基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討桂芍鎮(zhèn)癇片治療顳葉癲癇的作用機(jī)制

摘要：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究桂芍鎮(zhèn)癇片抗顳葉癲癇的作用機(jī)制。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)檢索桂芍鎮(zhèn)癇片的有效成分和作用靶點(diǎn)，使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)基因名轉(zhuǎn)化；通過OMIM，GeneCards和DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索顳葉癲癇相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，使用維恩圖獲得桂芍鎮(zhèn)癇片治療顳葉癲癇的交集靶點(diǎn)；運(yùn)用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建藥材-成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖，分析核心成分和關(guān)鍵分子靶點(diǎn)；使用基因本體富集和京都基因與基因組百科全書分析靶點(diǎn)的生物學(xué)過程和相關(guān)通路；使用前三個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的前兩個(gè)核心化合物進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。通過篩選，共獲得127個(gè)有效成分和46個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，其中，β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚等14個(gè)成分發(fā)揮核心作用，涉及CALM1、SCN5A、GSK3B等11個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。抗癲癇作用主要涉及膜電位調(diào)節(jié)、藥物響應(yīng)等生物學(xué)過程，突觸后膜和樹突等細(xì)胞組成，離子通道和鈣調(diào)蛋白等分子功能，神經(jīng)活性配體-受體相互作用、尼古丁成癮等相關(guān)通路。分子對(duì)接結(jié)果顯示CALM1、SCN5A、GSK3B三個(gè)靶點(diǎn)分別和對(duì)應(yīng)的核心化合物有較好的結(jié)合能力。桂芍鎮(zhèn)癇片通過減輕氧化損傷和保護(hù)神經(jīng)元，影響離子通道和受體、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和突觸結(jié)構(gòu)等環(huán)節(jié)，多成分、多靶標(biāo)、多通路地協(xié)同發(fā)揮抗癲癇作用。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接；桂芍鎮(zhèn)癇片；顳葉癲癇；作用機(jī)制

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-4026（2023）03-0027-11

Abstract∶To study the mechanism of Guishaozhenxian Tablet in the treatment of temporal lobe epilepsy （TLE） based on network pharmacology. Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform was used to retrieve the active ingredients and action targets of Guishaozhenxian Tablet， and the standard gene was transformed using the UniProt database. The OMIM， GeneCards， and DrugBank databases were searched for disease targets related to TLE， and the intersection targets of Guishaozhenxian Tablet in the treatment of TLE were obtained using a Venn diagram. The medicinal herb-component-target network diagram was constructed using the Cytoscape 3.8.2 software， and the core components and key molecular targets were analyzed.Gene Ontology enrichment and the Kyoto encyclopedia of genes and genomes were used to analyze the biological processes and related pathways. The first three key targets and their corresponding top two core compounds were validated using molecular docking. In total， 127 active ingredients and 46 related targets were identified， with 14 ingredients， including β-sitosterol， quercetin， and kaempferol， playing a central role in 11 key targets such as CALM1， SCN5A， and GSK3B. The anti-TLE effect was primarily due to biological processes （regulation of membrane potential， response to drug， etc.）， cell components （postsynaptic membrane， dendrites， etc.）， molecular functions （channel activity， calmodulin binding， etc.）， neuroactive ligand-receptor interaction， nicotine addiction， and other related pathways. Molecular docking results showed that CALM1， SCN5A， and GSK3B had good binding abilities with core compounds. Guishaozhenxian Tablet can reduce oxidative damage; protect neurons; affect ion channels and receptors， intracellular signal transduction， apoptosis， and synaptic structure; and exert anti-TLE effects via multi-components， multi-targets， and multi-pathway coordination.

Key words∶network pharmacology; molecular docking; Guishaozhenxian Tablet; temporal lobe epilepsy; mechanism of action

顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）是一種反復(fù)發(fā)作的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，為臨床最常見的難治性癲癇。中醫(yī)稱癲癇為“癇病”，其病位在腦，但與肝、脾、心、腎等多臟器密切相關(guān)。傳統(tǒng)中醫(yī)藥有較多方劑應(yīng)用于癲癇的預(yù)防治療，桂芍鎮(zhèn)癇片是《中國藥典》2020年版收載的成方制劑，以桂枝湯、小柴胡湯、芍藥甘草湯三方加減而成，研究顯示桂芍鎮(zhèn)癇片用于頑固性癲癇治療可取得較好療效[1]。桂芍鎮(zhèn)癇片與抗癲癇化學(xué)藥物聯(lián)合使用，具有增強(qiáng)療效、降低副作用的優(yōu)點(diǎn)，但其有效化學(xué)成分及作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)與系統(tǒng)藥理學(xué)，通過構(gòu)建藥材有效成分-靶點(diǎn)-疾病之間的綜合網(wǎng)絡(luò)來分析藥物作用機(jī)制，從尋找藥理作用的單一靶點(diǎn)轉(zhuǎn)向多靶點(diǎn)分析。與抗癲癇化學(xué)藥物相比，桂芍鎮(zhèn)癇片所含化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用具有多靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠?yàn)橹兴幀F(xiàn)代化研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和生物學(xué)理論基礎(chǔ)，是中藥作用機(jī)制研究的有效手段[2-3]。

本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)分析桂芍鎮(zhèn)癇片的有效化學(xué)成分、靶點(diǎn)與疾病之間的關(guān)系，闡釋桂芍鎮(zhèn)癇片治療顳葉癲癇的分子機(jī)制，并通過分子對(duì)接技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，為中成藥治療顳葉癲癇提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1有效化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)的篩選

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmsp-e.com/）檢索桂芍鎮(zhèn)癇片中桂枝、黨參、甘草、大棗、白芍、半夏、黃芩、柴胡和生姜等9味中藥的全部化學(xué)成分名稱、結(jié)構(gòu)及SMILE（simplified molecular input line entry specification）式，再以口服生物利用度（oral biovailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為指標(biāo)篩選有效成分及其作用靶點(diǎn)。

1.2有效成分作用靶點(diǎn)的收集

將上述篩選后獲得的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫 （https：//www.uniprot. org/），以物種“human”和“reviewed”為限制條件，將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的人源物種標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3顳葉癲癇疾病靶點(diǎn)的收集和確認(rèn)

使用OMIM（online mendelian inheritance in man）（https：//omim.org/）Gene map高級(jí)搜索模式，GeneCards（https：//www.genecards.org/）以“Relevance score”為指標(biāo)，取大于2倍中位數(shù)的靶點(diǎn)，和DrugBank（https：//go.drugbank. com/）三個(gè)數(shù)據(jù)庫，以“temporal lobe epilepsy”為關(guān)鍵詞對(duì)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫收集的靶點(diǎn)信息，刪除重復(fù)值后，獲得顳葉癲癇的疾病靶點(diǎn)集。

1.4桂芍鎮(zhèn)癇片-顳葉癲癇共有靶點(diǎn)的確認(rèn)

將桂芍鎮(zhèn)癇片有效成分的藥理作用靶點(diǎn)和顳葉癲癇的疾病治療靶點(diǎn)進(jìn)行匯集，繪制維恩圖，獲得二者的交集靶點(diǎn)。

1.5藥材-成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建桂芍鎮(zhèn)癇片和交集靶標(biāo)的藥材-成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，使用“network analysis”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)解析，以節(jié)點(diǎn)連接度為指標(biāo)，采用中位數(shù)截?cái)喾ǎY選關(guān)鍵藥材、化學(xué)成分和靶點(diǎn)。

1.6GO富集分析

將共有靶標(biāo)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org）進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析，選定物種為“Homo sapiens”。按默認(rèn)閾值Plt;0.01，最小計(jì)數(shù)為3，富集因子gt;1.5收集條目，根據(jù)條目隸屬關(guān)系相似性分組相應(yīng)集群。GO富集分析主要發(fā)掘化合物在生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）三個(gè)層面的功能。同時(shí)，利用Metascape數(shù)據(jù)庫中的MCODE（molecular complex detection）算法模塊，將蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)與通路和生物學(xué)過程富集數(shù)據(jù)相結(jié)合進(jìn)行聚類分析，以研究其共有靶點(diǎn)參與的主要生物學(xué)過程。

1.7KEGG富集分析

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：// david.ncifcrf.gov）進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway，KEGG）通路分析，富集桂芍鎮(zhèn)癇片藥理作用涉及的重要通路。

1.8分子對(duì)接驗(yàn)證

采用分子對(duì)接的方法對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到的桂芍鎮(zhèn)癇片前三個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的排名靠前的兩個(gè)核心化合物進(jìn)行驗(yàn)證。從 PubMed 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem. ncbi. nlm. nih. gov）下載獲取桂芍鎮(zhèn)癇片的活性小分子化合物的 2D 結(jié)構(gòu)，保存為*SDF文件；使用Chem3D軟件進(jìn)行3D格式轉(zhuǎn)化和能量最小化，保存為*mol2格式。通過 PDB 數(shù)據(jù)庫下載三個(gè)靶點(diǎn)的pdb格式的蛋白結(jié)構(gòu)，包括CALM1（PDB ID：1CTR）、SCN5A（PDB ID：6LQA）和GSK3B（PDB ID：6Y9S），采用Pymol軟件對(duì)受體蛋白進(jìn)行去水、去除原配體、加氫等預(yù)處理，再借助 AutoDockTools 1.5.6對(duì)蛋白質(zhì)受體定義原子類型、計(jì)算電荷、并輸出為*pdbqt格式文件。將蛋白自帶的配體視為活性結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)其位置設(shè)置grid box坐標(biāo)和大小，使用Autodock Vina 1.1.2進(jìn)行對(duì)接，根據(jù)結(jié)合能（combination energy）篩選出最佳構(gòu)象后用Pymol軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2結(jié)果

2.1有效化學(xué)成分及其靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索桂芍鎮(zhèn)癇片9味中藥材的全部化學(xué)成分，每味中藥材所含化合物成分?jǐn)?shù)如表1所示?？诜锢枚群皖愃幮允腔衔锍伤幍闹匾笜?biāo)，經(jīng)OB≥30%和DL≥0.18篩選后，9味中藥材的有效成分?jǐn)?shù)大幅減少，去重后得到桂芍鎮(zhèn)癇片有效成分206個(gè)（表1）。繼續(xù)使用TCMSP對(duì)有效成分的藥理作用靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，每種中藥材成分靶點(diǎn)數(shù)列于表1，排除無對(duì)應(yīng)人源物種標(biāo)準(zhǔn)基因名的靶點(diǎn)蛋白，刪除中藥材間的重復(fù)靶點(diǎn)，得到桂芍鎮(zhèn)癇片的有效成分的藥理作用靶點(diǎn)合計(jì)為285個(gè)。

2.2顳葉癲癇的藥物治療靶點(diǎn)

通過OMIM、GeneCards和DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索獲得的顳葉癲癇相關(guān)疾病靶點(diǎn)數(shù)量分別為592、445和55，合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索的靶點(diǎn)數(shù)，去重后得到974個(gè)與顳葉癲癇相關(guān)的疾病治療靶點(diǎn)。

2.3桂芍鎮(zhèn)癇片-顳葉癲癇的共有靶點(diǎn)

利用桂芍鎮(zhèn)癇片的285個(gè)藥物靶點(diǎn)與顳葉癲癇的974個(gè)疾病治療靶點(diǎn)繪制維恩圖，獲得46個(gè)共同靶點(diǎn)。再根據(jù)靶點(diǎn)確定桂芍鎮(zhèn)癇片各藥材中治療顳葉癲癇的有效成分，共獲得有效抗癲癇成分127個(gè)（表1）。

2.4藥材-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape 3.8.2軟件將桂芍鎮(zhèn)癇片的9種藥材、127個(gè)有效成分與46個(gè)共同靶點(diǎn)構(gòu)建藥材-成分-靶點(diǎn)的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1）。圖中節(jié)點(diǎn)表示藥材、有效成分、靶點(diǎn)基因等，邊數(shù)表示節(jié)點(diǎn)間的連接，線條代表兩者之間的相互連接作用，網(wǎng)絡(luò)圖中心為桂芍鎮(zhèn)癇片和顳葉癲癇。拓?fù)鋵W(xué)網(wǎng)絡(luò)圖中通常采用連接度指標(biāo)表示在網(wǎng)絡(luò)分析中節(jié)點(diǎn)的中心性，節(jié)點(diǎn)形狀的面積越大，代表該節(jié)點(diǎn)的連接度越大，則該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中就越重要。從圖中可以見到桂芍鎮(zhèn)癇片的一個(gè)有效成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，同時(shí)一個(gè)靶點(diǎn)也是多個(gè)成分的作用目標(biāo)，體現(xiàn)了桂芍鎮(zhèn)癇片通過多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮抗癲癇作用。

2.5核心化合物及其關(guān)鍵作用靶點(diǎn)

經(jīng)藥材-成分-靶點(diǎn)拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析，藥材、成分和靶點(diǎn)的連接度的中位數(shù)分別為16、8、12，因此，推斷桂芍鎮(zhèn)癇片包含甘草和黃芩兩種核心藥材，連接度分別為82和22，通過14個(gè)核心成分（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1）作用于11個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表2）。14個(gè)核心成分中以β-谷甾醇的連接度最高，節(jié)點(diǎn)緊密度為 0.463，節(jié)點(diǎn)介度為0.059。其次為槲皮素，其節(jié)點(diǎn)緊密度和節(jié)點(diǎn)介度分別為0.460和0.055，并且與核心藥材相對(duì)應(yīng)。11個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中CALM1、SCN5A和GSK3B的連接度高居前列，提示這3個(gè)靶點(diǎn)在桂芍鎮(zhèn)癇片治療顳葉癲癇中的重要性。

2.6共同靶點(diǎn)的GO富集分析

使用GO富集分析得到BP條目731條，CC條目88條，MF條目78條。根據(jù)P值從小到大順序，選取排名前列的條目（圖1）。BP條目分析顯示，桂芍鎮(zhèn)癇片抗癲癇作用主要與膜電位調(diào)節(jié)、藥物響應(yīng)、金屬離子響應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)的負(fù)向調(diào)節(jié)、神經(jīng)元死亡、細(xì)胞對(duì)含氮化合物的應(yīng)答、尼古丁響應(yīng)等生物學(xué)過程有關(guān)。CC條目分析顯示，桂芍鎮(zhèn)癇片抗癲癇作用主要與突觸后膜、膜筏、枝晶、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、突觸囊泡等細(xì)胞組分有關(guān)。MF條目分析顯示，桂芍鎮(zhèn)癇片抗癲癇作用主要與通道活性、蛋白質(zhì)特異性結(jié)合區(qū)域、蛋白酶結(jié)合、無機(jī)陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，氧化還原酶活性等分子功能有關(guān)。

Metascape的MCODE模塊利用STRING、BioGrid、OmniPath、InWeb_IM等數(shù)據(jù)庫，對(duì)46個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分析，獲得網(wǎng)絡(luò)中蛋白之間的高度連通區(qū)域的基因聚類，如圖 2所示，圖中每種顏色代表了一個(gè)MCODE聚類。將GO富集分析應(yīng)用于每個(gè)MCODE聚類，根據(jù)P值，對(duì)BP、CC和MF三個(gè)生物學(xué)進(jìn)程各篩選出三個(gè)評(píng)分最高的GO條目，見表2。

2.7共同靶點(diǎn)的KEGG通路分析

通過KEGG通路富集分析得到79條信號(hào)通路，根據(jù)P值從小到大，選取排名前20條目進(jìn)行可視化，如圖3所示。顏色越紅表示該條目富集越顯著，圓形越大表示該條目富集的基因越多。KEGG通路顯示桂芍鎮(zhèn)癇片抗癲癇作用可能與神經(jīng)活性配體-受體相互作用、阿爾茨海默病、尼古丁成癮、肌萎縮側(cè)索硬化癥、多巴胺能突觸、PI3K-Akt信號(hào)通路、GABA能突觸和嗎啡成癮等神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)通路有關(guān)，其中神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路富集的靶點(diǎn)數(shù)為11個(gè)，所占比例0.239 1，而尼古丁成癮通路最顯著，為1.18×10-7，這兩條富集通路的靶點(diǎn)信息見表3。

2.8分子對(duì)接驗(yàn)證

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析獲得的桂芍鎮(zhèn)癇片前三個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)CALM1、SCN5A和GSK3B與其對(duì)應(yīng)的2個(gè)核心化合物分子對(duì)接后，配體在靶標(biāo)中的位置和作用方式的可視化處理分別如圖 4～6所示，圖中黃色虛線為氫鍵，鍵長單位為。由圖可見，CALM1與β-谷甾醇（結(jié)合能為-7.5 kJ/mol，圖 4（a））和山柰酚（結(jié)合能為-6.6 kJ/mol，圖 4（b））、SCN5A與豆甾醇（結(jié)合能為-10.6 kJ/mol，圖 5（a））和槲皮素（結(jié)合能為-8.8 kJ/mol，圖5（b））以及GSK3B與異鼠李亭（結(jié)合能為-8.7 kJ/mol，圖 6（a））和漢黃芩素（結(jié)合能為-8.6 kJ/mol，圖6（b））都能夠自發(fā)穩(wěn)固地結(jié)合。Autodock Vina 軟件采用半經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)進(jìn)行受體蛋白-小分子配體評(píng)估兩者的結(jié)合能力，當(dāng)結(jié)合能≤-5. 0 kJ/mol 時(shí)，認(rèn)為配體可以和受體較好地結(jié)合，并且結(jié)合能越低，越有利于構(gòu)象的穩(wěn)定。

3討論與結(jié)論

桂芍鎮(zhèn)癇片是以我國名醫(yī)張仲景的柴胡桂枝湯方劑為基礎(chǔ)研制的片劑，方中由柴胡、桂枝、白芍、黨參、大棗、生姜、半夏、黃芩、甘草等9味藥材組成。據(jù)《中國藥典》2020年版記載，桂芍鎮(zhèn)癇片具有調(diào)和營衛(wèi)、清肝膽之功效，用于治療各種發(fā)作類型的癲癇[4]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的手段分析并探討桂芍鎮(zhèn)癇片的藥理作用機(jī)制，通過中藥數(shù)據(jù)庫和生物信息數(shù)據(jù)庫，篩選出桂芍鎮(zhèn)癇片127種有效成分和46個(gè)作用靶點(diǎn)，構(gòu)建了藥材-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，確定了藥材核心成分14個(gè)，關(guān)鍵靶點(diǎn)11個(gè)，并通過GO富集和KEGG通路分析了46個(gè)作用靶點(diǎn)，揭示了與桂芍鎮(zhèn)癇片抗顳葉癲癇作用相關(guān)的生物學(xué)過程和信號(hào)通路。

經(jīng)過藥材-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析得到桂芍鎮(zhèn)癇片抗顳葉癲癇核心成分14個(gè)，文獻(xiàn)檢索顯示這些核心成分主要通過減輕氧化損傷、抑制炎癥、影響腦內(nèi)遞質(zhì)代謝和調(diào)節(jié)離子通道發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和抗癲癇作用。其中，槲皮素、山柰酚、異鼠李亭、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、黃芩素和漢黃芩素均屬黃酮類化合物，不僅具有抗氧化活性，還可與GABAA受體結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]。研究顯示黃芩素和漢黃芩素可通過調(diào)節(jié)鉀通道，抑制凋亡相關(guān)基因以保護(hù)神經(jīng)元，減少癲癇發(fā)作[6-7]。此外，柚皮素、木犀草素、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇、豆甾醇和右旋光千金藤堿除顯示良好的抗氧化活性之外，也具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。研究表明，柚皮素和木犀草素不僅可以對(duì)抗神經(jīng)元氧化損傷，還能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生，減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，減少癲癇發(fā)作[8-10]。β-胡蘿卜素是有效的自由基清除劑和脂質(zhì)抗氧化劑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的抗癲癇活性[11]。β-谷甾醇可增加小鼠腦內(nèi)去甲腎上腺素、5-羥色胺及其代謝產(chǎn)物的水平，顯示出對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用[12-13]。豆甾醇則通過影響即早基因表達(dá)，增加抗氧化酶活性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14-15]。右旋光千金藤堿可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減輕神經(jīng)炎癥，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[16]。荷葉堿是Cl-、Ca2+、K+等多種離子通道調(diào)節(jié)劑，通過影響5-羥色胺和多巴胺受體功能而改善癲癇發(fā)作[17]。值得注意的是，β-谷甾醇和槲皮素作為桂芍鎮(zhèn)癇片核心成分，與其他節(jié)點(diǎn)的連接度分別高達(dá)79和66，并且對(duì)應(yīng)于黃芩和甘草兩味核心藥材，表明其在抗顳葉癲癇作用中扮演主要角色，也提示減輕氧化損傷和影響腦內(nèi)兒茶酚胺類遞質(zhì)代謝可能作為桂芍鎮(zhèn)癇片抗癲癇作用的重要機(jī)制。

藥材-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示桂芍鎮(zhèn)癇片關(guān)鍵靶點(diǎn)11個(gè)，這些靶點(diǎn)分為離子通道類、受體類、細(xì)胞凋亡因子類和信號(hào)調(diào)節(jié)類。離子通道類靶點(diǎn)包括SCN5A、KCNH2和SLC6A3，受體類靶點(diǎn)包括GABRA1、CHRNA7、OPRM1和GABRA3，細(xì)胞凋亡因子類靶點(diǎn)包括BCL2和CASP3，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類靶點(diǎn)包括CALM1和GSK-3β。11個(gè)靶點(diǎn)中受體類占比0.36，包括γ氨基丁酸受體（GABAR A1和A3）、α7煙堿型乙酰膽堿受體（CHRNA7）和阿片受體（OPRM1），說明與興奮性調(diào)節(jié)相關(guān)的腦內(nèi)受體是桂芍鎮(zhèn)癇片抗癲癇的主要靶點(diǎn)。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)也說明了這些關(guān)鍵靶點(diǎn)與有效成分有較好的結(jié)合能力。本課題組前期試驗(yàn)也證實(shí)，使用α7煙堿型乙酰膽堿受體激動(dòng)劑治療可以減少顳葉癲癇大鼠的發(fā)作次數(shù)，減輕海馬損傷[18]。此外，電壓依賴性鈉、鉀離子通道和細(xì)胞凋亡因子也是桂芍鎮(zhèn)癇片抗癲癇的重要靶點(diǎn)，可通過抑制離子通道所致的異常興奮，減少凋亡發(fā)揮抗顳葉癲癇作用。值得關(guān)注的是，信號(hào)調(diào)節(jié)類靶點(diǎn)CALM1和GSK-3β的連接度分別為105和63，體現(xiàn)了這兩個(gè)靶點(diǎn)的重要性。CALM1和GSK-3β作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)調(diào)節(jié)分子，與突觸重塑、長時(shí)程增強(qiáng)和神經(jīng)元存活相關(guān)，參與癲癇的發(fā)生發(fā)展過程[19-20]，提示細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)可能是桂芍鎮(zhèn)癇片與相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合后發(fā)揮抗顳葉癲癇作用的關(guān)鍵機(jī)制。

GO富集分析顯示，桂芍鎮(zhèn)癇片主要通過調(diào)節(jié)膜電位和對(duì)藥物的響應(yīng)等生物學(xué)過程，影響突觸結(jié)構(gòu)等細(xì)胞成分，干預(yù)離子通道活性等分子功能發(fā)揮抗顳葉癲癇作用。而由MCODE模塊進(jìn)一步推斷了其與突觸后膜電位的調(diào)節(jié)、樹突膜、GABAA復(fù)合體、GABA門控氯離子通道活性、細(xì)胞外配體門控離子通道活性相關(guān)。這一結(jié)果也與藥材-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析得到的桂芍鎮(zhèn)癇片關(guān)鍵作用靶點(diǎn)一致，體現(xiàn)了離子通道類靶點(diǎn)（γ氨基丁酸受體、α7煙堿型乙酰膽堿受體）和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)（與突觸重塑和癲癇耐藥性有關(guān)）在桂芍鎮(zhèn)癇片抗顳葉癲癇作用中的重要性。KEGG通路分析顯示桂芍鎮(zhèn)癇片抗顳葉癲癇作用主要與神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、尼古丁成癮通路有關(guān)，這兩條通路都與γ氨基丁酸受體、α7煙堿型乙酰膽堿受體、阿片受體和腎上腺素受體等靶點(diǎn)聯(lián)系緊密，進(jìn)一步呼應(yīng)了藥材-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，說明受體類靶點(diǎn)及其相關(guān)的信號(hào)通路參與桂芍鎮(zhèn)癇片的抗顳葉癲癇作用，而尼古丁成癮通路值得深入研究關(guān)注。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探討了桂芍鎮(zhèn)癇片抗顳葉癲癇作用機(jī)制。通過對(duì)核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的分析，推測其主要作用于腦內(nèi)受體和離子通道，調(diào)節(jié)膜電位，影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和突觸結(jié)構(gòu)等環(huán)節(jié)，多成分、多靶標(biāo)、多通路協(xié)同發(fā)揮抗顳葉癲癇作用。本研究還顯示，除了減輕氧化損傷和抑制炎癥，桂芍鎮(zhèn)癇片的核心成分也可能通過影響腦內(nèi)遞質(zhì)代謝和離子通道發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和抗顳葉癲癇作用。雖然以上機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證，但本研究初步揭示了桂芍鎮(zhèn)癇片的核心物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在的生物學(xué)靶點(diǎn)，為開展深入研究提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］陳俊寧，戴志仙，樂衛(wèi)東，等. 桂芍鎮(zhèn)癇片治療癲癇的臨床觀察[J]. 中成藥研究， 1982（12）： 22-23.

[2]段賢春，黃石，彭代銀，等. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)， 2020， 36（3）： 303-308. DOI：10.3969/j.issn.1001-1978.2020.03.003.

[3]趙澤豐，陳旭飛，解景，等. 遠(yuǎn)志-天麻藥對(duì)治療癲癇的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2019， 25（14）： 207-214. DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20191306.

[4]國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典2020年版一部[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020.

[5]張雪意，郭珍立，陳延，等. 中藥單體治療癲癇研究進(jìn)展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2020， 22（2）： 129-132. DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2020.02.035.

[6]GUO X Y， WANG J Y， WANG N N， et al. Wogonin preventive impact on hippocampal neurodegeneration， inflammation and cognitive defects in temporal lobe epilepsy[J]. Saudi Journal of Biological Sciences， 2020， 27（8）： 2149-2156. DOI：10.1016/j.sjbs.2020.05.030.

[7]秦少坤，平鑫，蘆曄，等. 黃芩苷抗神經(jīng)元損傷作用機(jī)制的研究[J]. 中成藥， 2020， 42（9）： 2412-2416.DOI：10.3969/j.issn.1001-1528.2020.09.031.

[8]SHAKEEL S，REHMAN MU，TABASSUM N， et al. Effect of naringenin （a naturally occurring flavanone） against pilocarpine-induced status epilepticus and oxidative stress in mice[J]. Pharmacognosy Magazine， 2017， 13（S1）： 154-160. DOI：10.4103/0973-1296.203977.

[9]PARK J， JEONG K H， SHIN W H， et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy[J]. Neuroreport， 2016， 27（15）： 1182-1189. DOI：10.1097/WNR.0000000000000678.

[10]TAMBE R， PATIL A， JAIN P， et al. Assessment of luteolin isolated from Eclipta alba leaves in animal models of epilepsy[J]. Pharmaceutical Biology， 2017， 55（1）： 264-268. DOI：10.1080/13880209.2016.1260597.

[11]SAYYAH M， YOUSEFI-POUR M， NARENJKAR J. Anti-epileptogenic effect of beta-carotene and vitamin A in pentylenetetrazole-kindling model of epilepsy in mice[J]. Epilepsy Research， 2005， 63（1）： 11-16. DOI：10.1016/j.eplepsyres.2004.10.001.

[12]董雪，劉小廣，楊美麗，等. β-谷甾醇對(duì)原代大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力的毒性[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)， 2013， 36（4）： 1-2. DOI：10.3969/j.issn.1008-0104.2013.04.001.

[13]陳元堃，曾奧，羅振輝，等. β-谷甾醇藥理作用研究進(jìn)展[J]. 廣東藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2021， 37（1）： 148-153. DOI：10.16809/j/cnki.2096-3653.2020040801.

[14]HAQUE M N， MOON I S. Stigmasterol upregulates immediate early genes and promotes neuronal cytoarchitecture in primary hippocampal neurons as revealed by transcriptome analysis[J]. Phytomedicine， 2018， 46： 164-175. DOI：10.1016/j.phymed.2018.04.012.

[15]ADEBIYI O E， OLOPADE J O， OLAYEMI F O. Sodium metavanadate induced cognitive decline， behavioral impairments， oxidative stress and down regulation of myelin basic protein in mice Hippocampus： Ameliorative roles of β-spinasterol， and stigmasterol[J]. Brain and Behavior， 2018， 8（7）： e01014. DOI：10.1002/brb3.1014.

[16]HAO T Y， YANG Y Q， LI N， et al. Inflammatory mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury with treatment of stepharine in rats[J]. Phytomedicine， 2020， 79： 153353. DOI：10.1016/j.phymed.2020.153353.

[17]俞月， 路娟， 呂欣鍇， 等. 荷葉堿藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國現(xiàn)代中藥， 2021， 23（1）： 164-170. DOI：10.13313/j.issn.1673-4890.20191031002.

[18]ZHENG J J， ZHANG T Y， LIU H T， et al. Cytisine exerts an anti-epileptic effect via α7nAChRs in a rat model of temporal lobe epilepsy[J]. Frontiers in Pharmacology， 2021， 12： 706225. DOI：10.3389/fphar.2021.706225.

[19]馬婧，劉曉莉，喬德才. 鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ在突觸可塑性和神經(jīng)精神疾病中的作用[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)， 2018， 34（11）： 1485-1488. DOI：10.3969/j.issn.1001-1978.2018.11.002

[20]ENGEL T， GMEZ-SINTES R， ALVES M， et al. Bi-directional genetic modulation of GSK-3β exacerbates hippocampal neuropathology in experimental status epilepticus[J]. Cell Death amp; Disease， 2018， 9： 969. DOI：10.1038/s41419-018-0963-5.