)啟動(dòng)子AOX1 的篩選,牛乳鐵蛋白在畢赤酵母中得到高效表達(dá)。經(jīng)誘導(dǎo)、裂解、純化后分批發(fā)酵,最終RbLf 表達(dá)量為3.5 g/L。作為食品安全級(jí)菌株,枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是食品蛋白表達(dá)的理想宿主。研究人員通過(guò)啟動(dòng)子優(yōu)化和密碼子工程,在枯草桿菌168 中表達(dá)牛乳鐵蛋白[22]。經(jīng)硫酸銨沉淀、Ni-NTA 親和層析、Superdex 200 層析3 步純化,乳鐵蛋白的得率為16.5 mg/L,純度為93.6%。最終,研究人員驗(yàn)證了對(duì)大腸桿菌JM109、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的預(yù)期抗菌活性。

    2.3 微生物合成卵清蛋白

    雞蛋來(lái)源的蛋白是優(yōu)質(zhì)蛋白和重要的食品蛋白資源。其中,卵清蛋白是一種典型的球狀蛋白,占蛋清中總蛋白的54%,相對(duì)分子質(zhì)量為42.7 ku,等電點(diǎn)為4.5。卵清蛋白包含386 個(gè)氨基酸殘基,由單個(gè)二硫鍵和4 個(gè)游離巰基形成穩(wěn)定的直徑為3 nm 的球狀三維結(jié)構(gòu),由于卵清蛋白純化制備容易,且結(jié)構(gòu)表征學(xué)研究完善,因此作為模式蛋白被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象、生化性質(zhì)等研究。

    基于食品合成生物學(xué)構(gòu)建的細(xì)胞工廠(chǎng),為卵清蛋白制造提供了新途徑。在已開(kāi)展的研究中,多種微生物被用來(lái)合成卵清蛋白[23]。以大腸桿菌作為表達(dá)宿主細(xì)胞,通過(guò)基因工程實(shí)現(xiàn)了合成和分泌完整的雞卵清蛋白[24]。近期研究中,研究人員證明了卵清蛋白在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中合成和正確折疊[25-27]。雖然微生物合成的卵清蛋白沒(méi)有翻譯后修飾,但是它仍表現(xiàn)出與天然雞蛋卵清蛋白相似的抗原性和生物活性。此外,相關(guān)食品生物技術(shù)公司也致力于包括卵清蛋白等雞蛋來(lái)源蛋白的微生物生產(chǎn),在多種微生物(如釀酒酵母和枯草芽孢桿菌)中生產(chǎn)兩種或兩種以上蛋清蛋白的組合。

    3 未來(lái)微生物替代蛋白制造重點(diǎn)研究方向

    為了進(jìn)一步提升微生物蛋白制造效率,提升微生物蛋白的品質(zhì),實(shí)現(xiàn)微生物蛋白低成本和大規(guī)模生產(chǎn),微生物蛋白相關(guān)研究需從以下4 個(gè)方面進(jìn)一步加強(qiáng):

    1)高效構(gòu)建蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞工廠(chǎng) 基于元件挖掘、途徑調(diào)控、系統(tǒng)優(yōu)化等策略,建立芽孢桿菌、酵母、霉菌等蛋白生產(chǎn)的高效細(xì)胞工廠(chǎng)。

    2)提升細(xì)胞生產(chǎn)蛋白效率 解決目標(biāo)蛋白在不同細(xì)胞中高效合成與分泌問(wèn)題;精準(zhǔn)調(diào)控與優(yōu)化細(xì)胞代謝與細(xì)胞組分,提升蛋白產(chǎn)量;設(shè)計(jì)與重構(gòu)代謝模塊,提高底物碳氮利用效率和能量代謝效率,提升蛋白得率;開(kāi)展適應(yīng)性進(jìn)化與超高通量篩選相結(jié)合,獲得生長(zhǎng)速率提升的菌株,提升蛋白生產(chǎn)強(qiáng)度。

    3)蛋白質(zhì)資源的低成本和大規(guī)模生產(chǎn) 在解決表達(dá)系統(tǒng)的抗逆性與穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上,建立目標(biāo)蛋白高效、大規(guī)模、低成本生產(chǎn)的關(guān)鍵核心技術(shù)體系;篩選、挖掘抗逆元件,改善表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定性;通過(guò)功能蛋白高效表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行功能模塊間作用機(jī)制解析和挖掘;借助發(fā)酵工程優(yōu)勢(shì)平臺(tái),實(shí)現(xiàn)功能蛋白大規(guī)模、低成本生產(chǎn),最終實(shí)現(xiàn)特定目標(biāo)蛋白的大規(guī)模、低成本生產(chǎn),建立食品領(lǐng)域蛋白生產(chǎn)的完整技術(shù)體系。

    4)蛋白功能解析與特定蛋白生產(chǎn) 在確定未來(lái)食品中特定功能蛋白的組成和重大需求基礎(chǔ)上,解析其發(fā)揮特定功能的核心結(jié)構(gòu),創(chuàng)新功能蛋白理性設(shè)計(jì)體系,設(shè)計(jì)并建立具有特定新功能蛋白的普適性新方法和新技術(shù),獲得決定特定功能的核心結(jié)構(gòu)及分子折疊基礎(chǔ),揭示決定特定功能的構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)理;特定功能蛋白需求的理性定向設(shè)計(jì)以獲得性能提升的蛋白資源;解析和發(fā)現(xiàn)決定蛋白功能的新分子機(jī)制,開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)和強(qiáng)化蛋白特定功能的普適性方法,以獲得一系列特定功能得到顯著提升的目標(biāo)蛋白。

    4 結(jié)語(yǔ)

    綜上所述,傳統(tǒng)蛋白質(zhì)生產(chǎn)方式不僅無(wú)法滿(mǎn)足人類(lèi)未來(lái)生活需求,而且難以達(dá)到環(huán)境友好和資源節(jié)約,大規(guī)模、低成本、可持續(xù)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方式亟需創(chuàng)新和發(fā)展。采用微生物蛋白等替代動(dòng)物蛋白是食品和生物產(chǎn)業(yè)的必然方向。針對(duì)微生物替代蛋白生物制造,必須加強(qiáng)蛋白細(xì)胞工廠(chǎng)構(gòu)建、蛋白合成效率提升和蛋白功能調(diào)控等技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用,解決蛋白質(zhì)資源等重大問(wèn)題,搶占世界食品和生物的科技前沿和產(chǎn)業(yè)高地,造福人類(lèi)。

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