基于網絡藥理學探討尪痹方治療類風濕性關節(jié)炎的機制

摘要：基于網絡藥理學方法探討尪痹方治療類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的潛在機制。應用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺篩選出尪痹方的化學成分及作用靶點，GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索RA相關靶點，維恩圖獲取藥物與疾病交集靶點，利用STRING數(shù)據(jù)庫得到蛋白質-蛋白質相互作用（ protein-protein interaction，PPI）網絡信息，使用Cytoscape構建藥物-有效成分-靶點-疾病網絡與PPI網絡圖，通過DAVID數(shù)據(jù)庫對共同靶點進行基因本體（ gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（ Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。使用SYBYL-X 2.1.1軟件進行分子對接驗證。經過篩選得到32個有效成分及99個相關靶點，核心靶點為IL-6、TNF、AKT1、VEGFA、PTGS2等。GO功能富集分析主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控等生物過程，KEGG 通路富集分析主要涉及TNF信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、破骨細胞分化等信號通路。分子對接結果顯示，山柰酚、雷公藤內酯、柚皮素、川皮苷、刺芒柄花素等核心成分與IL-6、TNF、ATK1、PTGS2、VEGFA等的核心靶點蛋白之間具有良好的結合活性。本研究初步闡釋了尪痹方通過多成分、多靶點治療RA的潛在機制。

關鍵詞：網絡藥理學；分子對接；類風濕性關節(jié)炎；尪痹方

中圖分類號：R285文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2023）03-0038-08

Abstract∶Based on the research methods of network pharmacology， we discuss the potential mechanism of Wangbi formula in the treatment of rheumatoid arthritis （RA） in this article. The chemical components and action targets of the Wangbi formula were extracted using the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform. The RA-related targets were retrieved from the GeneCards database， the intersection targets of drugs and diseases were obtained using a Venn diagram， and the protein-protein interaction （PPI） network information was obtained using the STRING database. Moreover， the Cytoscape software was used to create the network diagram of drug-active ingredient-target-diseases and PPI， and the common targets were analyzed using Gene Ontology （GO） and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） from the DAVID database. Furthermore， the Sybyl-x 2.1.1 software was used for molecular docking validation. Screening yielded 32 active ingredients and 99 related targets， and the core targets were found to be IL-6， TNF， ATK1， PTGS2， VEGFA， etc. The GO function enrichment analysis mainly involved biological processes， such as positive regulation of RNA polymerase II promoter transcription， whereas KEGG pathway enrichment analysis mainly involved TNF， T-cell receptor， toll-like receptor， osteoclast differentiation， and other signaling pathways. The molecular docking results revealed that the core components， such as kaempferol， triptolide， naringenin， kaempferoside， and prickly shank anthocyanin， demonstrated good binding activity with the core targets， such as IL-6， TNF， ATK1， PTGS2， and VEGFA. This study provided a preliminary explanation of the multicomponent and multitarget mechanisms that may underlie the Wangbi formula′s potential mechanism of action in the treatment of RA.

Key words∶network pharmacology; molecular docking; rheumatoid arthritis; Wangbi formula

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫疾病[1]， 以慢性滑膜炎、血管翳、軟骨和骨破壞為典型臨床特征[2]。目前西醫(yī)治療RA多采用免疫抑制劑、糖皮質激素、非甾體抗炎類等藥物[3]，采用上述西藥治療均有一定的療效，但均有可能引起肝腎損傷、感染等毒副作用[4]。

RA屬中醫(yī)學“尪痹”“歷節(jié)病”“歷節(jié)風”“白虎歷節(jié)”“痹病”“痹證”范疇[5]，漢代張仲景在《金匱要略》中將歷節(jié)病另列一篇，描述癥狀為“諸肢節(jié)疼痛，身體尪羸，腳腫如脫等”。中醫(yī)在治療RA方面具有特有的優(yōu)勢。山東省名老中醫(yī)藥專家宋紹亮教授系認為邪毒內伏是RA產生的重要因素，在治療時應以尪痹方為底方，貫穿清熱利濕、消腫止痛之法，以清除余毒伏邪，控制病情[6]。尪痹方組成包括雷公藤、青風藤、白芍、甘草，臨床對于RA治療效果顯著。方中君藥雷公藤具有清熱解毒、祛濕除痹的作用，臣藥青風藤可祛風除濕、通利經絡、利尿消腫，雷公藤與青風藤相配伍具有祛風濕、止痹痛、解毒消腫之效，佐藥白芍與甘草相配伍，酸收甘潤，酸甘化陰，緩急止痛，用于RA可明顯緩解疼痛病癥。

尪痹方治療RA的機制目前尚不明確，網絡藥理學是現(xiàn)代藥理學的分支方向，能夠在整體思維的指導下探討方劑與疾病之間的聯(lián)系，為臨床及基礎研究提供理論支持。故本研究采用網絡藥理學的研究方法，對尪痹方治療RA的作用機制進行探索。

1資料與方法

1.1尪痹方中主要化學成分和相關靶點收集

以雷公藤、青風藤、白芍、甘草為關鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com）檢索出尪痹方中4味中藥所含的化學成分。以類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，口服生物利用度（oral biovailability，OB）≥30%的條件篩選出活性成分，通過活性成分名稱在TCMSP中檢索到相應的靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）查詢出靶標蛋白對應的基因名稱。

1.2疾病靶點的收集

在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）與OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org）中輸入“Rheumatoid Arthritis”進行檢索并得到RA的靶點信息。對靶點的相關分數(shù)（relevance score）取2倍中位數(shù)，將相關分數(shù)大于等于2倍中位數(shù)的靶點作為RA疾病靶點。

1.3疾病與藥物共同靶點的篩選

將尪痹方中篩選出的有效成分靶點及RA疾病靶點，通過Venny在線繪制平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn ）繪制維恩圖，并得到有效成分與疾病的交集靶點。

1.4藥物-有效成分-交集靶點-疾病網絡的構建

將藥物名稱、有效成分、有效成分與疾病交集靶點、疾病名稱等信息導入Cytoscape 3.7.2軟件中構建藥物-有效成分-交集靶點-疾病網絡。

1.5構建及分析蛋白質-蛋白質相互作用網絡

將篩選出的交集靶點基因導入STRING 11.5數(shù)據(jù)庫中（https：//www.string-db.org），分析靶基因間的蛋白質-蛋白質相互作用（ protein-protein interaction，PPI），將物種設置為“Homo sapiens”，將置信度設定為“＞0.4”，將結果導入Cytoscape 3.7.2軟件中計算節(jié)點度值，評價節(jié)點的重要程度。

1.6GO與KEGG分析

使用DAVID v6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov）對尪痹方與RA交集靶點進行基因本體（gene ontology， GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書 （ Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）通路分析，物種設置為“Homo sapiens”，GO分析選擇生物過程（biological process，BP），細胞組分（cellular component， CC）和分子功能（molecullar fuction，MF），通過Rstudio ggplot2軟件包根據(jù)-lg P值分別選取BP、CC、MF排名前10與KEGG排名前20的條目進行GO與KEGG分析的可視化處理。

1.7分子對接

通過PubChem（http：//www.pdb.org）平臺獲取尪痹方湯活性成分3D結構的SDF格式文件，使用化學結構繪圖軟件Chem3D Pro 14.0將SDF格式文件轉換為mol2格式文件。利用RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www1.rcsb.org）獲取關鍵靶點的蛋白質晶體結構的 PDB 格式文件。利用分子對接軟件SYBYL-X 2.1.1進行分子對接，對接分數(shù)越大，則代表活性成分與靶點結合情況越好。

2結果

2.1尪痹方活性成分及作用靶點

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫以DL≥0.18，OB≥30%為條件篩選后，共得到122個有效活性成分，其中白芍有效成分8個，甘草有效成分86個，青風藤有效成分6個，雷公藤有效成分28個，部分主要活性成分見表1，全表見OSID科學數(shù)據(jù)與內容附表1。

2.2疾病靶點

基于GeneCards數(shù)據(jù)庫，得到與RA相關的疾病靶點基因共4 792個。將相關性（relevance score）≥1.348的靶點做為RA的潛在靶點，共篩選出1 260個靶點。

2.3藥物與疾病靶點的交集

通過Venny在線制圖工具平臺繪制尪痹方有效成分靶點與RA疾病靶點的維恩圖，共得到99個交集靶點，見OSID科學數(shù)據(jù)與內容附圖1。

2.4藥物-有效成分-交集靶點靶點-疾病網絡

尪痹方的藥物-有效成分-交集靶點-疾病網絡圖中共包含225個節(jié)點，1 156條邊，圖中每個節(jié)點越大則代表連接度越高，其在疾病的治療中發(fā)揮的作用就越重要。連接度前5的核心成分為山柰酚、雷公藤內酯、柚皮素、川皮苷、刺芒柄花素，見OSID科學數(shù)據(jù)與內容附圖2。

2.5PPI網絡的建立

RA與尪痹方交集靶點的PPI網絡圖顯示，圖中共有99個靶點蛋白與1 568條邊，連接度前5的核心靶點蛋白為IL-6、TNF、ATK1、PTGS2、VEGFA，見OSID科學數(shù)據(jù)與內容附圖3。

2.6基因本體功能富集分析和京都基因與基因組百科全書通路分析結果

利用DAVID v6.8數(shù)據(jù)庫對RA與尪痹方交集的100個靶點進行GO與KEGG富集分析，并根據(jù)P lt;0.01、FDR（1 discovery rat）lt;0.05 作為條件進行篩選，篩選得到211個GO條目與85個KEGG條目。BP主要涉及藥物反應、DNA模板轉錄正調控、凋亡過程的負調控、一氧化氮生物合成過程的正調控等，CC主要涉及細胞外間隙、細胞外區(qū)域、質膜外側、核質等，MF主要涉及相同蛋白質結合、細胞因子活性、酶結合、轉錄調控區(qū)DNA結合等，見圖1。KEGG富集分析主要涉及腫瘤壞死因子信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、破骨細胞分化等信號通路，見圖2。

2.7分子對接結果

選取RA關鍵靶點蛋白IL-6、TNF、ATK1、PTGS2、VEGFA分別與尪痹方活性成分山柰酚、雷公藤內酯、柚皮素、川皮苷、刺芒柄花素使用SYBYL-X 2.1.1進行分子對接，得到對接分數(shù)，前10名見表2，全表見OSID科學數(shù)據(jù)與內容附表2，同時得到分子對接結果示意圖，部分示意圖見圖3，對接分數(shù)≥5代表活性成分與靶點具有較好的結合作用[7]，本次分子對接結果顯示活性最強的對接組合為PTGS2與川皮苷、ATK1與山柰酚、TNF與山柰酚、PTGS2與雷公藤內酯、PTGS2與柚皮素。

3討論

本研究中，通過表1、圖1、圖2可得出尪痹方共有122個作用于RA的有效活性成分以及對應的99個核心調控靶點。有效活性成分中的核心成分包括山柰酚、雷公藤內酯、柚皮素、川皮苷、刺芒柄花素等。其中山柰酚能夠通過抑制NF過抑和Akt/mTOR通路從而抑制滑膜成纖維細胞的異常增殖，減輕RA-FLS的炎癥反應[8]。同時Pan等[9]研究證明山柰酚可以阻斷MAPK通路激活，減輕膠原誘導性關節(jié)炎小鼠模型的關節(jié)炎嚴重程度。雷公藤內酯參與NF-κB途徑、環(huán)氧化酶-2、VEGFA等與炎癥相關的信號通路的調節(jié)[10]，并且參與調節(jié)RA中Th1和Th2細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞的活化。湯艷華等[11]研究證明，雷公藤內酯可通過抑制JAK/STAT信號通路激活緩解小鼠炎癥免疫反應。秦登優(yōu)等[12]研究證明雷公藤內酯可以通過CCAAT/增強子結合蛋白α（CCAAT/enhancerbinding proteinα，C/EBPα）抑制炎癥因子IL-12/IL-23的表達。因此雷公藤內酯具有較強的免疫與炎癥抑制活性，有利于促進患者循環(huán)免疫復合物的清除及阻斷致炎作用，加速炎癥的恢復，從而促進RA的治療。柚皮素作為一種口服類黃酮，已被證明可通過增加超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽的抗氧化系統(tǒng)來降低氧化應激[13]。Hajizadeh等[14]研究證明柚皮素可以通過調節(jié)和極化Th1、Th17對Th2和Treg的反應來降低干擾素-γ（Th1細胞指數(shù)細胞因子）和白細胞介素17 （Th17細胞指數(shù)細胞因子）的水平，從而可以有效地減輕大鼠的RA癥狀。MMP-3（基質金屬蛋白酶3），MMP-13（基質金屬蛋白酶13）是參與RA相關軟骨破壞的關鍵降解酶，而川皮苷可以減弱IL-21誘導的基質MMP-3與MMP-13表達的能力[15]。刺芒柄花素能夠減少單核巨噬細胞向破骨細胞的增殖與分化，從而降低破骨細胞相關蛋白基因表達水平以抑制破骨細胞的骨吸收[16]。

通過對交集基因進行PPI分析發(fā)現(xiàn)，IL-6、TNF、AKT1、VEGFA、PTGS2等為尪痹方治療RA的關鍵靶點蛋白，其中IL-6是促炎細胞因子家族的成員，IL-6的快速產生在抗感染的防御機制中起著重要作用，而其過度和持續(xù)合成失調會對慢性免疫介導的疾病產生病理影響[17-18]，因此IL-6是RA病程中重要的炎癥介質。TNF在免疫、炎癥和控制細胞分化、增殖和凋亡中起著關鍵作用[19]，且TNF-α在分化的某些階段可以抑制成骨細胞的活性，并刺激破骨細胞的增殖和分化，是免疫介導的骨性疾?。ò≧A）的重要致病因子[20]。AKT1可以影響軟骨細胞與滑膜成纖維細胞的增殖、凋亡和自噬[21-22]。VEGFA是一種血內皮生長與血管通透性因子，新血管生成是促進病理性滑膜增生和炎癥發(fā)展的早期和關鍵事件[23]，因此VEGFA與滑膜增生、炎性細胞浸潤和關節(jié)破壞密切相關。PTGS2（前列腺素內過氧化物合酶2）也稱為COX2，可以顯著促進RA患者滑膜組織中前列腺素的產生[24]，是治療RA的常用靶點之一。

從GO富集結果分析可知富集的生物學過程主要涉及藥物反應、DNA模板轉錄正調控、凋亡過程的負調控、一氧化氮生物合成過程的正調控等生物過程，并涉及相同蛋白質結合、細胞因子活性、酶結合、轉錄調節(jié)區(qū)DNA結合等分子功能。

研究顯示尪痹方治療靶點顯著富集于TNF信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、破骨細胞分化等通路。TNF信號通路可以通過NF-κB原活化蛋白激酶通路介導炎癥反應和細胞的增殖、分化和死亡[25]，因此TNF信號通路被認為是治療RA的重要通路[26]。T細胞與維持免疫穩(wěn)態(tài)密切相關，其介導的免疫反應被認為是RA發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素[27]，因此自身反應性T細胞積聚和CD4+ T輔助細胞穩(wěn)態(tài)失調為RA的重要特征。 RA是一種與慢性滑膜炎相關的慢性炎癥性自身免疫性疾病，Toll樣受體信號通路的內源性激活可啟動RA患者動脈壁和關節(jié)滑膜的永久炎癥循環(huán)[28-29]，誘導IL-19、IL-20和IL-24在外周血和滑膜關節(jié)中產生[30]?；ぱ装Y和不可逆的骨侵蝕是RA的特征，這兩者都突出了免疫系統(tǒng)和骨系統(tǒng)之間的巨大相互關系，滑膜和骨界面處破骨細胞介導的骨吸收是關節(jié)骨侵蝕產生的原因之一，而RA的炎癥反應會影響全身骨重塑，增加骨吸收，產生全身性骨質疏松癥[31]，因此破骨細胞分化通路對RA的病理過程有著重要影響。

我們將篩選出的尪痹方中的核心活性成分與RA的核心靶點蛋白分別進行分子對接，對接結果顯示PTGS2與川皮苷、ATK1與山柰酚、TNF與山柰酚、PTGS2與雷公藤內酯、PTGS2與柚皮素有著較強的結合能力，因此我們推測尪痹方具有通過多成分、多靶點治療RA的潛在機制。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學研究了尪痹方作用于RA的可能的分子機制，發(fā)現(xiàn)其可通過多靶點、多通路產生抑制炎癥產生、調節(jié)免疫反應、減少骨破壞的藥理作用，為臨床應用提供理論基礎。

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